Способ лечения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой gt рнк

Способ лечения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой gt рнк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в терапии Сущность изобретения для печения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой дт РНК в организме человека вводят пожноспаренную дт РНК в количестве 1 - 1000 мкг/1мм биологической жидкости. При этом ложноспаренная дт РНК представляет собой комплекс полиинозмната и толицитидилата содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 урациловых или гуанидиновых оснований включает районы разрыва связей и соответствует формуле г1 )хп П 11-14

(19) RU (11) (51) 5 С 07 Н11

OIIHCAHBK И ЗОБРЕТЕНИ И"

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4356574/1 3 (22) 02.09.88 (46) 30.10.93 Бюл. Na 39-40

{71) Хем Рисерч Инк (US) (72) Вильям АКартер(05) (73) Хем Рисерч Инк (US) (54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ

СОСТОЯНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НЕХВАТКОЙ ДТ РН К (57) Использование: в терапии. Сущность изобрев I I тения: для лечения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой дт PHK в организме человека вводят ложносларенную дт PHK в копичестве 1 — 1000 мкг/1мм биологической жидкости.

При этом ложносларенная дт РНК представляет собой комплекс лолиинозината и толицитидилата содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 урациловых или гуанидиновых оснований включает районы разрыва связей и соответствует формуле г1 хт(С )xn. н 11-14

2001917

Изобретение относится к постановке диагноза состояния нехватки 9тРНК и процедурам подачи экзогенной 9тРНК в подходящей молекулярной конфигурации для восстановления ее нормального уровня.

Новые способы постановки диагноза и терапии вирусных болезней, хронических патогенных инфекций в общем и рака появляются, когда раскрыты разнообразные роли, которые играет отРНК в хозяйской защите. Например, развитие СПИДа (ретровируснвя инфекция, рак) связано с постепенно ужесточающейся дисфункцией биологических процессов, которые каталиэируются QTPHК, включая не только биосинтез интерферона, но также продукцию биоактивного 2 — 5А, активность РНКазы и различные опосредованные клеткой иммунные функции. Специфическое снижение количества биоактивной дтРНК или ферментов, которые зависят от отРНК, внутри специфических клеток вносит вклад в прогрессию болезни.

Состояние нехватки в путях, вовлекающих биоактивную цтРНК, также лежит в корне различных клеточных повреждений в хозяйских системах защити, привходящих к смерти. Ранее был обнаружен ингибитор

РНКазы в лимфоцитах инфицированных

БИЧ пациентов, больных ССК и СПИД, который является только одним результатом из многих неадекватных внутриклеточных уровней отРНК. Терапия при помощи имеющей подходящую конфигурацию синтетической отРНК устраняет один или н .сколько этих ингибиторов, что может частично обьяснить клинический ответ, который наблюдается при уменьшении концентрации вируса и восстановлении иммунной функции с разными хроническими виремиями, которые в настоящее время продолжают в значительной степени противостоять решительному медицинскому вмешательству.

Предлагаемый способ может обълсн,1ть, определить и корректировать ряд состояний нехватки grPHK при различных боле. .нях.

Некоторые 9тРНК, т,н. ложноспаренные

9тРНК, могут фактически замещать цтРНК природного происхождения, что помагает поддерживать функции, необходимые для нормальных клеточных процессов. Отсутствие такоей регуляции 9тРНК, пе будучи скорректированно подходящей зкзогенной

gTPHK, может вызвать развитие аномальных клеточных процессов. Аномальные клеточные процессы затем приводят к хроническим инфекциям вирусoR или других внутриклеточных патогенов, сниженным функциям иммунных клеток. B конце концов к хронической болезненности и к собственно смерти.

Клинические стратегии. Вирусные инфекции могут часто следовать за частичным нарушением иммунной системы такими разными агентами, как стресс и вирусы, которые атакуют непосредственно иммунную функцию. Например, СПИД следует за прогрессивным ухудшением в иммунной систа 0 ме, вызванным инфекцией Т-лимфонитов вирусом иммунного дефицита человека—

ВИЧ (Coffin el sl, Science voL 232, р.697, 1986). э

Существуют Разные обозначения виру15 сз ВИЧ: LAV — обозначение вируса СПИД, выделенного в Пастеровс ком институте, Па риж, Франция; HTLVlll — обозначение виру=а СПИД, выделенного в Национальном институте здоровья, Бетеэда, Мэриленд, 2 - ГША. Зджесь ВИЧ использован в качестве общего названия вируса. Часть в тексте будут ссылки на ВИЧ в общем виде или ВИЧ, или HTLVllL или LAV беэ попыток дифференцировать их. Более того, термин ВИЧ

25- включает все другие вирусы, которые могут быть связаны с образованием СПИД, изолированы они уже или нет.

Инфекция В ИЧ вЂ” это прогрессирующая болезнь, хотя темп перехода от одной фазы 0 к другой варьирует. У асимптоматических индивидуумов, инфицированных ВИЧ, может развиваться состояние (LAS или преARC), характеризованное как лимфоаденопатия. Пациенты прогрессиру85 ют к СПИД связанному комплексу или ССК, демонстрируя дефицит Т4 клеток и позднее сн,женную способность лимфоцитов подвергатьсяя антиген-стимулируемой пролиферации и продуцировать IFN-гамма. Эти

40 пациенты теряют иммунные функции, опосредованные различными клетками, например задержанная кожная гиперчувствительность, со бременем становящаяся совершенно вялой, Они демонст45 рируют свидетельства поломки в защитном хозяйском механизме, включая инфекции герпесного опоясывающего лишая, орального кандидоза и такие симптомы, как продолжите1ьные лихорадки, ночные паты, 50 поносы и потеря веса. В конечном счете эти пациенты испытывают определенные сильные условно-патогенные инфекции (например, пневмония, вызываемая Pneumoc— уз0з — carlnli) и затем их определяют как

55 имеющих полностью развитый СПИД с приблизительно 50Я смертностью в течение 12 месяцев, Инфекция вирусом ВИЧ выбрана в качестве иллюстративного примера, потому что уровень нехватки 9тРНК столь выражен. многие другие болезни, включая вялотеку2001917 щие вирусные инфекции, ассоциированы с похожими нехватками, Существенно, что типичная прогрессия, выведенная выше, не описывает существенных различий в клинической симптоматологии между ВИЧ-инфицированными пациентами или многими другими пациентами с хроническими болезнями, такими как инфекция Эпштейн-Барр или ЭБ, инфекция вирусом гепатита, цитомегаловирусом, герпесные инфекции и т.п, Компоненты иммунной системы распадаются с крайне различной скоростью у разных пациентов, потеря биоактивной 9тРНК вЂ” это причина или фактор, влияющий на данный процесс.

Инфекция ВИЧ может развиваться в различных типах клеток (например, в кровяных клетках, глиальных клетках), У некоторых пациентов в качестве первого симптома развивается нейрологическая дисфункция.

Следовательно, различные индивидуумы могут иметь крайне различные терапевтические потребности, даже если все нуждаются в уничтожении ВИЧ в Т4 клетках.

У многих вирусных инфекций, включая такие у пациентов с ССК, могут быть выделены две общие патологические черты, набор иммунных нехваток и длящаяся вирусная инфекция (,:aucl, Proc. Nat !. Acad.

Sci. USA, vol. 83, р.9278, 1986). Терапевтическое вмешательство, влияющее лишь на иммунные нехватки, но неудачное в борьбе с репликацией вируса. оказывает обратное действие, в особенности когда такая обработка активирует Т4 клетки. Например, Тхелперные клетки с рецепторами Тас способы к ответу на лимфокин IL — 2, У жертв

СПИДа IL — 2 вызывает распространение

ВИЧ-чувствительных клеток и очевидное ухудшение в болезни, Воздействие непосредственно на вирусные инфекции, например инфекцию

ВИЧ, бывает успешным, в особенности ингибитором вирусной обратной транскриптазы, обозначенным азотимидином (АЗТ), который может уменьшить "нагрузку" ВИЧ у некоторых пациентов и продлить жизнь, Такая терапия не свободна от нежелательных результатов, У меньшинства пациентов

А3Т также вызывает временное восстановление иммуности, опосредованной Т4 клетками, судя по измерениям временного роста Т4 клеток и по появлению гиперчувствительности замедленного типа (Fischl et al.

New Eng. J. Med., 1uló, 1987). Однако ингибиторы обратной транскриптазы токсичны в дозах, необходимых для получения значимого антивирусного эффекта, и поэтому плохо переносятся при длительном применении. Применение антивирусных агентов предотвращения и обработки вируса, но мо35 гут иметь существенные ограничения: например, ВИЧ (как и вирус гриппа) легко

45

55

30 может быть необходимо для жизни пзциента. IFN (интерферон) неэффективен и как антивирусное вещество общего действия, и как анти-СПИДовое лекарство, возможно, потому, что он не является противоядием для 9тРНК-связанных дефектов, Конечно, жертвы ССК/СПИДа имеют различные дефекты в пути IFN, такие как и родуцирование дефективного, кислотолабильного1ЕН и неспособность Т4 клеток вырабатывать подходящие количества IFN-гамма, которые хорошо описаны в медицинской литературе.

Эти различные IFN-связанные дефекты у пациентов с СПИД и ССК могут быть частично или всецело связаны с потерей активности

РНКазы в лимфоцитах.

ХОтя в лимфоцитах крови индивидуумов с ССК/СПИД и с другими хроническими виремиями увеличено количество 9тРНК-зависимой 2-5А синтетазы, те же клетки крови демонстрируют уменьшение количества аутентичной 2-5А и низкое количество

РНКазаЕ. Низкую активность РНКазы сопоставляют с небольшими количествами белка с M 80.000, способного связывать фотоаффинно меченые аналоги 2 — 5А. Это согласуется с путем отРНК, который был блокирîван и относительно отсутствует, и/или с ингибитором РНКазы(, Вакцинация против ВИЧ и других вирусов и использование пассивных антител анти-ВИЧ также обсуждаются для может инфицировать клетки скрытно.

9тРНК игранет роль в усилении выработки антител против вирусов вообще и ретровирусов в частности. Двутяжевые РНК, цтРНК, составляют первую группу молекул. которые эффективны против как вирусных, так и иммунных повреждений при различных подострых/хронических вирусных ин" фекцияк, как ВИЧ и другие. Эти дефекты могут быть исправлены с лазерной точностью без неблагоприятного повреждения основных функций тела, что является общим ограничением доступных сейчас терапий хронических вирусных инфекций. Пациенты с неразрешившимися и вялотекущими вирусными инфекциями части имеют специфические дефекты в жизненных внутриклеточных 9тРНК-зависимых путях, которые могут быть обращены или хотя бы частично исправлены экзогенно поданной

9тРНК (это объясняется графически на фиг.

1), и мониторинг этих путей перед и в течение обработки дает новый способ измерения степени терапии замещением 9тРНК, 2001917 требуемой для индивидуального пациента или специфической основы болезни, Критические ферменты, связанные с хозяйской защитой, требуют 9тРНК для проявления биоактивности. Эти ферменты могут быть активированы зкэогенной 9ТРНК, если уровень внутриклеточной природной отРНК столь низок. Часть плейотропного воздействия дтРНК происходит иэ ее способности индуцировать синтез всего спектра IFN-альфа, бета и гамма, которая действует через группу внутриклеточных медиаторов, включая цтРНК-зависимую протеинкиназу, отРНК-зависимую 2 — 5А синтетазу и 2 — 5А зависимую РНКазу1 . Эти 9тРНК-зависимые ферменты могут выполнять многие биологические активности, относимые к IFN, как описано Lengyel (Ann. Rev. Biochem, vol51, р.251, 1982). Например, образование антисмысловой РНК, которая блокирует экспрессию 2 — 5А синтетазы, вызывает абсолютную чувствительность животных клеток к инфекциям разными вирусами (Bendettl et al, Prac. Natl. Acad. Sci USa, vol,84, р,658, 1987), 9тРНК-активируемая протеинкиназа фосфорилирует eLF2, что ингибирует белковый синтез, она также обладает протеолитической активностью для расщепления вирусных белков. 9тРНК-активируемая 2-5А синтеза синтезирует 2 — 5А, который играет критическую роль как в подавлении различных вирусов животных, так и для контроля роста клеток (уход от которого может привести к образованию опухоли).

2 -5 -олигоадениловые кислоты необычны в том,что нормальная ", 5 фосфодизфирная связь, характерная для большинства 9ТРНК, замещена новой фосфодиэфирной свяэьью с приобретением новых биологических

СВОЙСТВ.

Антивирусная активность 9ТРНК. дтРНК вЂ” хорошо известный индуктор антивирусного состояния (Marcus et. ai. Nature, vol.66. р.815, 1977). Поли/А/; поли/У/ генерирует антивирусное состояние без индукции IFN, Но существует природная регуляция gnPHK и, следовательно, действительные состояния нехватки 9ТРНК распространены у людей с патогенными случаями (вирусные, грибковые, протозойные, бактериальные инвазии и т д„в особенности те, которые имеют внутриклеточные (у человека) присутствие в качестве желательного или обязательного компонента жизненного цикла).

Антипролиферативная активность

9тРНК. Ранее обнаружено (J.IFN. Rys., vol.

6, р.373, 1986), что 42 иэ более чем 100 свежих человеческих опухолевых образцов

55 при исследовании в полужидком агарв демонстрировали 50 или более уменьшенив образования колоний опухолевых клеток после лишь одной обработки 9ТРНК, Эти клетки имеют нехватки 9ТРНК. Известна независимая IFN-9ТРНК-чувствительность у разных линий опухолевых клеток человека.

Человеческие опухоли, размножаемые В безволосых мышах, были чувствительны к

9ТРНК; терапия 9ТРНК исцеляла от некоторых опухолей (например, почечной) и животные жили нормальной жизнью (см.

Европейское патентное описание

0,113.162). В данном способе описана корреляция между клиническими ответами н активацией 9ТРНК-зависимых ферментов в противоположность измеримой индукции !

FN или IL-2, вторичной по отношению к прим"чению 9ТРНК, Усиливающая иммунитет активность

9.РНК, Известно (J. Immunol, ч.124, р.1852, 1980), что 9тРНК повышает цитолитическую активность природных киллеров человека (NK) по отношению к клеткам лейкемии человека. Требования к структуре 9ТРНК для прироста К параллельны с таковыми, нужными для активации 2 — 5А и индукции lFN.

Контроль генов, опосредованный

9ТРНК. Sullo etal (Cell, 43, р.798, 1985) продемонстрировали, что 9тРН К индуцирует гбны компетентности в покоящихСЯ фиброобластях, включая онкогены, обозначенные foc u myc. Здесь "гены компетентности"" — те гены клетки, действие которых требуется для модулирования жизненных действий, как мультипликация, рост и т.д.

Индукция гена IFN-бета grPHK может использовать регуляторный белок, который удаляется при обработке 9ТРНК (Zlnn etal, СеИ. ч,45, р,611, 1986), По биологической активности экэогенно поданные 9ТРНК подобны такой природной невирусной внутриклеточной 9тРНК, как гетерогенная ядерная

РНК или комплексы мРНК с поли/У/. Например, IFM — индуцибельная дтРНК в ядрах клеток Hela способна активировать

2-5А синтетазу in vitro. Возникновенив клеточной иммун ности в далеком прошлом 3Волюцион ого цикла животных, очевидно, определило этап эволюции молекул

1ГМ/9ТРНК в направлении обеспечения клеточной дифференцировки, в частности дифференцировки, запускаемой lFM. Таким образом, 9тРНК может обеспечивать дифференцировку, запускаемую другими регуляторными белками, которые определяют этап определения состояний нехввткн

9тРНК.

200191 7

На фиг. 1 показана схема, иллюстриру- можным для пациента оценить степень зающая два пути; к болезненности хозяина и местительнойтерапиидтРНК,требующейся

его выздоровлению; на фиг, 2,а — графиче- для индивидуального состояния. Остальные ская диаграмма: число дней до и после на- значения определения нехваток отРНК дачала терапии IF в обозначенном количестве 5 ны ниже, "Медиаторы" определяются по относительно активности синтетазы, на фиг, способу действия как любые внутриклеточ2, б — график, сравнивающий количество ныечастицы, напримерспецифическиеолибелых кровяных телец и количество ложнос- гонуклеотиды, белки, цтРНК сами по себе паренной отРНК после 120 дней обработки; или в комбинации, которые проявляют спена фиг, 3 — фотография электрофореза в 10 цифические биохимические функции, иниполиакриламидном геле (в пластине), де- циируемые присутствием цтРНК. Такие монстрирующая различные зоны и полосы биохимические функции вносят вкладвусина протяжении каждой дорожки; на фиг. 4 — лие механизма хозяйской защиты на уровне график, сравнивающий абсолютное количе- как единственной клетки, так и всего оргаство Т4 лимфоцитов на кубический милли- 15 низма. метр крови, выраженный в процентном Условия, подходящие для терапевтичеизменении от нулевой линии с месяцами ских процедур, в общем те, при которых терапии. нехватка 9тРНК больше нормальных предДвутяжевые PHK (отРНК) составляют елов по сравнению со здоровыми инидивипервую группу молекул, которые эффектив- 20 дуумами, нехватка отРНК вызывает ны как против вирусных, так и против им- патологии тканей и/или в присутствии немунных повреждений различными нормально низкого уровня 9тРНК, сочетаюподострыми/хроническими вирусными ин- щегося или сосуществующего с фекциями, как ВИЧ и другие. Эти дефекты присутствием внутриклеточного патогена, могут быть исправлены с лазерной точно- 25 Более частные условия или патологии ткастью без нежелательного повреждения ос- ней и конституциональные симптомы вклютальных функций тела. что является общим чают такие вирусные инфекции, как ограничением для доступных в настоящее ретровирусные, включая ВИЧ, семейство время терапий хронических вирусных ин- вирусов герпеса, парамиксовирусы, риновифекций. Пациенты с неразрешенными и вя- 30 рус, гепатит и синдром хронический усталоруемую лотекущими вирусными инфекциями часто сти, Прочие включают неконтролир ем ю имеют специфические дефекты в жизнен- пролиферацию раковых клеток и патологии ных отРНК-зависимых путях, которые могут иммунной системы, находится компонентбыть исправлены или улучшены по крайней ная клетка в процессе мультипликации или мере частично экзогенно поданной дтРНК 35 дифференциации или нет. (это обьясняется графически на фиг. 1),мо- ПодложноспареннойотРНКпонимаютниторингэтих путем до и втечение обработ- ся те, у которых водородные связи (стэкинг ки обеспечивает новый эффективный оснований) между цепями относительно инспособ оценки степени заместительной тЕ- TBKTHbl, т.е. прерываются в общем менее рапии отРНК, требуемой индивидуальным 40 чем один раз на каждые 29 последовательпациентом или специфическим состоянием ных остатков оснований, Ложное спариваболезни. ние — это разрыв в нормальной геометрии

Этотспособобеспечиваетдиагностиче- двойной спирали PHK пугем втягивания скую процедурудля определения состояния (или выпячивания) цепей, который преднехватки9тРНКу пациента, количественно- 45 ставляет собой точку подверженности го определения этой нехватки(при наличии) отРНК расщеплению рибонуклеазами. и обеспечение терапевтической процедуры цтРИК может быть комплексом полидля восполнения любой определенной не- инозината или полицитидилата, содержахватки тРНК. П

g . рименением экзогенной щим часть урациловых оснований или отРНК возможно с лимфокином. Обычно со- 50 гуанидиновых оснований, например, от 1;5 стояние нехватки цтРНК заметно внутри до 1:30 (поли1 — поли/С4-zgx > U или С). клетки — компонента иммунной системы, на- g TP H К может иметь общую формулу г! пх ходится клетка-компонент в процессе муль- xr(CizU)n. Другие примеры 9тРНК приведетипликации или дифференциации или нет. ны ниже.

Нехватка 9тРНК заметна, например, по не- 55 В предпочтительной ложноспаренной способности клетки — компонента иммун- отРНК, rl> г(Сц U)n, район, состоящий из ной системы поддерживать существующий неразрывной последовательности 6 — 12 пар уровень биоактивной РНКазы. Мониторинг основан й, т,е. от полов ний, т,е. от половины до одного полвнутриклеточных 9тРНК-зависимых путей ного витка спирали РНК, служит и как биодо, в течение и после терапии делает воз- триггер. вызыва б р. вызывающии освобождение

2001917

15

40

55 лимфокинов, и как облигатный внутриклеточный кофактор для ферментов, представляющих природные антивирусные пути.

Ложноспаренные районы, состоящие из остатков урацила, периодически инсертированы в полипиримидовую цепь для ускорения гидролизэ PHK и предотвращения токсичНОСТИ.

Ложноспаренная цтРНК, предпочтительная для использования в настоящем изобретении, основана на кополинуклеотидах, выбранных из поли(Сп. G), где и — фактор имеет значения от 4 до 29, и явля ющихся аналогами (ложноспаренными) комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образованными модификацией

rln rCn для введения неспаренных оснований (урацила или гуанидина) в полирибоцитидилатную (rCn) цепь. Альтернативно

grPHK может быть получена из цтРНК поли/1/-поли/С/ модификацией рибозильного скелета полирибоинозиновой кислоты (г1 ), например включением 2 -0-метилрибоэильных остатков. Эти ложноспаренные аналоги rtn . rCn, предпочтительные из которых имеют общую формулу rln r(C>1-и, U)n и г4 г(С29, G)n. описаны Carter u Tso в патентах США N 4130641 и 4024222, цтРНК, описанные в них, удобны для использования в предлагаемом способе. В некоторых случаях комплементарные олигонуклеотидные дуплексы (спирали) также достаточны в качестве заместительной терапии.

Другие примеры ложноспаренной цтРНК для использования в способе включают поли/1/.Поли/С, U/ поли/1/.Поли/С7, U/ поли/1/.Поли/С13, U/ поли/1/.Поли/С22, U/ поли/1/.поли/С20, G/

Поли/1/.поли/С29, G/ поли/1/.поли/Ср/23 6 > р

Синергия цтРНК-лимфокин. Поскольку цтРИК оказывает существенную часть своего биологического действия через специфическую систему лим фоки нов, опосредованную частично IFM, она должна (а) индуцировать IFM в IFM-дефицитных клетках, (б) активировать уместные цтРНКзависимые ферменты-посредники, причем клеточная цтРНК неиндуцибельна в клетках и нв отвечает на зкзогенно примененный

lFN, Если цтРНК действует только через систему IFN и цтРНК находится в клетках в избытке, тогда избыток одного IFN оказывает такое же биологическое действие. как и комбинация IFM и цтРНК. Однако это должно быть относительно редким состоянием, поскольку имеется много примеров цтРНКIFN-синергии и мало примеров отсутствия синергии. Например, цтРНК синергичнэ с человеческими IFN-альфа, -бета или -гамма в ингибировании роста клеток иэ человеской карциномы пузыря, карциномы легких и фибросаркомы. Можно расширить эти результаты на 15 других линиях опухолевых клеток человека, причем только одна из них не показана антипролиферативной синергии, Сходный синергизм был заметен нэ некоторых опухолях человека, привитых нэ безволосых мышах; клинически наблюдают, что комбинация !FN и цтРНК была лучше, чем каждый из агентов в отдельности, в качестве противоракового режима по отношению как к опухолям почки, так и к СЬИ

Состояние нехватки цтРНК, Как прот0типный путь, путь 2 — 5А синтетаэы (РНКагы ) включает одну или более цтРНК, 2-5А, связанные ферменты и ингибиторы. Существует прямая биохимическая связь между

9TPHK u РНКазой в том, что 2-5А, продукт тРНК-зависимой 2-5А синтетазы является необходимым кофактором для активности

РНКаэы, Примеры предназначены служить примером нескольких из многих возможных видо в дефектов в цт Р Н К-опосредованных путях, которые могут быть исправлены экзогенно поданной цтРНК.

Схема на фиг. 1 иллюстрирует связи между достатком цтРНК, приводящим к выздоровлению хозяина, и нехваткой цтРНК, приводящей к болезненности хозяина. БИОактивная цт РН К вы рабатывается внутриклеточно или вводится при некоторых событиях, которые приводят к антивирусному состоянию так же, как и к дифференцировке иммунных клеток и выздоровлению хозяина, Измерение 2-5а синтетазы ln vitro имеет ограниченную ценность, поскольку не отрэжает активности 2 — 5А синтетазы In vlvo.

Отсюда разработан способ экстракции и количественного определения 2-5А из одноядерных клеток периферической крови (ОКПК) здоровых индивидуумов и инфицированных патогеном пациентов до и после терапии ложноспаренной цтРНК. Концентрация 2- А может быть определена по способности 2-5А активировать эффинно очищенную РНКазу1 и деградации поли/U// 2Р/рСр.

Методы.

Гепаринизированную и периферьйескую кровь получали от десяти здоровых индивидуумов и от пяти пациентов-мужских гомосексуалистов с LAS, CCK и СПИД, как определено Центрами по борьбе с болезнями. С клинической точки зрения проводили

2001917

14 вирологические и иммунологи4еские характеристики пациентов, вовлеченных в это исследование (пациенты 1 — 5) были охарактеризованы ранее как пациенты 10, 8, 1, 7 и 2 соответственно со статьей Lancet. 5

June 6, 1987. ОКПК изолировали на Firol!—

Hypagye, Клетки !929 и Н1 929 (РНКаза1.-дефицитный субклон L929) поддерживали в монослоной культуре. Цитоплазматические экстракты иэ клеток L929 и HL929 получали 10 в грицериновом буфете, экстракты из ОКПК получали в NP40-лизисном буфете, Концентрация белка в экстрактах составляла 10 — 15 мгк/мкл. СК, саркома Капощи; ППК, пневмония 15

PneumocystIc cat nÏ

Активность 2-5А синтетазы (колонка 3) определяли в экстрактах ОКПК (50 мкг белка/анализа), используя поли/6/:поли/С/агарозу, 2-5А выделяли из этанолрастворимой фракци экстрактов

ОКПК (100 мгк белка, 70% этанол, об/об), э«:".трагированную этанолом затем лиофилизировали и растворяли в воде (20 мкл).

Концентрации внутриклеточной 2-5А, присутствующей в экстрактах ОКПК (колонка 4), определяли в анализах в кор-целлюлозой с экстрактами клеток L929 в качестве источника РНКазыб по калибровочным кривым, полученным с истинной 2-5А. Активация 30

РНКазы 2-5А в этом анализе основана на превращении полиИ// P/рСр в кислото32 растворимые фрагменты. В контрольных опытах (в отсутствие 2 — 5А) на фильтрах из стекловолокна задерживалось 6500 35 расп./мин иэ общего добавленного количества 17700 расп./мин поли/О// P/рСр (1,3 мкКи/нмоль). В присутствии < 1 х 10

M истинной 2 — 5А поли/U//" P/ðÑð деградировал на 0%; в присутствии > 1 х 10 М 40 истинной 2 — 5А поли/U// Р/рСр деградировал на 100%. Уровни латентной РНКазы определяли двумя способами: (1) в анализах со связыванием радиоактивности после добавления 20000 распlмин рзА / /Р/рСр к 45 экстрактам ОКПК/50 мкг белка/анализ/и(2) в анализах с расщеплением рибосомной

PHK в присутствии 2-5А (колонка 6). Экстракты, полученные из клеток L929 (150 мкг белка/анализ), инкубировали 60 мин при 50 о

30 С в присутствии 5 мкл этанолраствооимой фракции экстрактов ОКПК и 1 х 10 М рзАз в конечном обьеме 20 мкл, Тотальную

P HK экстрагировали, денатурировали и анализировали элекгрофореэом в 1,8% агароз- 55 ном геле. Окрашенные бромистым этидием полосы визуализировали в УФ-свете. Активированные уровни РНКазы (колонка 6) определяли в анализах в расщеплением рибосомальной РНК в отсутствие добавленной 2 — 5А, Концентрация функциональной 2-5А в экстрактах ОКПК варьировала от 0,3 до 1,1 нмоль/г белка у здоровых индивидуумов и от уровней, меньше определяемых до 0,6 нмоль/г белка в экстрактах ОКПК иэ инфицированных вирусом пациентов до обработки ложноспаренной отРНК (табл. 10, колонка 4), Однако 2 — 5А накапливается до более чем 10 н/моль/г белка по мере терапии ложноспаренной отРНК, Ранее отмечалось, что 2-5А активизированная частично очищенная РНКаза предпочтительно расщепляет поли/U/, но не поли/С/. Выделенная человеческая 2-5А(как и истинная 2 — 5А) могла активировать аффинно очищенную

РНКазу из либо клеток L929. либо ОКПК от здоровых людей к специфической деградации поли/И, см. табл. 4. Важно отметить, что когда для экстракции 2 — 5А из ОКПК используется ТХУ в дополнение в поли/U/-деградирующей активности (РНКазы ) экстрагируется поли/С/-деградирующая активность. Эта поли/С/-деградирующая

ТХУ-экстрагируемая активность может быть устранена протеаэным расщеплением или дальнейшей экстракцией этанолом. Поли/С/-деградирующая активность была обнаружена в ТХУ-растворимой фракции

ОКПК от всех людей, но ни в одной из постоянных линий клеток (т.е. Не!а L929, HL929), проверенных на это, Поли/С/-деградирующая активность не была заметна ни в одной из этанолрастворимых фракций ОКПК.

М01 обозначает множественность инфекции. Это означает приблизительное количество вирусных частиц, приходящихся на каждую клетку-мишень.

БОЕ обозначает бляшкообраэующие единицы, Это означает количество вирусных частиц, определенное подсчетом цитопатических (мертвых) клеток, Хотя осуществляли сообщения о присутствии 2-5А в тканях, выделенных из необработанных животных, и о накапливании 2 — 5А в тканях мышей, обработанных 9тРНК, здесь сообщается о накапливании 2 — 5А в ткани человека. Точно установлено, что истинная 2-5А связывается РНКазой и активирует ее к деградации рРНК до высокохарактерных продуктов специфического расщепления (СПСР), Поэтому активность 2-5А, выделенной из экстрактов ОКПК характеризуется в анализе с расщеплением рРНК, Специфический поттерн расщепления, создаваемый РНКазой с экстрагированной этанолом 2-5А, тот же, что и полученный в присутствии истинной 2 — 5А.

Эти результаты показывают, что (внутривен15

2001917

5

20 ное) применение ложноспаренной 9тРНК к инфицированным вирусом пациентам вызывало резкое повышение 2-5А в кровяных клетках от концентраций, которые были ниже определяемых.

Активность РН Казыб.

Отсутствие активности РНКазы у индивидуумов, инфицированных ВИЧ, было подтверждено и данные расширены (табл. 10 колонки 5-7). Чувствительный метод, основанный на специфичности активированной

2-5А РНКаэы к расщеплению рРНК (Wrescher et at, Nucleic Acids Res, ч.9, пп.1571-1581, 1981), позволяли измерять активированную РНКазу в экстрактах иэ

ОКПК, выделенных из всего лишь 1 Мп периферийной крови. Экстракты РНКазы дефицитного субклона линии клеток L929 (HL929) были использованы s качестве источника рибосом. Экстракты ОКПК инфицированных

ВИЧ пациентов имели в 5-7 раз более низкие уровни латентной РНКазы, чем экстракты здоровых индивидуумов, как определено s анализах со связыванием радиоактивности (табл. 1, колонка 5, 240-280 против 1350 распlмин), Сходные наблюдения описаны Wu и др. (AtOS Reserarch, ч. 2, р.127-131, 1986). Применение анализа со связанной радиоактивностью ограничено в отношении определения уровня латентной

РНКазы у пациентов, обработанных ложноспаренной gTPHK, поскольку в образцах

ОКПК от этих пациентов присутствует накопленная 2 — 5А(табл. 1, колонка 4), которая может конкурировать за связывание с

РНКаэой, Поэтому определение уровня активированной 2 — 5А РНКазы необходимо.

Сначала уровни активированной РНКаэы . определяли. измеряя специфическое расщепление рРНК экстрактом из ОКПК в отсутствии экзогенно добавленной 2-5А (табл.1, колонка 7). Используя этот анализ, PHKaaaL не была активирована в экстрактах

ОКПК пациентов, инфицированных ВИЧ, до терапии (полиакриламидные гели, показанные на фиг. 3). Зная, что уровни внутоиклеточной 2-5А в этих образцах OKllV были низкими (табл, 2), эти результаты не были неожиданными. Однако экстракты их ОКПК от всех проверенных здоровых индивидуумов демонстрировали присутствие активированной РНКаэы1, которая образовывала продукты специфического расщепления в анализах с расщеплением рРНК, хотч количество 2-5А у некоторых здоровых индивидуумов было столь низко, как 0,3 нмоль/г белка (табл. 2), Существенно, что о; сутствие активности РН Казы в образцах от ВИЧ-инфицированных пациентов до терапии не могло быть благодаря накоплению конку25

55 рентного ингибитора 2-5А, как сообщалось в Caytet et а1, European J. Bloch., ч.143, р.165 — 177, 1984, активность РНКазы . нв могла быть восстановлена добавлением истинной 2 — 5А (табл. 1, колонка 6).

Затем определяли уровни латентной

РНКазы в двух независимых измерениях.

Латентную активность РНКаэы . определяли в анализах специфическим расщеплением рРНК, но в присутствии добавленной

2-5А (табл, 2). В образцах, взятых до терапии ложноспаренной дтРНК, ни у одного из пяти обследованных пациентов не была обнаружена латентная РНКаэа1..

Способ фотоаффинного мечения с

РзА4(Р)рСр был использован для дальнейшего определения отсутствия PHKaaaL в

0KilK БИЧ-инфицированных пациентов (или она изменена). Предыдущие исследования с ратоаффинным мечением идентифицировали белок с Mr 80.000 с PaA4(P)pCp связывающей активностью и специфической поли/У/эндорибонуклеолитической активностью как РНКазу1 . Аффинное мечение РНКазы, присутствующей в экстрактах

ОКПК, определяли, используя P3A4(P)pCP.

РНКазу из экстрактов ОКПК (50мкг белка) от нормальных индивидуумом в сравнении с ССК-пациентом (пациентом до терапии ложноспаренной 9тРНК) или экстрактом клеток L929 (50 мкг белка) фотгоэффинно метили после добавления РзА4(з Р)рСр (30000 расп,/мин. 3000 Ku/ììîëü) в отсутствии или в присутствии истинной РЗА4 (1 х 10 М).

PHKasyL из экстрактов ОКПКот нормальных индивидуумов (100 мкг белка) очищали от

2-5А кор-целлюлозе и фотометиле после добавления РзА4(згР)рСР (30000расп,/мин, 3000 Ku/ììoëü). После 90 мин инкубации при 0 С образцы переносили на охлажденные во льду фарфоровые капельные пластины и фотомуировали 3 мин, используя 254 нм UVC — 11 Minerallght лампу (Vl)ravtotet

Products) на расстоянии 2 см (1 3/м . Определяли положение маркерных белков и

РНКазы c Mr 80000.

Исследования с фотомечением выявили, что РзА (Р)рСр ковалентно пришиваетзг ся к белку с Mr 80000 в экстрактах ОКПК от здоровых людей (данные полиакриламидного геля не приведены). Однако меченив белков отсутствовало в экстрактах ОКПК от хронически инфицированного вирусом пациента, При тех же экспериментальных условиях в экстрактах клеток L929 специфически фотометился белок с Mr

80000. Добавление РзА4 (1 х 10 М) к инкубационным смесям, содержащим

РзА4(P)pCp предотвращало фотомечение, зг т.е, обеспечивало дополнительное свиде17

2001917

20

30

55 тельство, что фотомечение было высокоспецифично к РНКазеб, Исследования с фотомечением белка, очищенного иэ экстактов

ОКПК от здорового человека корцеллюлозным методом, выявило ковалентное связывание с белком с Mr 80000, который был способен деградировать поли/У/, но не поли/А/, поли/Ц/ и поли/Г/ в присутствии истинной 2 — 5А (табл, 4). Сведенные вместе эти результаты доказывают, что белок очищен от ОКПК здоровых индивидуумов и мечен РзА4(P)pCp.

После 4-17 недель терапии ложноспаренной отРНК активированная PHKaaaL впервые определялась в экстрактах ОКПК от всех пяти хронически инфицированных пациентов; от 17 до 28 недель терапии ложноспаренной отРНК активность активированной РНКазы для всех пяти пациентов была эквивалентна уровням РНКазы, наблюдавшимся у здоровых индивидуумов (табл. 1, колонка 7). Уровень активированной РНКазы показывал очень тесную корреляцию с концентрацией функциональной 2 — 5А. выделенной из тех же образцов (табл, 1, в сравнении с колонками 4 и 7), Крайне интересно, что пациент

1 поддерживал повышенный внутриклеточный уровень 2 — 5А и полностью активированную РНКаэу на 28 неделях 3 неделями позднее того, как терапия ложноспаренной . 9тРНК была прервана (табл, 1, колонки 4 и 7).

Описанные здесь эксперименты показывают, что пять ВИЧ-инфицированных пациентов имеют общий молекулярный фенотип в одноядерных кровяных клетках, сниженный уровень 2 — 5А и отсутствие определяемой активности РНКазыб. Одноядерные кровяные клетки здоровых людей проявляли фенотип, отличный в том. что уровни 2 — 5 были в среднем выше и активность РНКаэы была легко определяема.

Последний фенотип больше сочетается с тем, что ожидается от функционального пути 2-5А синтетазы (РНКазы ). У нормальных индивидуумов неизменное состояние пула

2-5А — измеримое; заметная часть этой внутриклеточной 2 — 5А может стать тесно ассоциированной с РНКаэой, т.е, активируя

РНКазу . В экспериментальных процедурах установлено, что в одноядерных кровяных клетках хронически инфицированных вирусом людей внутриклеточные уровни 2-5А ниже детектируемых и отсутствует активируемая РНКаза(, как определено доступными в настоящее время способами.

Важное открытие здесь то, что дефекты в пути 2-5А синтетаза/РНКаза были исправлены терапией ложноспаренной отРНК.

Результаты не объясняются прост< нормальными уровнями белка РНКаэыб без 25А, поскольку активность РНКазыЕ In vitrc не была восстановлена добавлением 2-5Л к экстрактам ОКПК. Белок РНКазы1 должен отсутствовать или быль ингибированным, Это подтверждается потерей связывания фотоаффино меченного аналога 2-5А. У обработанных пациентов уровни PHK ВИЧ уменьшались в ОКПК эа 10 — 20 дней, количество инфекционных центров (кокультивация) падало более медленно, Увеличение внутриклеточной 2-5А и активности РНКАзы(более близко соответств