Штамм бактерий рlаnовisроrа rosea атсс 53773 - продуцент фактора а антибиотика ge 2270, способ получения фактора а антибиотика ge 2270, фактор а антибиотика ge 2270
Патент 1838414
Авторы
Классы МПК
Штамм бактерий рlаnовisроrа rosea атсс 53773 - продуцент фактора а антибиотика ge 2270, способ получения фактора а антибиотика ge 2270, фактор а антибиотика ge 2270
Иллюстрации
Реферат
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
P ЕСПУ БЛИК (51)5 С 12 P 1/00
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ ф табл. (21) 4614953/13 (22) 08.09,89 (46)30.08,93, Бюл. N 32 (31) 8821160.2 (32) 09.09.88 (33) GB е (71) Группо Лепетит С.п,А. (IT) (72) Энрико Селва, Грациэла Беретта, Николетта Монтанини (IT), Бет П. Голдстейн (US) и Маурицио Денаро (IT) (5 ) Аналогов в патентной и научно-технической литературе не выявлено. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PLANOBISP0RA
R0S EA АТСС 53773-П РОДУЦЕ НТ ФАКТОРА
А АНТИБИОТИКА GE 2270, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА А АНТИБИОТИКА GE
2270, ФАКТОР А АНТИБИОТИКА GE 2270
Изобретение касается способа получения антибиотика GE 2270, который включает культивирование Planobispora rosea АТСС
53773, продуцирующего антибиотик GE
2270, и выделение антибиотика данного изобретения из мицелия и/или ферментацианных бульонов, самого фактора А антибиотика GE 2270 и штамма-продуцента
Pianobispora rosea АТСС 53773, выделенного Из образцов и депонированного 14 июня
1988 American Type Culture Collection (АТСС), 12301 Parklaun Drive, Rockville, MD
20852, Maryland, U.S.À.
Штамм зарегистрирован под номером
АТСС 53773
Получение антибиотика GE 2270 осуществляют культивированием Planoblspora штамма, способного продуцировать его, т.е.
Planobispora rosea АТСС 53773 в аэробных услОвиях в водной пи1ательной среде, со„„. Ж „„1838414 АЗ (57, Использование: микробиология, фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: новый штамм бактерий
Planobispora rosea — депонирован в Американской коллекции культур под номером
АТСС 53773, Штамм используют для получения фактора А антибиотика 6Е 2270.
Штамм бактерий Planoblspora rosea АТСС
53773 культивируют в глубинных условиях при аэрации на питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и минеральные соли до оптимального накопления антибиотика, Целевой продукт выдеЛяют- экстракцией мицелия и фильтрата культуральной жидкости. 3 с,п. ф-лы, 4 фиг., 9 держащей способные к ассимиляции источники углерода, азота и неорганических солей. Предпочтительными источниками углерода являются глюкоза, манноза, галактоза, крахмал, мука зерновых. Предпочтительными источниками азота являются аммоний, нитраты, мука" соевых бобов, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, триптон, аминокислоты. Среди неорганических солей, которые могут быть введены в питательную среду, имеются обычные растворимые соли, способные производить ионы натрия, калия, железа, цинка, кобальта, магния, кальция, аммония, хлора, карбоната, сульфата, фосфата, нитрата.
Обычно штамм, продуцирующий энтибиотик, предварительно культивируют в вибрирующем сосуде, выращенную культуру инокулируют в контейнерные ферментаторы для получения значительных
1838414 количеств противомикробных веществ. Среда, используемая для предварительного культивирования, может быть той же самой, что и для дальнейших ферментаций, но могут быть также применены другие среды.
Штамм, продуцирующий антибиотик GE
2270, может быть выращен при температурах между 20 и 40 С, предпочтительно между 24 и 35 С.
Во время ферментации получение антибиотика контролируют с помощью испытательного бульона или образцов экстракта мицелия для противомикробной активности, например, путем биологических проб или Т1 С или HPLC методик.
Организмы, чувствительные к антибиотику GE 2270, такие как Bacillus subtllis u
S.aureus используют в качестве тестовых организмов. Биологическую пробу осуществляют с помощью метода диффузии в агаре на агаровых пластинах. Максимум получения противомикробной активности имеет место между вторым и пятым днем фермента ции.
Антибиотик G E 2270 полу .ают культивированием штамма Planoblspora rosea АТСС
53773, продуцирующего антибиотик GE
2270, и находят, в основном, в мицелии.
Термин "антибиотлк GE 2270" относится к комплексу антибиотика 6Е 2270, который выделяют в конце процесса ферментации (см. пример 2), также как и к антибиотику ОЕ 2270 фактор А, который является его главным компонентом, Антибиотик активен в качестве агента, стимулирующего рост домашних животных и птиц.
Морфологические характеристики
Planobispora rosea АТСС 53773.
Planobispora rosea ЯТСС 53773 растет хорошо на большинстве стандартных сред.
Вегетативный мицелий образует длинные и нерегулярно разветвленные филаменты
{0,5 — 1,0 мкм), пронизывающие агар и образующие компактное новообразование на его поверхности, Мицелий остается нефрагментированным, независимо от того, происходит ли рост в жидкой иди твердой среде.
его цвет колеблется от светлокораллового до красно-кораллового на большинстве испытуемых сред, Воздушный мицелий образован из длинных Волнистых и тонких гифов с небольшими бокогвыми разветвлениями и растет на воздухе, в основном, параллельно поверхности агара. Воздушный мицелий, когда он присутствует, имеет бело-красный цвет. Сорангии образуются по одиночке или группами вдоль гифов воздушного мицелия и имеют длину около 6,6-8,0 микрон и ширину 1,0 — 1,2 микрона. Они присоединяются к гифу коротким спорангиеносцем (1,0 — 2,0 мкм в длину). Продольная пара веретенообразных прямых спор {от 3,03,5х1,0 до 1.2 мкм) образуется в каждом спорангии, В спорангиях споры отделены поперечной-перегородкой, После отделения от оболочки спорангии споры становятся подвижными посредством perl trichous flagella.
Культуральные характеристики
"0 Planobispora rosea АТСС 53733.
Для изучения культуральных характеристик Pianobispora rosea АТСС 53733 культивируют на различных стандартных средах, При необходимости делают цветовое
"5 определение.
Культуральные и физиологические характеристики и использование источников углерода представлены в таблицах 1, ll, ill.
В табл. 1 даны значения, полученные после двух недель инкубирования при 28 С, Для этого теста применяют среду N 8 и результаты оценивают после двухнедельного инкубирования при 28 — 30 С.
Чувствительность к температуре.
25 Оптимум температуры роста колеблется от 28 С до 37 С, Не наблюдают роста при 15 С и 50 С, умеренный рост при 20 С.
Хемотаксономические характеристики.
30 Ан ли л чки кл тк
Анализ аминокислот, присутствующих в, оболочке клетки, выполняют по методу, Описанному Becker и др, (нБыстрая дифференциация между nocardia u Streptomyces путем бумажной хроматографии гидролизованной полной клетки", Spll. Microbioi 12, 421-423, 1964), Анализ гидрализованной полной клетки показывает присутствие мезо-диаминопимелиновой кислоты., При анализе препарата чистой оболочки клетки глицина не обнаружено.
Картина лолного клеточного сахара.
45 Анализ содержания сахара а гидролизованной полной клетке проводят по методу
Lechevalier M.P. (иИдентификация клинически важных аэробных актиномицетов"
I.Lab.Ciin.Med. 71, 934-944, 1968), исполь50 зуя целлюлозные листы для тонкослойной хроматографии, как описано Staneck ЯЛ, and G.D. Roberts (нупрощенный подход к идентификации аэробных актиномицетов путем тонкослойной хроматографии", Appk
MicrobioL 28, 226-231, 1974) со содержащей системой растворителей; этилацетат-пиридин-вода (100;35:25 об,/об.).
Полученные результаты показывают присутствие мадурозы (Э-0-метил-D-галактоза) и отсутствие арабинозы и галактозы.
20
50
Идентификация штамма Р!апоЫврога гозеа ATCC 53733, Этот штамм относят к роду Planoblspora
rosea и классифицируют как Planoblspora
rostra вследствие следующих морфологических и химических характеристик: а) Присутствие мезо- диаминопимелиновой кислоты и отсутствие глицина в оболочке клетки {оболочка клетки хемотип!!!)
0) присутствие мадурозы в гидролизате полной клетки (картина В полного клеточного сахара) с) образование на воздушном мицелии длинной и цилиндрйческой сйорангии, содержащей пару подвижных спор
d) красный цвет вегетативного мицелия
Морфологические характеристики
Planobispora rosea АТСС 53733, сообщенные выше, не сущесtîeI о отличаются ot морфопогических характеристик штамма
Planobispora rosea, который описаi1 I.Å, ThIlman с сотр. в "Актиномецетали" Tile Lena
Intern, 8ymp. on Tascon., September, 1968, ed, А. Prauser, Lena, Он депонираван American Type Culture
Coliection и зарегистрирова» под номером
23866, Для этого штамсла не описано антибактериальной продукции, Как упомянуто выше,. антибиотик 6Е
2270 находят обычно в мицелии продуцирующего штамма, хотя незначительное количество вещества находят также в ферме»тационном бульоне.
Предпочтительная методика для выделения антимикробного вещества изобретения из мицелия включает зкстрагирование фильтрованного или це»трифугированного мицелия орга»ическим растворителем, смешивающимся с водой, концентрирование экстрактов и выделение сырого антимикробного вещества осаждением, необязательно добавлением осаждающего растворителя, экстракцией водного остатка органическим растворителем, несмешивающимся с водой, ипи адсорбционной хроматографией с последующим элюирова»ием желаемого продукта из адсорбционной матр + цы .
Предпочтительная методика для выделения антимикробного вещества данного изобретения из ферме»тационного бульона
„включает экстракцию органическим растворителем, несмешивающимся с водой, с последующим осаждением из концентрированных экстрактов возможно добавле ием осаждающего агента или дальнейшей экстракцией водного остатка их с органическим растворителем, »есмешивающимся с водой. Напротив. ферментационный бульон может контактировать с адсорбционной матрицей с последующим зпюированием полярной элюирующей смесью. Это хроматографическая методика может также приняться к концентрированному экстракту, полученному из ферментационного бульона вместо самого бульона.
Примерами органических растворителей, смешивающихся с водой, которые могут быть использованы при экстракции антимикробного вещества изобретения из мицелиевой массы, являются: низшие алканолы, например (Ct-Сз) алканолы, такие как метанол, этанол и пропанол, фенил (С1-Сз) апканолы, такие как бензиновый спирт, ниэшие кетоны, например, {Сз-Сt) кетоны, такие как ацетон и этилметилметон, циклические эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран, гликоли и их продукты части;»ой эгер;;фикации, так,зк этиленгликоль, пропиленгликоль и этиле»гликоль монометиловый эфир, низшие амиды, такие как диметилформамид и диэтилформамид.
Примерами органичсских растворителей, несмешивающихся с водой, которые могут быть использованы в экстракции а»тимикробного вещества изобретен IR из ферментационного бульона являются обычILIe углеводородные растворители, которые могут быть линей»ыми, разветвленными или циклическими, такими как гексан или циклогекса», галогенированные углеводороды, такие как хлороформ, четыреххпористый углерод, дихлорзтан, фторбромэтан, дибромэтан, трихлопропан, хлортрифтороктан, и тому подобное; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол, ксилол, и тому подобное; эфиры из по крайней мере четырех атомов углерода, такие как этилацетат, пропилацетат, зтилбутират и тому подобное; алканолы из, по крайней мере; четырех атомов углерода, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими, такие как бутанол, 1пентанол, 2-пентанол, 3-пе . таноп, 1-гексанол, 2-гексанол, З-гексанол, З,З-диметил-1-бутанол, 4-метил-1-пентаноп, З-метил-1-пентанол, 2,2-диметил-3пентанол, 2,4-диметил-3-пе»танол, 4,4-диметип-2-пентанол, 5-метил-2-гексанол, 1-гептанол, .2-гептанол, 5-метил-1гексанол, 2-атил-1-гексанол, 2-метил-3-гексанол, 1-октанол, 2-октанол, циклопентанол, 2-циклопентилэтанол, 3циклопентил-1-пропанол, циклогексанол, циклогептанол, циклооктанол, 2,3-диметилциклогексанол, 4-этил-циклогексанол, циклооктилметанол, 6-метил-5-гепте»-2-ол, 1-нонанол, 2-»онанол, 1-деканол. 2-деканол
«3-деканол, линейные и разветвленные ал1838414
30
40
55
ЙИКТЯЯИЯТИКИЖЕ: таю 6 кильные эфиры и смеси их, такие как петролейный эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, бутилЬвый эфир и т.д.; и смеси или функциональные производные их.
Как известно в данной области техники. фазовое разделение может быть улучшено путем высаливания.
Когда применяют зкстракцию, выделяют водную фазу, содержащую значительное количество органического растворителя, при этом может быть удобно аэеотропно дистиллировать воду иэ нее, Обычно это требует добавления растворителя, способного образовывать минимальные аэеотропные смеси с водой с последующим добавлением осаждающего агента, чтобы осадить желаемый продукт, если необходимо, Характерными образцами органических растворителей, способных образовывать минимальные азеотропные смеси, являются н-бутанол, бензол, толуол, бутиловый эфир, четыреххлористый углерод, хлороформ, циклогексан, 2,5-диметил-фуран, гексан и м-ксилол, предпочтительным растворителем является н-бутанол.
Примерами осаждающих агентов являются петролейный эфир, низшие алкильные эфиры, такие как этиловый эфир, пропиловый эфир и бутиловый эфир, и низшие алкильные кетоны, такие как ацетон, Примерами хроматографических систем, которые могут быть обычно использованы при выделении антимикробного вещества изобретения, являются полистирол или смешанные смолы полистирол-дивинилбензол, такие как Amberlite ХАД 2 или
ХАД4(Rohm and Haas), S 112(Dow Chemistry
Со.) и Dlalon HP 20 (Mltsublshi); акриловые смолы, такие как ХАД7 или ХАД 8(Rohm and
Нааз); полиамиды, такие как поликапролактамы, найлоны и сшитые поливинилпирролидоны, обычно имеющие объем пор (мл/г) в пределах между 1 и 5, площадь поверхности (м /r) в пределах между 1 и 100, кажущаяся плотность (г/мл) в пределах между 0,15 и 0,50, средний диаметр пор (ангстремы) в пределах между 100 и ЗООЦ и распределение частиц по размеру, где по крайней мере 40 процентов частиц по размеру меньше, чем
300 микрометров, такие как Полиамид-СС 6, Полиамид - SC 6, Полиамид-СС 6,6. Полиамид-СС 6АС и Полиамид-SC 6АС (Macherey
l4agel and Со., West Germany), поливинилпирролидоновая смола PVP-CL (Aldrich
Chemic. GmbH and Со., KS - West Germany), полиамидная смола PA 400) ММ/ос!а AG, West Germany); и углерод.
В случае полистирольной или акриловой смолы предпочтительным элюентом является смесь полярных растворителей, растворителей смешивающихся с водой, таких как сообщено выше; в случае полиамидной смолы элюентом является предпочтительно водная смесь смешивающегося с водой растворителя, такого как растворитель, упомянутый выше, в то время как для углерода предпочтительным элюентом является низший кетон, такой как ацетон или низший спирт, такой как метанол, Дальнейшая очистка неочищенного образца антибиотика GF 2270 может быть выполнена по любой их известных методик, но предпочтительно проводить посредством хроматографических методик.
Также удобно может быть применена так называемая стерическая эксклюзивная хроматографическая методика с хорошими результатами по очистке, В частности, сшитые декстраны с контролируемым размером пор, в которых большинство гидроксильных групп алкилировано, например, Сефадекс
1Н20-(Pharmacia Fine Спеписа13, Ab), обычно применяют в этой технике.
Как обычно в этой области техники, получение, также как стадии выделения и очистки, могут контролироваться целым рядом аналитических методик, включая биологические пробы, такие как пробы на бумажном диске или агаровая диффузия; на чувствительные микроорганизмы или методикитонкослойной хроматографии (TLC) или HPCl, которые могут включать ультрафильтрацию или стадию микробного задержания.
Предпочтительная методика HPLC представлена обращенно-фазовой HPLC, с использованием колонки с пористым и сферическими частицами силинизированного силикагеля, например, силикагель, функционализированный С-18 алкильными группами, имеющий одинаковый диаметр (такой как 5 микрометров Uitrasphere ODS Aitex
Beckman Со.) пред-колонка которой является силикагелем, функционализированным
С-18 алкильными группами (такой как RP 18
Browniee Labs) и элюент которой является линейной градиентной смесью полярного смешивающегося с водой растворителя, |аким, как один из растворителей, описанных выше, в водном буферном растворе. Предпочтительно этот раствор доводят до рИ 5—
7. Наиболее предпочтительный злюент представляет собой линейный градиент от
45 до 707 элюента А в элюенте В, в котором элюент В является смесью ацетонитрилводный буфер, рН 5-7,10;90 и элюент A является смесью ацетонитрил/водный буфер, рН 5 — 7. 70:30.
1838414
Отнесение
vNH. ИЗН амид l(vC-=0)
ЗО гетерациклическая
vC=C и vC=N амид il (нNH ароматическая дСН гетероциклическая
YCH
35 ароматическая YCH
1525, 1495
1250, 1205
870
745, 700 в) Н-ЯМР спектр, который представлен
1 на рисунке 3, демонстрирует следующие группы сигналов (в ппм) при 500 мгц, запи- 40 санные в ДМСО-0в (гексадейтерадиметилсуаьфоксид), используя ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ппм); число протонов для каждого сигнала сообщено в круглых скобках:
9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1);
8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1). 8,25 (1); 7,4 — 7,20 (9);
6,96(2); 6,02 (1); 5,30 — 5,18(3); 5,01(1); 4,97(2);
4 80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3.98 (1); 3,81 (1) 379 (1) 338(3) 2 72 (1) 2 58(3) 2 48(3) 50
2, Iá (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1), 0,87
-(3); 0,84 (3); г) С-ЯМР спектр, который представлен на Рисунке 4 с сопутствующими пояснениями, демонстрирует следующие группы сиг- 55 налов (ппм) при 125 мгц в DMCO-ds с ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ппм), 0 означает четвертичные углеродные атомы или С=О группы, а) Ультрафиолетовый спектр (УФ) поглощения, который представляет на рисунке 1 с сопутствующими пояснениями, демонстрирует следующие максимумы поглощения;
F. 1% Лямбда 5
1см макс (нм)
0,1 М HCI — 245 (плечо)
0,1 М КОН вЂ” 245 (плечо)
313 10
Фосфатный буфер — 245 (плечо) рН 7,4 314
Метанол 244 (плечо)
265 310
15 б) инфракрасный спектр (ИК) поглощения в нуйоловой пасте, который представлен на рисунке 2 с соп,тствующими пояснениями, демонстрирует следующие максимумы поглощения (см ): 3700-3060, -1, 3060 — 2660 (нуйол); 1650; 1590-1490; 14901420 (нуйол); 1375 (нуйол); 1310; 1245; 1210;
1165; 1090: 1060; 1020; 970; 930; 840; 810;
750; 720 (нуйол); 700, Главные функциональные полосы ИК 25 поглощения этого спектра могут быть прописаны так:
v,(см ), 3600-3100
1545
173,69,0; 171,10; 0; 169,83. Q; 169,51, Q;
168,45, Q; 168,26, 0; 167,84, Q; 165.68, Q;
164,75, 0: 161,40, 0; 161,23 Q; 160,46, 0;
160,29, 0; 159,35, Q; 153.52. 0; 150,31, Q;
150,11, 0: 149,41, 0; 146,93 0: 144,73, Q;
143,75, 0; 142,10 Q; 141,78, 0; 141,33, СН;
140,97, 0; 139,53, Q; 128,68, СН; 127,99, 2 !
СН, 127.67, 0; 127,67, СН: 126,88, СН;
126,76. 2(CH); 123,17, Сф 118,65, СН;
116,42, СН; 73,81, СН; 69,41, СН2; 67,97, СН;
67,36, CHz; 60,12 СН; 58 63. СНз; 58,24, СН;
55,41, СН; 48,15, СН; 47,03, CHz, 41,19, СН2, 37,60, CHz; 34,06, СН; 29.76, СН2; 25,85, СНз;
24,28. CHz; 18,49, СНз; 17,98, СНз, 11,99, СНз; д) время удерживания (Rr) 14,9 мин при анализе с помощью обращенно-фазовой
HEI С при следующих условиях, колонка: Ultrasphere (абращенная фаза силанизированный силикагель, 5 микрометров (A!tex) Beckman (4,6 мм (в.д.)х 250 мм. пред-колонка: Browntee Labs КР18 (октадецилсилан силикагель, 5 микрометров), элюент А: ацетонитрил: 18 л;м фасфат натрия 70:30(об,/об.) доведенный до рН 7,0. элюент В: ацетонитрил; 18 мм фосфат на1рия 10:90 (об./об,), доведен до рН 7,0 ре>кил1 элюирования: линейньнl градиент элюента А в элюенте В от 45% до 70% за 20 мин скорость потока: 1,8 мл/мин
Y.Ô. детектор: 254 нм внутренний стандарт: хлорамфеникon (В!=3,7 мин) е) элементный анализ, после того, как образец предварительно высушен при ОКо ло 140 С в инертной атмосфере, указывает следующий состав: углерод, водород, азот, сера, ж) ВГ значение 0,37 в следующей хроматографической системе: дихлорметан:метанол 9:1 (об./об.), используя пластины силикагеля (силикагель
60 Fz54, МегсЕСо) визуализация: УФ свет при 254 нм, желтое пятно с парами иода или биоавтография, используя В. Subtilis АТСС 6633 на л инимальной среде Дэвиса; внутренний стандарт; хлорамфеникол (Rf 0,56) з) FAB-MS анализ, показывающий наинизшую массу изотопа протанированнаго молекулярного иона при м/з 1290,3+0,1 дальтон. Все другие пики свыше 800 м/з единиц (не считая пиков изотопов) в спектре были менее, чем 20% от молекулярного иона, на основании анализа с пол1ощью двойного фокусирующего л1асс-спектрометра Kratos MS-50 при следующих экспериментальных условиях: бомбардировка быстрыми атомами Хе при 6 кв; глицерино1838414
20 вая матрица; режим положительной ионизации, и) аминокислотный анализ солянокислого гидролизата. показывающий присутствие следующих природных аминокислот: глицин, (L)-пролин и (Ц-серин, при следующих экспериментальных условиях; образец гидролизуют при 105 С в течение 20 часов в присутствии б NHCI, содержащей 1% фенола, и затем получают производные в две стадии следующим образом:
1) образование н-пропиловых эфиров карбоновой кислоты функционализацией с
2 NHCI в безводном пропаноле (90 С, 1 час), и последующая сушка в атмосфере азота;
2) конверсия свободных аминогрупп в амидные с пентафторпропионовым ангидридом (безводным дихлорметаном, 1/9 (об/об) при комнатной температуре в течение 1 часа с последующей сушкой в атмосфере азота, функционализированный остаток, полученный таким образом, растворяют в дихлорметане и анализируют GG-MS, используя НР5985В систему при следующих условиях;колонка; капиллярная колонка иэ плавленного кварца, покрытая
- хиральным. н-пропионил-1-валин т-бутиламид полисилоксаном (25 м х 0,2 мм в.д., С,G.Ñ. ANA LYTIC); температурная программа 80 С в течение 4 часов, затем 4 С/мин к) ионизационные исследования никаких поддающихся ионизации функций не определено титрованием с 0,1 NHCI и 0,1 NaOH в метилцеллозоль/вода; слабо основную функцию выявляют титрованием с 0,1 NHCIOn в неводной среде (уксусная кислота), л) Удельное вращение (альфа)р =+140,8; абсолютный этанол, го при концентрации около 5 г/л, Антимикробная активность соединений изобретения может быть продемонстрирована серией стандартных тестов ln vitro MIG для Clostridium difficile, Propionlbactertum
acnes, и Bactегоides fragills путем агарового разбавления (инокуляты 100 (FU), MIC для других организмов определяют разбавлением микробульона (инокула 10 до 10
CFU/ìë). Инокуляты для Ureaplasma
ureaIytIcum были приблизительно 10 цветовых изменений единиц/мл..Времена инкубации составляли 18-24 часов, кроме
N.gonorrhoeae Branhamella catarrhalis, М lnfiuenzae, I.difficile, P.acnes и В fragllis
{48 ч). Все организмы инкубируют при около
37 С кроме Candida albicans (30 С). N.
gonorrhoeae и М influenzae инкубируют в 5%, СОг атмосфере, анаэробируют в смеси ана25
55 эробных газов. Использованные среды. Sso.
Sensitest бульон {ОХо id) {Staphylococci, Streptococcus faecalis, Streptococcus
faecium Escherlchla coli, Pseudomonas аегнфпоэа, Proteus fuigares, Klebsielia
pneumoniaI) Todd, Hewltt бульон (Difco) (другие стрептококки); GC основания бульон (Difco) +1% Sso fitalex ВВi (N, gonorrhocai), бульон. из настоя мозгов и сердца (Difco)
+1% добавка С (Difco) (M.influenzae), Mueller. Hlnton бульон (BBL) {Branhamella
catarrhalis); АС среда (D ifco); (С.pevfrlngens); Wllklns. Chalgren агар (Oxold) (другие анаэробы) Evans and Taylor
Robinson бульон (Dlfco), с добавками, для
U.urealyticum; дрожжевой азотн ый бульон (Difco) (Candida alf leans), Минимальные ингибиторные концентрации (MIG, микрограммlмл) для некоторых микроорганизмов сообщены ниже в табл, 4.
Активность антибиотика ОЕ,2270 также подтверждается в экспериментах in vitro no отношению к клиническим изолятам
enterecoccI.
В табл. 5 сообщаются результаты этих экспериментов..
Результаты, относящиеся к некоторым
in vitro тестам по отношению к клиническииэолированным коагулазо-негативным
SpaphylococcI сообщены ниже в табл, 6, Противомикробный спектр активности антибиотика GE 2270 включает также анаэробы, как показано согласно результатам in
vitro эксперимента, сообщенным в табл. 7 ниже.
Активность по отношению к Р, acnes подтверждают в !п vitro эксперименте, включающем II клинически„-изолированных штаммов, результаты которого приведены в табл. 8., Бактерицидная активность по отношению к Entегоcoccus faecalis, Кривые время-гибель получают в 10 мл
Todd-He Witt бульона в 100 мл склянках
Эрлеймейера, выдержанных при 37. С без перемешивания, Логарифмически растущую культуру Entегоcoccus faecalis штамма
1 149 инокулируют при 1,4х10 CFU/ìë.
Указанный антибиотик/тейхопланин, 8 мг/л убивает 99% инфицирующих бактерий за 48 часов, в то время как антибиотик
GE 2270 фактор А/0,12 мл/л) убивает 99,8% бактерий эа 2 часа и 99,99% за 48 часов при этой дозе или за 24 часа при 4 мг/л.
Эта активность по отношению к
Entегоcoccus faecails распространяется также на штаммы, которые резистентны к гликопептидным антибиотикам.
13
1838414
Активность по отношению к Gardnerella
vaglnalis 13 клинических изолятов vaglnalts испытывают на Casman агаре с 5ь кроличьей крови и 0,15 лизированной крови кролика (инокулят приблизительно 10 5
CFU), М!С антибиотика GE 2270 фактора А была в области 2-4 мг/л, М!Сбо 2 мг/л. Инкуфацию проводят в течение 48 часов при
37ОС в анаэробной газовой смеси.
Экспериментальный сепсис у мышей. 1р лаатьаакаь нений изобретения подтверждается также в экспериментальном ее сепсисе у мышей.
Группы из 8 мышей CDI îáîèõ полов (Charles River, средний вес 18-22 r) инфици- 15 руют внутрибрюшинно Staphybcoccus
aureus АТСС 19636. Бактерицидное введе- ние веществ 10 клеток/мышь) осуществляб ют в виде суспензии в 0,5 мл 5 микробиологического муцина (Difco). Тесто- 20 все соединение применяют внутривенно один раз немедленно после инфекции в стерильном водном растворе, содержащем 5 диметилформамидэ и 10 Cremophor EL) полиэтоксилировэнное KBCToposoe масло). 25
Е05о рассчитывают на седьмой день от процента оставшихся в живых животных при каждой дозе по методу Spearman and
Raerber ее значение составляет 1,13 мг/кг.
Экспериментальный эндокэрдит у кррыс 30
Зйдокардит Оыл вызван у особеи иужского пола CO крыс (Charles River),âåñÿùèõ около 200 г. Полиэтиленовый катетер (PP.25
Partex) вводят через клапан аорты в левый желудочек через правую сонную артерию и 35 закрепляют шелковой лигатурой. ПравильноЕ положение катетера контролируют, используя усилитель записи (Hewlett Packard модель 7782А) с датчиком давления. Через два дня крыс инфицируют путем инъекции 40
0,5 мл раствора соли, содержащего 10 CFU
aures 1 1524. Лечение проводят в течение 5 дней, начиная с 16 час. После инфицирования. Антибиотик GE?270 фактор А, солюбилизированный в пропиленгликоле: 45
Cremophor El:5 глюкоза — (10:20:70, вводят
i, ч. 20 мг/кг дважды в день. Оставшихся в живых крыс убивают на шестой день после лечения и их сердца удаляют. Каждое животное, умершее до конца терапии, вскрывают,50 и его сердце удаляют. Каждое сердце взвешивают и гомогенизируют, гомогенаты по и следовательно разбавляют и помещают на
Todd-Hewitt агар, чтобы определить бактериальную нагрузку. Присутствие крови в 55 полных сердечных гомогенатах не влияет на результаты, так как бактериальные титры в крови были всегда, по крайней мере, в 1000 рэз ниже, чем сердечные нагрузки. Данные статистически проанализируют посредством Scheffe s сложного сравнительного теста. Тех крыс, которые умерли в ечение 40 часов после заражения, исключают из статистического анализа. Результаты этого эксперимента приводятся в табл. 9.
Острая токсичность.
Тесты на острую токсичность. Bldllohненные на мышах, показывают, что LD5o для антибиотика GE 2270 фактор А выше, чем
100 мг/кг1.к и выше, чем 500 мг/кг i,р. у того же вида животных.
Ввиду его свойств, соединение изобретения может быть использовано как активный ингредиент при приготовлении лекарственных препаратов для лечения человека или животного.
В частности, антибиотик GE 2270 фактор А является противомикробным агентом, главным образом, активным по ot ношению к грамположительным бактериям и грамоположительным также как и грамотрицательным аназробам. По-видимому. он также является очень активным в стафилококковом зндокардите без какой-либо кросс-резистентности с метисилли нем, аминогликозидами или гликопептидными антибиотиками,, Главное терапевтическое показание антибактериального вещества изобретения заключается таким образом в лечении инфекций, относящихся к присутствию микроорганизма, чувствительного к нему.
Как полагают, термин "лечение" включает в себя также профилактику, терапию и лечение.
Пациент, получающий этот курс лече-. ния, является любым нуждающимся в нем животным, включая приматов, в частности, людей, и других млекопитающих, таких как лошади, крупный рогатый скот, свинья и овца, домашняя птица и домашние животные вообще.
Соединение изобретения может применяться как таковое или как добавка с фармацевтически приемлемыми носителями и может также применяться в соединении с другими противомикробными агентами, такие как пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды и . гликопептиды.
Обьединенная терапия, таким образом, включает последовательное, одновременное и раздельное введение активного соединения путем, при котором терапевтические эффекты от первого приема еще полностью не исчезают.
На фиг. 1 представлен УФ спектр антибиотика GE 2270 фактор А, Соответствие между символами примененными растворителями является следующим:
- относится к образцу в СНЗОН
1838414
Крахмал . 20 г/л
Пептон 2,5 г/л
Гидролизованный казеин
Дрожжевой экстракт
Мясной экстракт
Соевая мука
Карбонат кальция
Дистиллированная вода g.s. (доведенная до рН 7,0 перед стерилизацией) и инкубируют в течение около 72 часов при 28-30ОС, 2,5 г/л
3 г/л, 2 г/л
2 г/л
1 г/л относится к образцу в 0,1 NHCI у относится к образцу в фосфатном буфере рН 7,4 относится к образцу в 0,1 N КОН
На-фиг. 2 представлен ИК-спектр поглощения антибиотика GE 2270 фактор А в нуйоловой пасте.
На фиг. 3 представлен Н-ЯМР антиби1 отика GE 2270 фактор А, измеренный при
500 мгц в ОМСО-46
На фиг. 4 представлен зС-ЯМР антибиотика GE 2270 фактор А при 125 мгц в
ОМСО-бв
Пример 1, Получение антибиотика GE
2270.
Культуру Р!апоЫврога rosea АТСС
53773 выращивают на агаровой питательной среде из овсяной муки в течение двух недель при 28 — 30 С и затем используют для инокуляции 500 мл склянки, содержащие
100 мл засевной среды следующего состава:
Крахмал 20 г/л
Полипептон 5 г/л
Дрожжевой экстракт 3 г/л
Мясной экстракт 2 г/л
Соевая мука . 2 г/л
Ка бонат каль ия 1 г/л р Ч
Дистиллированная, вода g.S 100 мл (доведенная до рН 7,0 перед стерилизацией), Склянку инкубируют на роторном встряхивателе (200 об./мин) при 28-30 С в течение 92 часов. Полученную культуру затем используют для инокуляции в контейнерном ферментаторе, содержащем 4 литра той же самой среды и культуру инкубируют прй 2830 С втечение 48 часов при перемешивании (около 900 об/мин) и аэрации (около одного стандартного литра воздуха на объем на минуту), Полученный бульон переносят в ферментатор, содержащий 50 л следующей продуцирующей среды:
Противомикробную продукцию контролируют с помощью испытания агаровой пробы на бумажном диске, используя B.subtilis
АТСС 6633, выращенном на минимальной среде Davis. Зоны ингибирования оценивают после инкубирования в течение ночи при
35 С, Пример 2. Выделение антибиотика
G E2270, 10 Ферментированную массу (50 л), полученную выше, собирают и подвергают фильтрации в присутствии фильтрующего средства (Clarceli), Антибиотик GE 2270 находится, главным образом, в мицелии, даже если некоторое количество его может быть выделено также из фильтратов. а) Фильтрат доводят до около рН 7,0 и экстрагируют этилацетатом (50 л). Органи20 ческую фазу отделяют центрифугированием и концентрируют до небольшого объема при пониженном давлении. Полученный маслянистый остаток затем обрабатывают петролейным эфиром, чтобы осадить неочи25 щенный антибиотик 6Е 2270, который собирают путем фильтрации и сушат. 415 мг неочищенного комплекса ацтибиотика GE
2270 получают. в) Мицелий экстрагируют дважды 20 л
30 метанола и объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении, получая водный остаток, который дважды зкстрагируют этилацетатом. Неочищенный антибиотик О Е 2270 (606 г) осаждают добав35 лением петролейного эфира из концентрированной органической фазы.
Пример 3. Очистка антибиотик" GE
2270 фактор А.
Сырец, полученный из.мицелия соглас40 но методике, описанной выше (Зг), растворяют в тетрагидрофуране и концентрируют при пониженном давлении в присутствии силикагеля (230 — 400 меш). Полученный твердый остаток собирают и наносят на хро45 матографическую колонку, содержащую 300
r силикагеля (230-400 меш), приготовленного в метиленхлориде (CHzClz). Колонку проявляют сначала метиленхлоридо л (2 л) и затем последовательно 1,5 л смесей мети50 ленхлорида и метанола в следующих соотношениях; 98,2, 96/4, 94/6, 92/8, 90/10,и
88/12 (об.-/об.). фракции собирают, анализируют методами TLC, HPLC или микробиологически по
55 отношению к B.subtiiis объединяют согласно содержанию в них антибиотика.
Объединенные фракции, содержащие чистый антибиотик GE 2270 фактор А (HPLC время удерживания 14,9 мин.см. Физикохимические данные, пункт Е, выше) концен1838414
i)»макс, HI!
245 (пле )о}
245 (плечо)
313
0,.1 M КОН
Фoсфатнálй буфер рН 7,4
245 (пг:ечг)1
314 ."41 (пл -. )и}
310
Метанол
265
50 трируют при пониженном давлении, получая маслянистый остаток, который солюбилизируют тетрагидро >ураном. Из этого раствора антибиотик GE 2270 фактор А (600
Мг) осаждают путем добавления петролейНого эфира, Пример 4. Другой урожай антибиотика GE 2270 фактор А получают из других фракций, выделенных с помощью выше описанной хроматографической системы, но,оторые содержат его в неочищенной форме (НРI С). Также эти фракции объединя)от, концентрируют и обрабатывают, чтобы получить твердое вещество, как описано выше.
Этот, неочищенный препарат антибиотика
ГЕ 2270 фактор А очищают методом HPLC согласно следующей методике:
Часть этого осадка (б мг) растворяют в смеси ацетонитрил: вода, 1:1 (об./об.) и вводят в НР1 С хроматографическу)о систп! у, снабженную колонкой с силанизированным силикагелем (Licl)rosorb RIP 18,7 микрометров, 250х10 мм„Merck Darmstad(.
Проводят элюирование смесью раствора А и В с линейным градиентом концентраций от 50 до 85% А и В, в течение 20 мин при скорости потока около 4 мл в мин, Раствор А предстaвляет собой смесь ацетониi рила и 18 мм буфера фосфата натрия 70/ЗО (об./об.), доведенну)о до рН 6, в то время как раствор В представляет собой смесь ацетонитрила и 18 мм фосфатногo буфера, 10/90 (об./об.}, доверенную до рН 6, Колонку присоединяют к Perkin Elmer
1 С 85 УФ детектор при 330 нм. Фракции li последовательных хроматографических
Опытов, имеющие однородное содержание, объединяют и концентрируют при пойиженном давлении, чтобы удалить ацетонитрил, получая, таким образом, выделенные остаточные растворы, содержащие а))тибиотик
GE 2270 фактор А, Эти растворы экстрагируют дважды равным обьемом этилацетата и
Противомикробный продукт получают oca>l:дением из концентрированной органической фазы путем добавления петролейного эфира. После выделения фильтрацией и высушивания получают 27 мг антибиотика GE
2270 фактор А.
Формула изобретения
1, Штамм бактерий Planobispora гозеа
АТСС 53773 — продуцент фактора А антибиотика GE 2270.
2, Способ получения фактора А антибиотика GE 2270, заключающийся в тОм, что культивируют штамм бактерий Planobispora
rosea АТСС 537/3 в условиях глубинного погружения и аэрации в присутствии усваиваемых источников углерода, азота и мине20
45 ральных солей при 24 — 35ОС до оптимального накопления целевого продукта с последук)щим его выделением путем экстракции мицелия и фильтрата культуральной жидкости.
3. Фактор A антибиотика GF 2270, имеющий следующие характеристики: a) ульт. рафиолетовый clleKlр поглощения, который демонстрирует следу)ощий максимум.поглощения:
1 }
0,1 M HCI б) инфракрасный спектр l1orf;olljelll в
II)AolloBoA пасте, которь)й демон р!)рует следующие максимумаl погл))це)ги.. (см ):
3700-.3"060, 3060 — 2660 (нуйол): 1650, I!)901490, 1490 1420 (Ilуйол); 13 /5 ()!уйсл); 1. . 1О, 1245, 1210; 1165; 1090; 1060; )020; 970: !130;
810; 810: 750; 720 ())уйол); 700; ! IaDH1.Ie функциональ))ые г)О»»f)c).l 14Кпогло!ценил этого спектра могу:: б .)ть О. несся)ы как:
1, CI»I .-1 OTIIccBHIIe
3600 — 3100 Ni I, !»О1-1
1650 амид I (С-:0)
1545 гете о о г OK I I Ос «аз.) г)С=-С и г:С»--! 1
1525, 1495 а».l÷ä II (д!»1Н)
1250. 1205 ароматическ=л дС1(870 гетероцикл. ческ»1»!
»/; 1»
745, 700 »яро!иатп»)еск»)л YC.I-I в} Н-))М1 спекгр, кofo»;! !» де)!О))с»-11))-! рует следующие группы сигналел (v, pp!r)} при 500 мГI:;, записанн!. а в !)МСг)-с1;(гекгaдейтероди .,етплсульфo):CI!,fi}, используя
ПЯС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ррлг), число п110тонов длл каждого сиг Har)ÿ дано в кругл )х скобках:
9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 3,50 (1);
8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (l), 8,25 (1); 7,4-7,20 (9);
6,96 (2), 6,02 (); 6, 3 0-6, 1 8 (3); 5, 10 (1) 1,97 (2);
4,80 (1); 4,56 (1}, 4,30(1}. 4,26 (1); 3,98 (1): 3,81 (1) 3,79 (1); 3, 30 (3), 2»72 (1}; 2,5 1 (3) " 48 (-1):
2,16 (1); 2,13 (1}; 1.98 (2); 1,88 (1); I.:É (1), 0,117 (3,, 0,84,(3}: г) С-МР спектр, демонстр!)ру)о)ций следу)ощне группы сигналов (ррл)) при 1!5 мГц в DViCO !1всТМС и качест! е ьч)утреннего стандарта (0,00 ppm}, Q !етлерги )нь!е углеродныа атомы или С=О группы;
1838414
173,69, Q; 171,10, Q; 169,83 0; 169,51, Q;
168,45, Q; 168,26 Q; 167,84, Q; 165,60, Q;
164,75, 0; 161,40, Q; 161.23, 0; l60,46„Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q, 150,31, С»:
150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, 0; 5
143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q, 141,33, СН;
140,97, Q; 139,53, Q; 128.68, СН; 127,99, 2
»СН ; 127,67, Q; 127,67, СН, 126,08, СН;
126,76, С СН ; 123,17, СН; 118,66, CH: l16,42, СН;73,81, СН; 69,41, СН2; 67,97, СК; 10
67,36. СН2; 60,12, СН; 50,63, СНз; 58,24, СН;
55,41, СН; 48,15 СН; 47.03, СНг;