@ -аминофлуоресцеинтиокарбамил-n-(4-аминобутил)-2-амино-1- (l)-фенилпропанол в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанализа l-эфедрина

@ -аминофлуоресцеинтиокарбамил-n-(4-аминобутил)-2-амино-1- (l)-фенилпропанол в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанализа l-эфедрина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5019159/04 (22) 27.12.91 (46).15,1293 6юл Йв 45-46 (7S) Смирнов АВ; Еремин СА; егоpos AM„ Изотов

Б.Н. (73) Смирнов Алексей Витальевич (54) ВЕТА - АМИНОФЛУОРЕСЦЕИНТИОКАРБАМИЛ -М- (4-АМИНОБУТИЛ)-2-АМИНО -1(Ц-ФЕНИЛПРОПАНОЛ В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА

ДЛЯ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРОИММУНОАНАЛИЗА L-ЭФЕДРИНА (57) Испотьзование: в аналитической химии, в частности в качестве реагента дпя поляризационного

Сущность изобретении продукт — бета — аминофпуоресцепиокарб амид- N- (4-амин обутил) (В) RRU U(1Ц 2004543 Cl (51) 5 С07Р 311 86 G01NZl 64

-2-амино-1- (L)-фенилпропанол Реа гент 1:

N-(4-аминобутил) -(Ц-2-амино-1 -фениппропанол Реагент 2: Фпуоресцеинизотиоционат. Условия процесса: в среде метанола в присутствии триэтаноламина при перемешивании в течение 15 ч и температуре 4 С последующим хроматографическим выделением в тонком слое на пластинках

Силуфоп" в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота, взятых в соотношении 80: 20: 1. Собирают фракцию оранжевого цвета с R = 0,22 Целевой продукт элюируют метанолом с выходом 15%. Целевой продукт позволяет увеличить специфичность определения L-эфедрина в 26 раз при чувствительности анализа 92 10 м.

-в

2004543 сн-сн-нн-сн -сн -сн-сН -мн-с -нн

Q1 !1 он сн, ноо ви,ц

4 с н з оь но о

Данное производное,2-амина-1-фенилпропанола является специфичным реагентом для поляриэационного флуороиммуноанализа (ПФИА) L-эфедрина в биологических жидкостях. в частности, в моче.

Свойства указанного соединения в лит :>атуре не описаны.

Известные рвагенты (меченные антиге: ь ) для иммунохимического анализа пред: тэвляют собой ковалентно связанные аптеновые органические соединения с молекулой вещества, выполняющего роль детектора иммунохимической реакции, причем в качестве метки (детектора) используют радиоактивные изотопы, флуоресцентные молекулы. ферменты, Недостаток этих реагентов состоит в том, что они не являются высокоспецифичными реагентами для иммунохимического анализа эфедрина.

Наиболее близкий по структуре меченный антиген получают путем взаимодействия N-(4-аминобутил)-2-амино-1-()-фенилпропана с флуоресцеиниэотиоционатом в среде триэтиламина при комнатной температуре, Реагент специфичен для анализа метамфетамина, максимальная чувствительность 3,35х10 M. а процент перекрестной реакции с (L)-эфедрином составляет лишь

12 /0 при чувствительности 2,4х10 M.

Целью изобретения является синтез ковалентно связанного производного 2-амино-1-(L)-фенилпропанола с флуоресцентной меткой, которое может быть использовано для иммуноанализа (=эфедрина с более высокой чувствительностью и специфичностью. указанная цель достигается в результате взаимодействия флуоресцеинизотиоционата с М-(4-аминобутил}(Ц-2-амино-1-фенилпропанолом.

Получение флуоресцеин-меченного производного 2-эмино-1-(Ц-фенилпропанола осуществляется следующим образом. К раствору N-(4-аминобутил)-(L)-2-амино-1фенилпропанола в метаноле добавляют триэтилэмин и флуоресцеиниэотиоционат при еремешивании. Реакцию ведут 15 ч при

44 С. Р-аминофлуоресцеинтиакарбамил-N(4-аминобутил)-(L)-2-амино-1-фенилп ропаИзобретение отногится к новым химическим соединениям. конкретно к производным

2-амино-1-фенилпропэнола формулы нол выделяют хроматограо,ией в 1онхом слое на пл ктинкэх Силуфол".

Пример 1. Получение P-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)-(L)2-амино-1-фенилпропанола.

K раствору 7,0 мг (33 мкмоль) N-(4-аминобутил)-(L)-2-амина-1-фенилпропанолу в

100 мкл метанола добавляют 1 мл метанола и 100 мкл триэтиламина. Затем добавляют

6,0 мг (16 мкмоль) флуоресцеинизотиоционата. Реакционную смесь перемешивают в течение 15 ч при +4 С, Ре"-кционную смесь упэривают на роторе с металлом для удаления триэтиламина. Полученный продукт вы"5 деляют хроматографией в тонком слое на пластинках "Силуфол" в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота 80:20:1. Собирают оранжевую полосу с Ri 0,22, из которой полученное вещество элюируют 2

20 мл метанола, Выход Р-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)-(1 )-2-амино1-фенилпропанола составляет 15%.

Для подтверждения индивидуальности соединения приводим полные данные ИК- и

УФ-спектров.

Регистрацию ИК-спектра проводили на

ИК-фурье спектрофотометре "IFS-45", соединенном с YiK-микроскопом. Спектральный диапазон регистрации 4000-620 см разрешение — 8 см . Метанольный раствор исследуемого вещества наносили по каплям на окно из l

1612 (N-Н и СН полосы "Амид-2), 1454, 1400, 1254, 1180, 1111, 1042 (аром, С-Н), Регистрацию УФ-спектра снимали на спектрофотометре "Specord-M-40". Метанольный раствор исследуемого вещества, 40 наливали в кювету размером 10х45 мм, Данные УФ-спектра представлены в виде максимумов длин волн (нм): 293, 475, 491 (Е=8,78).

Пример 2. Определение 1 -эфедрина

45 с помощью реагентов на основе,8-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)

-2-амино- 1-(()-фенилпропанола, В пластмассовые контейнеры, помещенные в измерительную карусель с кюве50 тами, вносят по 50 мкл шесть калибраторов . L-эфедрина, пригоговленных на моче с добавлением 0,1 йайз, содержащие различные концентрации (мкгlмл): 0, 0,25, 1,0, 4,0, 10,0, 50,0. Разбавленную в 20 раз овечью антисыворо ку против эфедрина, раствор трассера -аминофлуоресцеигпиокарбамилN-(4-аминобутил)-2-амино-1-{1 )-фенилпропанол в концентрации 100 нмоль/л и фосфатный буфер для анализа, содержащий 1 г/л

2004543 бычьего гамма-глобулина и 1 г/л Иайз (рН

7,4), наливают в три отдельных флакона, установленных в одной специальной коробке.

Коробку с реагентами и карусель устанавливают в поляризационный флуориметр (ТДханализатор фирмы "ABBOTT" ), который автоматически выполняет анализ по заданной программе. По завершению анализа калибраторов L-эфедрина прибор принимает и сохраняет в памяти калибровочный график концентрация L-эфедрина (мкг/мл)— поляризация флуоресценции(МР).

Затем в пластмассовые контейнеры, помещенные в измерительную карусель с кюветами, вносят по 50 мкл анализируемых образцов мочи и прибор автоматически выполняет анализ, по завершению которого выдается количественная оценка содержания L-эфедрина в каждом образце (в мкг/мл).

Пример 3. Определение чувствительности анализа L-эфедрина в моче с помощью ,В-аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4аминобутил)-2-амина-1-(Ц-фенилпропанола.

Определение чувствительности анализа 1 -эфедрина в моче производят по методу

Родбарда. Для этого, используя обычную процедуру анализа, проводят 20 измерений поляризации флуоресценции (П.Ф.) нулевого стандарта. Среднее значение П.О, у=181,44, S.O.=-0,91. По уравнению Родбарда определяют у min: у mh1=y-тз(1/n 1/и}, где t — коэф Стьюдента при 95% доверительной вероятности;

s — стандартное отклонение; п — число повторов стандартов и образцов в анализе. у min=181,44-1,725x0,91(1/2+1/2)=181,441,725х0 91х1= 181,44-1,569=179,87 (MP), Из графика, построенного по точкам:

0 мкгlмл — 18 1,44 MP

0,25 мкг/мл — 157,18 MP находим, что 179,87 MP соответствует

0,016 мкгlмл L-эфедрина. Чувствительность определения -эфедрина в моче составляет 16 нг!мл или 9,2х10 M (молекулярная масса эфедрина — 174.2).

Пример 4. Специфичность/ -аминофлуоресцеинтиокарбамил-L-(4- аминобутил)2-амина-1-(Ц-фенилпропанола при анализе

L-эфедрина в моче.

5 Химические соединения, близкие к структурной формуле L-эфедрина (группа фенилалкиламинов), а также лекарственные вещества иэ различных химических фармакологически активных групп с концен10 трациями 50 и 100 мкг/мл в буфере

"искусственная моча" анализируют с помощью трассера Р -аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(4-аминобутил)-2-амина-1-(L)фенилпропанол в концентрации 100 нмоль/л

15 и разбавленной в 20 раз антисыворотки против эфедрина аналогично анализу L-эфедрина. Данные представлены в таблице.

Таким образом, предлагаемый реагент

Р -аминофлуоресцеинтиокарбамил-N-(420 аминобутил)-2-амино-1-(L)-фенилпропанол для поляриэационного флуороиммуноанализа L-эфедрина в моче по Сравнению с из-. вестным реагентом позволяет увеличить специфичность определения в 26 раз, чувст25 вительность определения L-эфедрина возрастает с 2,4x10 M до 9,2х10 М, при этом

-е процент перекрестных реакций других структурно-подобных соединений не превышает 5,7.

30 (56) Findiay I.N.À. Warren I.Т. Hill I.À. Wetch

R.M.//J. Pharm. Sci, 1981, т, 70. с. 624-631.

Патент США N 3996345, кл. 424-12. опублик. 1976.

35 Патент США N 4868132. кл. 436-546, опублик. 1989.

Мягкова М.A„лушникова M.Â., Полевая

О.Ю.//Судебно-медицинская экспертиза—

1990, N. 3, с. 30-32.

40 Eremln S.À., Gatlacher G., Lotey Н., Sml:h

D.S., Landon I,//Clln. Chem, 1987. т. 33, N 10, с. 1903-1906.

Eremin S.À., Zattchev ЯМ., Едогоч А.М., Ermaka А.N. Smlrnov А.В., Izotov

45 В.N.//Anal. Chem. Acta, 1982, т.227. с. 287290.

Rodbard et al.//Anal. BIochem, 1978, т. 90, т. 1-12.

2004543

Продолжение таблицы пе ек естной ак ии и и кон ент э ии, мкг/мл

Анализируемое вещество

П р и м е 4 а н и е. р Aìèíîôëóîðåñöåèíòèîêýðáàìèë-Й(4-аминобутил)2-амино-1-(Ц-фенилпропанол в качестве реагента для поляризационного флуороиммуноанвлиза L-эфедрина.

i Н-Ю -си -сн сз -юФ.С-@й

Формула изобретения -. oac3l 3

p - Аминофлуоресцеинтиокарбвмил- й-, (4-аминобутил)-2-амино-1-(Ц- фенилйропа-, нол формулы

Ю а в качестве реэгентв для поляризационного

5 флуороиммуноанализа -эфедрина.

Составитель И.Дьяченко

Редактор А,Самерханова ТехредМ.Моргентал Корректор С,Висина

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Заказ 3377

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

l.. б-, 1-Амфетамин

1-Фенолпропанолэмин

d-, 1-Фенолпропанолэмин

d-Фенолпропаноламин

Фенфлюрамин

Лэбеталол

Фентермин

1-Псевдозфедрин

d-Псевдозфедрин .

1-Нор псе вдозфедрин

d-, 1-Эфедрин

Тиранин

Мезатон .

Дизтилпропион

Адреналин

Нафтизин

Галазов ин

Изадрин

Астмопент

Морфин

Промедол

Хлордиэзепоксид

Фенобарбитал барбамил

Аминазин

Амитриптилин

Димедрол

Пэпаве ин

0,6

5,7

3,9

0.1

3,6

2,0

1,4

1,0

1,0

0,4

0,2

<0,1

<0,1

1,0

<0,1

0,2

0,3

<0,1

0,1

<0,1

0,1

<0.1

<0,1

0,3

1,5

0,3

0,4

0.1

0,7

5,1

3,4

<0,1

3,5

1,9

0,8, 1,1

1,2

0,3

0,2

<0,1

<0,1

1,0

<0,1

0,2

0,2

<0,1

<0,1

<0,1

<0,1

<0,1

<0,1

0,2

1,0

0,3

0,2