Способ лечения больных с опухолями

Способ лечения больных с опухолями

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(21) 4356180/14 (22) 26.07.88 (46) 30.11.93 Бюл. 443 Н (71) Хам Рисерч, Инк. (0$) (72} Рилльям Р1. l- ЬтХ (: ОПУХО-ЛЯМИ (57) Использование: в медицине, а именно в химиотерапии злокачественных заболеваний. Целью изобетения является повышение "-ффективности llp48нии Сущность изобретения: вводят Амплиген в количестве, достигаютдем 50 — 300 мг на ул крови сразу же после введения лекарства, в сочетании с интерфероном или раздельно. Положительный эффект заключается в получении ряда положительных результатов при лечении больных с опухолями.

2003334

Изобретение относится к использованию двухнитевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) отдельно или в комбинации с лимфоклинами для подавления пролиферации опухолевых клеток в теле животных и человека, коррекции нарушений в опухолевых и ра«овых клетках в теле животных и человека. и воздействия на нарушения иммунной системы, возникающие из-за предрасположенности некоторых организмов к опухолевым или раковым заболеваниям независимо от того, возникают ли они под действием генетических факторов или факторов окружающей среды. Изобретение относится к использованию PHK в комбинации с другими химическими и биологическими агентами для подавления воздействия этих факторов, 1. Интерфероны (ИФН) составляют,"". класс протеинов, способных ингибировать репликэцию вирусов в животных клетках.

Они имеют клеточную природу, могут быть продуцированы in vitro или ln vlvo и стимулируются большим количеством веществ (The Encyclopedia of Biochemistry, еб. by

Roger Nlitllams and Edwin Lansford, Reinhold

Publishing Company, 1967). ИНФ известен своим как противоопухолевым, так и противовирусным действием (Nature 262, 300, l978). способностью восстанавливать контактное торможение и подавление роста в полужидком агэре опухолевых клеток.

Двухнитиевые РНК являются индукторами различных молекулярных форм человеческого ИН Ф трех типов: альфа (лейкоцит), бета (фибробласт) и гамма (иммунный), которь1й может быть стимулирован обеими натуральной и синтетической двухнитиевыми РН К. Использование синтетической двухнитиевой РНК для образования комплексов полирибоинозиновой и полирибоциъидиловой кислот (дальше они обозначены как ri„rCn или иоли-iC) как индукторэ интерферона известно, например, из патента США М 3666646, выданного Lampsonet

al, Кроме своей роли как ИФН-индуктора, двухнитиевая РНК является активатором двух ИФ.Н-индуцируемых ферментов: протеинкиназы и 2-5-олигоаденилатсинтетазы (Proc. Natl. Acad, Sci,, 75, 5893, 1978). Молекулярные основания для антипролиферативного и противоопухолевого действия интерферонэ и их связи с двухнитиевой РНК до настоящего изобретения не были известны, кэк и антипролиферативные свойства двух нитиевой РНК, следующие из.ее роли как ИФН-индукторэ.

2, Синтетические "несовместимые" аналоги двухнитиевой РНК, Совсем недавно было обнаружено, что

ИФН может быть индуцирован также несовместимыми аналогами rln rCn. как описано в патентах N. 4130641 и N. 4024222. ".ыдан- . ными Т ЭО и Carter. Эти аналоги образованы модифицированными rln rCn для включения непарных оснований (урацила или гуанина) вдоль полирибоцитидилвтной (гСл) цепи или модифицированным позвоночным рибози10 лом полирибоинозиновой кислоты (rln). Несовместимые аналоги, особенно те, что модифицированы в rCn-цепи, сохраняют способность индуцировать ИФН так долго, насколько это отвечает структурным требо15 ваниям.

Длинные участки спаренных оснований двухнитиевой PHK. не являются необходимыми для индуцирования интерферона. Действительно, необходимым условием. для

20 синтеза быстро действующих интерферонов является сохранение 1/2 — 1-спирального витка сггаренных оснований двухнитиевой .

РНК(днРНК).

Увеличение скорости гидролиза отмеча25 лось,. когда несовместимые полимеры подвергались действию нуклеазы (J.Molec. Biol.

70,567, 1972), однако зти двухнитиевые РНК были почти также активны, как и немодифицированные г1л ICn, исходя из индукции

30 интерферона. Предполагалось, чтодлительное сохранение интактной двойной спиральной структуры может быть ответной для многих других биологических реакций на

РКН, обычно отмечаемых как лекарственйая

35 токсичность. Исследования "несовместимых" аналогов: rln r(Ci>-i4)n Arnpiigen зарегистрированного товарного знака of

HEM Research, 1пс„йосйчйе, 10852, CUBA, в различных животных системах показали, 40 что rln r (Ci>, U)n менее токсичен, чем rln—

rCn (см, Поли-1С с "несовместимыми" основаниями, исследования по терапии рака in

augmenting agents in Canar Therapy ео тео

Е.М.Н г е а1, Ра е Р е, Нью-Йорк, 177, 45 1981). В частности, повторное введение мышам rin r(C12, U)n показало еще меньшую токсичность по отношению к таким чувствительным органам, как костный мозг позвоночника. клетки печени, тимоциты, спленоциты (J.Molec. Biol., 70, 567, 1972), поскольку эффективность защиты против заражения разновидностью летального вируса сохранялась (Motec. Pharm, 12, 299, 1976).

Кроме того, rln r{C>>->e, U)n показывает

55. уменьшение {100-кратное уменьшение) пирогенеза по отношению к rln rCn у кроликов, снижение митогенеза (5-19-кратное уменьшение) мышиными и человеческими клетками in vitro и уменьшение образования

2003334 дцРНК-антител (5 — 10-кратное уменьшение) у кроликов и мышей. На фоне этого снижения клеточной токсичности rl r(C11-14, U)n сохраняет свою способность индуцировать интерферон, стимулируя функции клеток

"натуральных убийц" (НУ) (J.immunology, 124 1852, 1980) и активируя указанные внутриклеточные медиаторы 2 - 5 -олигоаденилатсинтетазу и специфическую протеинкиназу.

Поэтому очевидно, что в различных контрольных системах (кролик, мышь и человек) и при различных схемах дозирования измерения токсических и терапевтических эффектов показывают, что "несовместимый" аналог rl> °

r(C11-14, 0),(АгпрИдеп) имеет усилейныйтерапевтический индекс. Приготовление и получение этого индуктора/активатора описаны в J.Мо!ес. Biol.. 70, 567, 1972), Использование модифицированных

rt> rC>-аналогов с единственной целью индукции интерферона в животных клетках для противовирусного действия описано в патентах CLI!A N. 4130641 и М 4024222. Однако что касается их использования как противоопухолевого агента, то недостаток

ИФН-терапии (как и. других лимфокинов, вводимых в чистом виде) заключается в том, что она имеет лишь маргинальный эффект во многих организмах. В результате относительно большое количество лимфокинов, необходимое для введения ворганизм,,приводит к неестественно высокому уровню накопления лимфокинов в нем, которое не могло бы быть генерировано самим организмом в процессе нормальной ответной реакции человека на вирусную инфекцию, иммунной клеточной дифференциации или естественного механизма иммунозащиты против раковых, вирусных и других поражений, При таких высоких уровнях лимфокинов организм реагирует на них как на чужеродные тела и обладает способностью генерировать против различных лимфокинов типа ИФН-антитела. Образующиеся в результате этого антитела уничтожают остаточн ы и тера певтический полезный эффект.

Кроме того, неопластичные клетки, в частности, способн ы вы ра батые ать устойчивость к терапевтическим свойствам различных лимфокинов типа ИФН и других членов семейства лимфокинов, Как будет показано в дальнейшем, эта способность неопластических клеточных линий вырабатывать устойчивость к ИФН достигается не случайным фенотипом, поэтому это служит некоторым препятствием терапевтическим методам, предиазначенным для ингибирования полиферации. основанного на использовании лимфокинов в чистом аиде, Настоящее изобретение устраняет недостатки при использовании укаэанных те5 рапевтических средств благодаря открытию новых антипрофилиративных агентов и их составов, которые останавливают или значительно замедляют рост раковых клеток независимо от того, вырабатывают ли эти

10 клетки устойчивость к лимфокинам. Кроме того, в предлагаемом способе даны составы, содержащие интерферон, в которых степень содержания его хотя меньше в 20 — 50 раз, чем в описанных применениях, тера15 певтическая эффективность, достигаемая средствами, описанными в изобретении, не меньше, а даже больше. Так как составы, описанные в предлагаемом способе, содержат .синергетически действующую днРНК, 20 то терапевтический эффект от днРНК соответственно болев высокий, чем тот, что был описан в.иэвестных изобретениях, и действительно оказывал терапевтическое воздействие на опухолевые тельца костного матрикса, опухоль которого известна своей устойчивостью. к воздействию экзогенных лимфокинов, когда они используются в мономодальной терапии.

3. Клетки — "натуральные убийцы" как иммунозащитный противоопухолевый механизм.

Было опубликовано множество статей в поддержку главной роли популяции клеток - "натуральных убийц" (НУ) в иммунозащитном механизме против неопластических клеток. Мыши с высокой активностью НУклеток более устойчивы к опухолям с НКвосприимчивыми опухолевыми клетками, чем мыши с низкой активностью НУ-клеток (1пипцпо1. Rev., 44, 165, 1979). С57В1/6 бежевые мыши, которые были отобраны на

НУ-клеточный дефицит, показали более высокую восприимчивость к опухолевому росту, чем изогенные мыши с нормальной

45 НУ-клеточной активностью (Nature (Land,)

284, 622, 1980; Nature, 284, 624, 1980). Подобная ситуация наблюдалась у людей с синдромом Чедиака-Хигаси, предполагалось, что НУ-клеточный дефицит при этом заболе50 вании может стать причиной дальнейшего развития у этих больных лимфомой (J, Ехр.

Med, 151, 1039, 1980; J. Exp. Med., 151. 1049, 1980, Nature (Lond), 284. 553, 1980). Бол ьн ые с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) отпи55 чаются более высокой частотой метастазирования, Zlegler и ЕагПп1 (int. J, Са сег, 27, 321, 1981) оценили НУ-клеточную активность в лейкоцитах, взятых от пациента с хронический лейкозом после удаленл лейкозных клеток, Важно отметить, imari гюль2003334 шинство пациентов, страдающих ХЛЛ, имеют минимальную или не поддающуюся обнаружению НУ-клеточную активность несмотря на присутствие лимфоцитов, связанных с НУ-восприимчивыми клеточными объекта- 5

«ми. Кроме того, реципиенты с пОчечным аллотрансплантантом, которым назначались. высокодоэированные иммунодепрессивные лекарственные средства, имели в 100 раэ больший риск злокачественного развития 10 болезни, у них отмечалась также предельно сниженная или полная потеря НУ-клеточной активности (Тгапзр1апюбоп, 29, 214, 1980). Напротив, опосредованные ан ителами клеточная цитотоксичность(АССС) у этих 15 реципиентов не подавлялась. Иэ этого сле; дует, что дефицит иммуноклеточной активности является. специфическим, и если он существует, то влечет за собой серьезную

20 сикергический и потенцирующий эффект относительно антипролиферативного воздействия.

Например,. использование "рассогласован- 30

40 вательно, они обладают слишком малым риском развития у них антител против 45

55 предрасположенность к злокачественному развитию/рецидиву болезни;

Настоящее изобретение содержит множество открытий, одно из которых заключается в том, что, если даже опухолевые клетки обладают ИФН-устойчивостью, использование специфических лимфокинов в сочетании с "несовместимой" дцРНК дает в результате ной" дцРНК в чистом виде или в сочетании с лимфокинами в организме, которые показывают лишь маргинальную реакцию на мономодальное воздействие лимфокиками, дает в результате усиление антипролиферативного/иммуномодулирующего эффекта дцРНК помимо того, который наблюдается при использовании в терапии дцРНК в чистом аиде. К тому же для многих индивидуумов терапия лимфокинами, например ИФН, представляет собой приемлемый метод лечения, т.е. эти пациенты не нуждаются в излишне высокой дозировке И Ф Н и, следолимфокинов или появления у них побочных эффектов на введение лимфокинов, так как эти побочные эффекты непосредственно зависят от дозировки лимфокинов. 8 этом смысле дцРНК усиливает действие лимфокинов и при этом придает методам ИФН-терапии большую эффективность. Поэтому терапевтические методы и составы, рассматриваемые в этом изобретении, улучшают существующие уже методы, основанные лишь ка лимфокинах, а также дают возможность применять эти методы к тем пациентам, которые по тем или иным причинам не могут воспользоваться известными.

В предпочтительном осуществлении этого изобретения дцРНК представляет собой "несовместимый" аналог rln гСп, Как указывалось, этот аналог является результатом разрыва той или иной цепи непарными основаниями, т.е. они не являются парными основаниями Уотсона-Крика, типа урацила и гуанина. Эти "несовместимые" аналоги являются предпочтительным осуществлением предлагаемого изобретения из-за того факта, что они сохраняют антипролиферативные действия немодифицированных rln rCn и в то же время обнаруживают значительное снижение тенденций к быстрому возникновению побочных эффектов, таких как повышение температуры, гибель неспецифических клеток, т,е, гибель нормальных клеток организма, и антигенность. Кроме того. обнаружено, что специфический несовместимый аналог

rln г(С»-i4, U)n дает сенсационный эффект, даже больше того, который уже описывался, в связи с антипролиферативными способно- ° стями типичной дцРНК типа rln гСр. В час тности, это позволяет в некоторых случаях исправлять дефекты в опухолевых клетках так, что они перепрограммируются и функционально преобразуются в нормальные.

Заявитель фактически отделял раковые клетки от пациента и неоднократно наблюдал это явление. Помимо этого, обнаружено, что Аптрйдеп может эффективно действовать как агент, кррмализующий раковую клетку, в тех ситуациях, когда существуют препятствия для использования лимфоки5 нов, Известно, что некоторые химические и биологические вещества обладают способностью к независимой нормализации раковых клеток, "Несовместимая" дцРНК, а именно rln r(C»-14; 0), расширяет эти возможности в нормализации раковых клеток, в то время как лимфокины часто оказывают противоположное действие, т,е. снижают или уничтожают процесс нормализации.

Кроме того, данное изобретение дает воэможность корректировать иммунные нарушения, выражающиеся в предрасположенности к раковым заболеваниям вследствие наследственных факторов или нарушений в иммунной системе, Эти свойства, очевидно, 0 ке относятся к действию ИФН, лимфокика, скорее всего Igx можко приписать действию

"кесовместимой" дцРНК на раковые клетки качественно иным способом, чем это делает лимфокин.

Эти терапевтические составы и методы применяются для лечения рака, опухолей и неопластических клеток, Лечение в этом контексте является термином, означающим профилактику рака, задержку в развитии

2003334

5

20

35 ао

55 опухоли (частично или полностью), устранение опухолевых рецидивов, перерождение опухолевых клеток в нормальные, коррекцию связанных с раком иммунных дефектов и обеспечение необходимой защиты от действия вирусных инфекций, а также различных аутоиммунных реакций на воспалительные

СОСТОЯНИЯ.

Важно отметить, что данное изобретение применяется не только для лечения опухопе рака, после того как они клинически обнаружены, но и превентивно для предотвращения малирйэации нэ ранней стадии проявления илФ- субклинического течения болезни,.т.е. предраковое состояние может длиться довольно долго, перед тем как появятся видимые признаки болезни, требующей терапевтических методов лечения.

Настоящее изобретение предназначено также для предупреждения рака, перед тем как он достигнет клинической стадии, например, в организмах, имеющих высокую степень наследственной предрасположенности к раку. Другими словами, рак можно представить как часть биологического континуума, который может существовать довольно долго, ранние стадии которого можно рассматривать просто как предрасположенность. Изобретение рассчитано не только для лечения клинического рака, но и позволяет использовать его превентивно задолго до появления видимых признаков болезни.

Целью изобретения является повышение эффективности лечения.

В способе используются терапевтические средства и методы для модуляции опухолевых клеток в сторону их нормализации и потери их злокачественного фенотипа путем введения экэогенной "несовместимой+ дцРН К в опухолевые клетки. Такими методами, например, являются введение "несовместимой" дцРНК и увеличение внутриклеточного уровня дцРНК. Опухолевые клетки, не реагирующие или мало реатирующие на лимфокины, становятся таким образом реактивными. Введение дцРНК можно осуществлять совместно с лимфокинами. Особенно поразительного эффекта можно достичь в передаче клеткам медленно развивающихся опухолей способности реагировать на антипролиферативное действие на них интерферона.

Как было отмечено, многие организмы не обладают удовлетворительной ответной реакцией на канцеротерапию. Основанную на применении ИФН в чистом виде. Следовательно, высокий уровень дозировки, необходимый для результативного эффекта для таких больных, может развить устойчивость организма к производству внутри себя естественного ИФН. Кроме того, тот факт, что резистентность иного вида может быть также развита неопластическими клетками в виде неслучайно приобретенного фенотипа, придает первостепенную важность в понимании значительного угучшения терапевтических методов и средств, полученных в настоящем изобретении, по сравнению с теми методами, которые использовались для подавления у больных опухолевой пролиферации путем применения лишь одного ИФН, Введение ИФН и какой-нибудь дцРНК. т.е. с парными основаниями или "несовместимыми, при осуществлении этого изобретения проводится в "сочетании", в котором оба агента вводятся либо вместе как терапевтическая смесь, либо отдельно, но одновременно, как бы отдельными системами для внутривенного вливания в один

Организм. Использование в "сочетании", кроме того, включает введение этих лекарственных средств отдельно, при котором одно из ниэ дается сначала, а второе — вскоре после первого. Все три из этих осуществлений изобретения имеют свои преимущества.

Раздельное, но одновременное введение их, например, позволяет Осуществлять независимый контроль над каждым агентом и получить оптимальное средство для каждого пациента.

Раздельное введение позволяет для чистого ИФН восстановить маргинальное действие на клетки, которое расширяется использованием дцРНК. Приготовление

ИФН и дцРНК как смеси дает быстрый доступ к этому терапевтическому средству при условии, если заранее определить ее оптимальный состав. Ранее были даны комментарии ко всем случаям, рассматриваемым в настоящем изобретении, включай формулу изобретения, где один терапевтический агент вводится в "сочетании" с другим;

Аналогично этому терапевтические агенты и их смеси, рассматриваемые в способе, могут вводиться в организм путями, обычно используемыми и известными в медицинской практике. Один иэ них — внутривенный, но существуют и другие; внутримышечный, подоболочечный, внутричереп ной и внутрибрюшинный.

Лимфокины имеют в своем составе: интерфероны {альфа, бета, гамма), предпочтительно эльфа, интерлейкины, специфические интерлейкины {1, 2 ипи 3) и рекомбинант интерлейкин-2 (rtL-2), опухолево-некротический фактор PNF). Сюда относятся также

2003334 активизированные лимфокином клетки

"убийцы" (LAK), образующиеся в организме в результате ответной реакции на действие ли 1фокина.

Если интерферон (альфа) используется, как лимфокин, то необходимое количество его составляет от 0,01 до 10000 ед. IR на мл жидкости человеческого тела. Если IL-2, а лучше rlL-2, является лимфокином, то вводимое количество должно составлять от 10 ед.

IL-2 на кг веса человеческого тела до величины, приближающейся к неприемлемому для пациента уровню токсичности, вплоть до 10 ед. И:2, Однако зти пределы — от 10з до 10 ед. IL-2 на кг веса тела человека.

Если оба агента дцРНК и лимфокин вводятся в сочетании, как было описано, то они могут быть введены в смеси, отдельно, но одновременно или один за другим. .;Ф

Если лимфокины и дцРНК вводятся в сочетании, то дцРНК может быть введена в количестве, которое приводит к уровню от

1-1000 мг дцРНК на мл жидкости в организме, т.е. раствора сыворотки, солей. витами-. нов и т.д., циркулирующего в организме.

Например, введение состава, содержащего

10 мг дцРНК в организм весом 1б0 стоун (72,4 кг), дает в результате степень содержания Р Н К около 1 мгl мл. Аналогичным образом количество интерферона при введении дцРНК вЂ” ИФН составит уровень в пределах 1-100000 ед, ИФН на мл жидкости в организме, Способ введения этого сочетания, как было описано, может быть выполнен следующим образом: в качестве смеси, отдельно, но одновременно или один за другим. Все дело в том, что введение этих агентов дает синергическое действие, в каком бы практическом воплощении этого сочетания их ни брать.

Под "несовместимыми" дцРНК подразумева отся те дцРНК, в которых водородные связи (упаковка оснований) между двойными спиралями относительно интвктны, т.е. они прерываются в среднем меньше, чем одна пара оснований в каждом 29 последовательном основном остатке. В соответствии с этим и следует понимать термин

"несовместимая" дцРНК, дцРНК может быть комплексом из полиинозината и полицитидилата, составляющих пропорцию оснований урацила и гунадина, например, от (1-5) до {1-30) (поли Поли (С4 — Сгд к х > 0 или G). С другой стороны, соответствующие олигонуклеотиды (малые нуклеотидные фрагменты) могут быть соединены с соответствующими комплементарным полинуклеотидами или олигонуклеотидами при некоторых обстоятельствах.

25 00ли (l) пОли (С4, 0) поли(!) поли (С7, U) поли (!) ЛОли (С)з, U) поли (!) поли (Сгг, 0) поли (!) поли (Сго, 6) поли (!) поли (Ср) 23 С > р.

Количество "несовместимой" дцРНК .вводится до статочно для достижения пика концентрации крови от 0,01р r на мл дцРНК до 1000р г на мл дцРНК в системе кровооб35 ращения вскоре после введения.

Как было установлено, в предлагаемом способе лучше всего использовать дцРНК типа rl> rC(Ct1-14, U)> для ингибированйя неопластических клеток, Было отмечено, что

40 "несогласованная" дцРНК дает более слабый фармацевтический эффект по сравнеwe с дцПНК, имеющей парные основания.

Была исследована также активность других типов ИФН помимо ИФН-фибробласта, 45 включая естественные человеческие лейкоциты и ИФН, продуцируемые в бактериях, при помощи ДН К-рекомбинант-технологии (rlFN). Bo всех случаях ИФН оказывают более слабое действие на опухолевые клетки

50 человека, когда они вливаются в чистом виде, чем когда они вливаются вместе или последовательно в нормальной или

"несогласованной" PHK. Максимум уменьшения человеческой опухоли составлял 33%

55 по ширине при впрыскивании ИФН концентрации 10 -3 10 ед. ежедневно, Напро5 . 6 тив, у животных, подвергнутых введению

ИФН в сочетании с дцРНК в количестве уже

10 ед. ИФН ежедневно, наблюдалось умень30 дцРНК может быть представлена основной фоРмУлой г!л ° r(C11-.!4, U)n и, в частности, г! (Сц, 0)л. Другие приемлемые примеры дцРНК обсуждаются ниже.

5. Несовместимые" дцРНК, наиболее подходящие для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных из поли (Сл, U) и поли (Сл, G), где и — целое число, принимающее

10 значения 4-29, и являются "несовместимыми" аналогами комплекса соединений полирибоцитидилата (гСл), например, образованного посредством включения остатков

2-О-метилрибозила. Эти "несовместимые"

15 аналоги rl" гСП, наиболее предпочтительным из которых является rl> . (C12, U)n, описаны

Carter и Тз о Ь патентах CLUA N. 4130641 и

t4 4024222. дцРНК, описанная там в общих чертах, является наиболее походящей для

20 использования в изобретении.

Определенные примеры "несогласованных" дцРНК для использования в настоящем изобретении включают:

2003334 i-4 шение опухоли на 65 7 больше у1-1еньше!!31я человеческой опухоли, Б соответствии с этим л!1РН К, применяемая в сочетании каким-либо одним видам ИФН, дает в результате качестве!Гно более высокий эффект. Кроме тога, челане(!еск31е ОГ!ухали требуют индивидуального ре>кима лечен31я для получения оптимального терэпенти !ескога эффекта, В дальнейшем усилия по инд«видуэлизации схем лечения привадяг к ожидаемому 10-кратному увеличени!о терапевтического эффекта там, где "несовместимая" дцРНК применяется в сочетании с

ИФН. Данные убедительно паказыва!От, что днРНК расширяет терапевтическую эффективность всех фарм ИФН, включая натура":üну!а, синтетическую и гибридную формы типа полученных частична из альфа, бета и гамма-И Ф Н. Б соответствии с этим сочетание днРНК. особенно "несагласаван !0А дцРНК, а именно Г4 г(С 1-и, U), с ИФН входит в технологию приготовления сильнаiI ..!ну още!о лекарства против рака, !!амного превышающего возможности чистого

ИФН. Кроме того, при изучении структуры человеческой опухоли становится очевидным, что содержание в ней различнога типа вирусной генетической информации безусловна вносит свой гклад в злокачественные и/«ли патологические процессы в человеческих тканях, являющихся причиной их нарушения «болезней. Поэтому важно, чта комбинация дцРНК вЂ” ИФН являетСя.не только противоопухолевым агентом, наи таким же эффективным средствам против вирусных 60лезней, Действительно, терапевт«ческис смеси, описанные в этом изобретении, будут эффект«вны против болезней, для которых показано лечение ИФН, включая вирусные заболевания в острой, подострой, лате!!тнай и хронической стадиях, а также заболевания, сняззннь!е с нарушением иммуннойl с«сте!.1ы, но которые могут исчезнуть при восстэ!!Овлсни«эутоиммунной защиты, Важно подчеркнуть, что роль дцРНК в с«нерплстическом усилении эффекта лечени при использован«и соединения дцРНК вЂ” ИФН не в то!л, что аиэ сти!лулирует ИФН, иначе этот синсргизм не набл!Одался.бы. Скорее всего

"несав!лест31мая" ДцРНК нносит специфическ«й в!лэд, который дополн лет действие VI<3 Í, делая его более пласти !3!ым и эффективным, чего нсльзя было бы добиться, используя при

ne«eн«31 раковых или flирусных заболеваний то!!ька 1 ФН или ДцРН К GTpeilbHO.

Были проведены наблюдения I;eK0Toрых пациентов с раком легких и пациентов с высоко« степенью наследственной предрасположе!!ности к раку, у всех отмечался расположенности к раку.

20 Далев приводятся примеры, поясняю35

5

5 низкий уровень активности НУ-клетак. ЗТ31 наблюдения описаны ниже. Было проверена, можно ли у пациентов с высоким наследственным факторам риска восстановить

НУ-клето ну!а а с1инность до нормальнога уровня при помощи добавок различных типов ИФН и/или "несовместимых" дцРНК.

Работы, появившиеся в последнее время, показывают расхажде !ие в эффективном увеличении НУ-клеток(клетки были взяты от нормальных организмов) среди натурал ьных типов (Bflt, J. Мае1п., 50, 85, 3982) и клан1лрованных падтипав интерферона (Can,-Res, 42, 3312, 1982), Было отмечено, чта "несовместимая" РНК имеет более ярка вы раженную способность к рестабилизации нормального уровня НУ-клеток у пациентов с высокой степенью наследственной предщие настаяшее изобьете ие, все доли и процентное содержание в которых берутся от веса, дцРНК (" несовместимая" ), которая используется в примерах, имеет

ФОРМУЛУ Г4 Г(С11-1Л, Цл, ИНОГДа ИЗВЕСтная как I ln (С12, U).

А, дцРНК вЂ” ноный механизм модуляции

ОП Xoilсй, Новый механизм модуляции опухолей посредством "несовместимой" дцРНК нс является лишь часть!о основного механизма-действ !я лимфокинов, Настоящее исследование демонстрирует широкие основания для использования при модуляции отклоненных оТ !!Ормы клеток человеческой опухоли, причем механизм этой модуляции отличается от !1еханизма, действующего при индуциравании ИФН. 0 частности, дцРНК-индукция ц«клическаго аденозинмо-!!офосфата (САМР) была обнэруж-..нэ в клетках, известных своей нечувсп ительностью к альфа-интерферону. Эт31 исследования были проведены с двумя cAMF киназаингибиторами, обознзчснны!1и как Н-7 и Н!Д "!004 (известные !.1етабали lccKI1е !1нг31б! ITopb! протеинкиназы С

31 сА (ь П к 31 н а 3 ы}, д л я Оценки и О н О Й f1 p QT! 1 B o" апухаленай мадулиру!О!Дей экт31лности несовместимой дцР! 1К в BI!äe резистентности к Одном одал ьнай л!лмфак«н-терап и и, использующей альф.-интерфсрон как прототип лимфокина. Для демонстрации

"несанмсстим031" ДцРНК не прОвОД«лось индуциравания нтерферанэ в ИФН-нечувстни тел ьн,lx клетках, для э ГОГО клетки человеческой Глиомь! (Опухали мОЗГа} (д 235} были обработаны дцРНК за различные промежутки времен«от "до 8 ч. ДцРНК удалялась и добэвля:!ась свежая среда в течение 24 ч, зато!и ти Гры и н т арфе рО !!э (РД, И Ф Н /мл) 2003334

16 щи использования антител к интерферону, который при его наличии в клетке был бы связан с антителом, антипролиферативный днРНК- вызванный эффектуменьшился бы, 5 Использовались три типа антител к интерферонам (альфа, бета, гамма) в 240 нейтрал. ед./мл и контрольные клетки. Анализ на ингибирование опухолевого роста был выполнен s соответствии с описанием Hubbell et

10 аЬ. Cancer Res. 44:3252-3257 (1984). Процентное содержание контрольной культуры антител было подсчитано следующим образом: е åêì О „1M контрольные клетки ч — контрольные клег ч глиомы, который может быть непосредст- 20 вают противодействие противоопухолевому 25 действию дцРНК, как это показано в табл. 3. дцРН К в чистом виде "работает" на уменьше- . 30 ние процента контрольных клеток, наличие

40

50 проверялись на цитопатический эффект (Flnter. N.G., J., Gen vlrol. 5: 419-427, 1969).

Результаты приведены в табл. 1, где нижний предел обнаружения составил 5 ед. ИФН/мл, Из этого следует, что дцРНК не индуци,ровала интерферон в этих нечувствительных к ИФН клетках.

Затем подобные клетки были подверг. нуты подкрепляющей проверке для того, чтобы определить, играет ли интерферон роль антипролиферативного действия s указанных клетках, вызванного воздействием на него днРН К. Это было сделано при помооб аботанные клетки 24ч — к (Х

Результаты представлены в табл. 2.

Эти.данные также. подтверждают, что дцРНК не индуцировала ИФН в исследуемых клетках.

Было найдено, что дцРНК индуцирует циклический АМР в клетках человеческой венно приписан кдцРНК, а не к ИФН-индукции в этих клетках, Три известных метаболических ингибитора: H-7, НА 1004 и коклюшный токсин — ингибируют или оказыБыл снова оценен процент клеточных культур для .получения низкого процента контрольных культур, как и в табл. 2. "Несовместимая" ингибитора увеличивает клеточную культуру

В табл. 3 показано противодействие метаболическими ингибиторами Н-7 и НА -1004 прот роопухолевому действию "несовместимой" дцРНК в клетках человеческой глиомы. Величины снова даны как процент контрольных клеток для дцРНК в концентрации от 0 (слепая проба или контрольная), 25 и 200 мгlмл.

Аналогичным образом ниже показано, как предварительная обработка клеток человеческой глиомы коклюшным токсином и нгибирует дц P HK-индуцируемую антипролиферацию. В табл. 4 дан процент контрольной культуры за 24 ч в клетках, предварительно обработанных коклюшным токсином в течеwe 4 ч до добавления дцРНК. Это показывает, что Н-7 и НА 1004 — два известных ингибитора оказывают минимальноедействие на опухалевае ингибирование в клетках, обработанных альфа-интерферанам, в та время как каклюшнйй токсин, имеющий, по-видимому, двухфазовое действие, не изменяет ингибирования опухолевых клеток альфа-интерфе- . роном при больших дозах и усиливает антипролиферационное действие в малых дозах.. . ИФН-альфа не увеличивает внутриклеточный сАМР-уровень в такйх же клетках на протяжении 24 ч, как показано в табл. 5. В этой методике клетки человеческой глиомы (А. 1235) подвергались действию интерферан.- альфа в количестве 0 (контр.), 250 и 1000 ед. ИФН/мл в течение 24 ч от начала эксперимента.

B этой таблице даны величины пмЬль сАМР/мг протеина; предел точности определения — 0,02 пмоль сАМ P/ìã протеина.

Внутриклеточный уровень сАМР определялся затем косвенным методом путем измерейия каталитической активности аденилата (пмоль сАМР, образованного за 15. мин) в клетках человеческой глиамы сразу после обработки их антипралиферативнай дозой дцРНК (25 и 200 г/мл) в течение 30 мин и 24 ч. В этой процедуре клетки обрабатывались "несовместимой" дцРНК, 25 (сплошной треугольник) или 200 (сплашнай квадрат),и г/мл "несовместимой" дцРНК, В соответствующей точке времени обработки (0,5-30 мин и 0,5-25 ч) среда была удалена,. а клетки быстро заморожены сухим льдом.

Активность аденилатциклазы в гамагенатах, полученных из клеток при воздействии ультразвука. была исследована методом

Jonng..et а! Molec. Enfocrlnol. 1:884-888, 1987. Клетки были сосчитаны в течение 24 ч для проверки антипралиферативнай активности, Индукция сАМР в дцРНК-обработанных клетках человеческой глиамы (A 1235} измерялась непосредственно как.пикамаль

2003334

18 сАМР на микрограмме протеина, результаты более 30 мин и более 24 ч. В этом методе

А 1235-клетки обрабатывались 25 (треугольники) или 200 (сплошные квадраты) р г/мл

"несовместимой" дцРНК. В соответствую- 5 щих временных точках среда удалялась и . внутриклеточный сАМР отверждался в 0,1

HO. Уровни сАМР определялись при помощи РИА-метода, как описано Relsine et al, J.Ceil. Biol. 102: 1630-1637, 1986. Уровни 10 сАМР в контрольных клетках и клетках, обработанных 1р г/мл днРНК, были ниже.границы точности обнаружения, Клетки считались 24 ч для проверки антипролиферативной активности. 15

Было замечено ярко выраженное увеличение сАМР после всего лишь 30 с действия дцРНК, этот уровень сохранялся в течение

30 мин.

Исследования подтверждают увеличе- 20 ние сАМР-уровня, что непосредственно связано с действием дцРНК, так что дцРНК не являлась ИФН-индуктором в используемых клетках. Антипролиферативные дозы днРНК индуцировали.активность аденилат- 25 циклазы через 30 с после начала испытания.

Аналогичным образом, внутриклеточный уровень сАМР .увеличивался в зависимости от антипролиферативной дозы через 30 с..

Предварительная обработка клеток коклюш- 30 ным токсином, а также ингибитора внутриклеточного сАМР с последующей обработкой дцРНК подавляет дцРНК-индуцированный опухолевый ингибитор, Напротив, антипролиферативные дозы натурального человече- 35 ского ИФН-альфа не увеличивают внутри клеточных cAMPóðîâíåé за 24 ч экспе-. римента. Кроме того, два известных ингибитора Н-7 и НА 1004 оказывают минимальное воздействие на опухолевое ингибирование в 40 клетках, обработанных ИФН-альфа, в То время как коклюшный токсин обладает, по-видимому, двухфазным действием, как было указано выше.

Исследуя сАМР-системы с ИФН-индуцированной пролиферацией (Pannlers et al, J. Cell Sci., 48:259, 1981, Banerjee et al, Virology 129:230, 1983, Ebsworth et al, J, СеП

Physlol. 120:146, 1984), обнаружено, что 50 сАМР не связан со степенью антипролиферующего состояния, Что касается дцРНК в этих же системах, то эти исследования ранее не проводились, Исследования, проведенные в настоящем изобретении, 55 подтверждают заключение, что а) днРНК и лимфокины, прототийом которых является

ИФН, имеют разные механизмы действия и в) дцРНК-индуцированная антипролиферация связана с сАМР-системой (в то время как лимфокины — нет).

В этом смысле сАМР является убиквитарной системой по существу, т,е. более или менее все клетки обладают генетической информацией, необходимой для синтеза сАМР при соответствующих стимуляторах.

Эти эксперименты показывают широкие воэможности для использования "несогласованной" дцРНК в модуляции отклоненных от нормы клеток, которые частично или полностью резистентны к ИФН или другим лимфокинам, применяемым в чистом виде.

Кромй того, эти результаты позволяют предположить, что "несогласованная" днРНК действует при помощи двух последовательных механизмов: первый посредством сАМР-киназы, второй посредством модуляции продеинкинаэы C.

В. Синтез протеина.

Внутриклеточный протеин изменяет в дцРНК-обработанных клетках рефлективную прогрессирующую дифференциацию и потерю фенотипа злокачественных клеток, противолимфокинных свойств.

Нормализация клеток после обработки днРНК в некотором смысле изучалась

Soslau et а1, Biochemical and Biophysical Research Communications, 119:941-948, 1984, Метод, в котором клетки опухоли головного мозга (А 1235) обрабатывались антипролиферативной дозой "несовместимой" дцРНК (100,и мlмл) или натуральным человеческим

ИФН-альфа (100 р м/мл), показал значительные различия в характере синтеза протеина в течение периода 72. ч. Синтез протеина является важным параметром, так как показывает нормализацию обработанных атипичных клеток и время продолжительности терапевтического действия, Синте