Штамм streptomyces virginae - продуцент антибиотика вирджиниамицина

Штамм streptomyces virginae - продуцент антибиотика вирджиниамицина

Реферат

 

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: новый штамм Streptomyces virginae ВКПМ S-1046 получен путем многоступенчатой селекции из природного штамма Streptomyces virginae АТСС 13161 под действием ультрафиолетовых лучей. Приведены морфологические и культуральные признаки, физиологические и биохимические свойства. Выращенные споры штамма культивируют на ферментационной среде в течение 22 - 24 ч при 25С. Штамм продуцирует антибиотик вирджиниамицин. Активность в конце ферментации 650 ед мл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма микроорганизма вида Streptomyces virginiae, продуцирующего видржиниамицин - антибиотик немедицинского назначения.

Вирджиниамицин представляет собой природную смесь макроциклических пептидолактонов М и S, которые растворимы в органических растворителях (метанол, хлороформ и др. ), слабо растворимы в воде и имеют мол. м. 525 и 823 соответственно. Фактор М видрджиниамицина - макроциклический лактон, содержащий оксазолиновое кольцо и, в свою очередь, состоит из компонентов М1(VM1) и M2(VM2), фактор S - состоит из циклопептидного лактонового кольца и содержит компоненты S1(VS1), S2(VS2) и S4(SV4). Химические и биологические свойства вирджиниамицина похожи на другие подобные антибиотики семейства вирджиниамицинов, описанные, например, для таких известных антибиотиков этой группы, как микомицин, пристиномицин, вернамицин и др. Общая особенность этих антибиотиков в том, что они состоят из двух разнофакторных компонентов М и S, которые обладают синергическим действием на чувствительные микроорганизмы и отличаются друг от друга структурой М или S компонентов.

Вирджиниамицин обладает бактериостатическим действием, в основном, против грамположительных бактерий и имеет очень низкую токсичность. Небольшая чувствительность грамотрицательных бактерий к нему объясняется непроницательностью их оболочки к антибиотику. Поэтому вирджиниамицин считается не активным агентом для грамотрицательных микроорганизмом, например, Е. coli или Salmonella. Особенно эффективен вирджиниамицин (его М фактор) против стафилококков и стрептококков, устойчивых к другим антибиотикам - пенициллину, стрептомицину, эритромицину, тетрациклину и др. Фактор S более активен для бацилл, но мало активен для кокковых культур и его активность для них составляет только 3-4% от общей активности фактора М. Однако потенциальная активность вирджиниамицина является результатом смеси двух факторов. Максимум синергического действия вирджиниамицина наблюдается в присутствии 25-40% фактора S, при котором активность фактора М увеличивается в 3,5-4 раза. Эта уникальная черта синергического взаимодействия важна для объяснения отсутствия значительной резистентности микроорганизмов к вирджиниамицину после многих лет интенсивного его использования в животноводстве.

Высокая эффективность вирджиниамицина делает его применение особенно ценным в животноводстве в качестве антибиотической добавки при откорме сельскохозяйственных животных и птиц, способствуя выживаемости молодняка, снижению заболеваемости, повышая ежедневную прибавку в весе и улучшая эффективность питания. Вирджиниамицин соответствует современным требованиям, предъявляемым к биологическим стимуляторам: активность, ограниченная грамположительными микроорганизмами, стабильность в кислотном рН, низкая растворимость в воде, малая вероятность возникновения резистентных форм микроорганизмов к антибиотику, отсутствие токсичности или остаточных явлений при его применении.

Продуцирующий микроорганизм Str. virginiae был изолирован в 1954 г. из образца почвы в Бельгии и по Американской Типовой Коллекции Культур (АТСС) ему был присвоен номер 13161. Впервые описание способа получения антибиотика 899 из этой культуры было опубликовано в журнале Antibiotics and Chemotherapy и одновременно в заявке США N 758483. Затем по новой международной номенклатуре антибиотик 899 получил наименование вирджиниамицин. Первый стабильный коммерческий препарат промышленного производства на основе культуры Str. virginiae ATCC 13161, имеющий формулу Stafac 500, который не содержал посторонних включений в виде мицелия и имел активность 50% чистого вирджиниамицина, получен в Бельгии в 1966 г. В настоящее время промышленное производство вирджиниамицина осуществляется, по крайней мере, в Великобритании, США и Бельгии.

В доступной литературе отсутствуют данные о патентах на продуцирующий штамм и промышленное получение вирджиниамицина. Известны патенты: на способ очистки антибиотика 899 (патент ФРГ N 1061482, аналог патента США N 3325359), способ очистки факторов S и М1 из антибиотика 899 (патент ФРГ N 1066706) и ряд патентов на способ применения препарата вирджиниамицина в составе питательных смесей для корма животных. На упомянутую заявку США N 758483 патент отсутствует.

Основные сведения, полученные о биосинтезе, ферментации и очистке вирджиниамицина при промышленном его получении, взяты из обзора A. M. Biot, где в схематичном виде описано получение за 72 ч ферментации до 1200 ед/мл антибиотика без указания конкретного штамма.

В специальной литературе не обнаружены сведения о проведении в СССР работ по биосинтезу вирджиниамицина или генетико-селекционных исследований с культурой Str. virginiae 13161. Поэтому в качестве прототипа взят исходный природный штамм Str. virginiae 13161, полученный из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС).

Целью предлагаемого изобретения является получение нового отечественного штамма-продуцента вирджиниамицина, на основе которого возможно создание технологии промышленного его получения. Кроме того, создание отечественного штамма-продуцента вирджиниамицина позволит расширить спектр выпускаемых в СССР антибиотиков немедицинского назначения.

Цель достигается созданием нового штамма Str. virginiae 147, депонированного во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеющего регистрационный номер ВКПМ S-1046. Новый штамм Str. virginiae ВКПМ S-1046 получен путем многоступенчатой селекции из природного штамма Str. virginiae ATCC 13161 под действием ультрафиолетовых лучей, аналога фенилаланина и резистентности к собственному антибиотику.

Характеристика штамма Str. virginiae ВКПМ S-1046 Морфологические и культуральные признаки.

Клетки мицелия нитевидной формы, спороносцы прямые, споры овальные, гладкие, под микроскопом не отличимы от исходного штамма АТСС 13161 Рост на агаризованных средах (на 10-е сутки роста при 27^оС).

На среде Гаузе-1 стандартного состава штамм образует слегка выпуклые круглые колонии диаметром 7-9 мм. Поверхность колонии гладкая, в центре неясный рисунок, споры серого цвета, по краям колонии узкий (0,5 мм) ободок белого цвета. Субстратный мицелий коричневый. Вокруг колонии - не четкая зона гидролиза крахмала диаметром 3-5 мм.

На других стандартных средах - СР-1, СР-6, СР-15 - штамм образует кремовые или коричневые колонии со складчатой поверхностью и волнистыми краями. Споры белого цвета немногочисленны, субстратный мицелий коричневый.

Рост на жидких средах.

На жидкой ферментационной среде (состав приводится ниже) штамм образует крупные сплетения гифов. На первые сутки ферментации культуральная жидкость приобретает разного оттенки темного цвета в зависимости от качества кукурузного экстракта, входящего в состав питательной среды. Цвет осадка соответствует цвету среды.

Физиологические и биохимические свойства.

Усвоение углеводов.

Так же, как и исходный штамм АТСС 13161, новый штамм S-1046 для роста усваивает глюкозу, мальтозу и маннозу. На других проверенных углеводах (арабинозе, галактозе, ксилозе, лактозе, рамнозе, рафинозе, сахарозе, фруктозе) отсутствует рост культуры. Штамм S-1046 слабо разжижает желатину, хорошо гидролизует крахмал.

Отношение к источникам азота.

Как и исходный штамм АТСС 13161, новый штамм S-1046 усваивает азот в форме солей аммония. Не растет на мочевине.

Отношение к антибиотикам.

Штамм S-1046, в отличие от исходного штамма АТСС 13161, устойчив к собственному антибиотику (500 мкг/мл S компонента вирджиниамицина). К другим проверенным антибиотикам (эритромицину, олеандомицину, линкомицину, тетрациклину, стрептомицину, канамицину, мономицину, неомицину, гентамицину, пенициллину, рифампицину, ристомицину, левомицетину, новобиоцину) оба штамма одинаково чувствительны.

Таким образом, новый штамм S-1046 по своим биохимическим свойствам мало отличается от исходного штамма АТСС 13161, но устойчив к собственному антибиотику.

Хранение штамма. Культуру штамма Streptomyces virginiae ВКПМ S-1046 хранят на косяках при температуре 2-4^оС или в лиофильно-высушенном состоянии в стеклянных запаянных ампулах при комнатной температуре.

Получение вирджиниамицина с использованием нового штамма-продуцента.

Клетки штамма-продуцента S. virginiae ВКПМ S-1046 выращивают на агаризованной среде Гаузе I, затем высевают в колбы с ферментационной средой, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или гидролизованный альфа-амилазой крахмал, в качестве источника азота - автолизат дрожжей или кислотный гидролизат дрожжей и кукурузный экстракт. Ферментацию проводят в течение 22-24 ч при 25^оС. К концу ферментации основная часть антибиотика (свыше 90-95% ) выделяется в культуральную жидкость.

Аналитический контроль за тотальными фракциями М и S антибиотика и его компонентами в ферментационной среде осуществляют при помощи метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Идентификацию гомогенности веществ, находящихся в пятнах и соответствующих по хроматографической подвижности стандартам М1, М2, S1, S2 и S4 вирджиниамицина, осуществляют с помощью ВЭЖХ после элюции с пластинки этих соединений, а также с помощью биоавтографии.

Количественно активность культуральной жидкости определяют как микробиологическим методом диффузии в агар с использованием Sarcina lutea в качестве тест-культуры, сравнивая результаты с Британским стандартом вирджиниамицина известной концентрации (ед/мл), так и хроматоденситометрическим методом (мкг/мл) антибиотика.

Примеры использования штамма S. virginiae ВКПМ S-1046 для получения антибиотика вирджиниамицина.

П р и м е р 1. Снятые петлей споры штамма S. virginiae ВКПМ S-1046, выращенного при 27^оС в течение 10 сут на косяках среды Гаузе 1, засевают в стандартные пробирки диаметром 20 мм, содержащие 5 мл ферментационной среды следующего состава (% % ): кукурузный экстракт 2; автолизат дрожжей 0,5; мел 0,5; глюкоза 0,5; глицерин 2,5; рН среды 7,0-7,2. Пробирки помещают на круговую качалку (220 об/мин) и выращивают в течение 22-24 ч при 25^оС. Активность в конце ферментации 650 ед/мл.

П р и м е р 2. Все как в примере 1, но используют штамм-прототип АТСС 13161.

Активность в конце ферментации 30 ед/мл П р и м е р 3. Водную суспензию спор штамма S. virginiae ВКПМ S-1046, полученную смывом культуры, выращенной при 27^оС в течение 10 сут на среде Гаузе 1, засевают в колбы емкостью 750 мл, содержащей 50 мл ферментационной среды. Состав среды и условия ферментации приведены в примере 1.

Активность в конце ферментации 500 ед/мл.

Таким образом, заявленный штамм S. virginiae ВКПМ S-1046 по уровню активности (650 ед/мл) в двадцать раз превосходит исходный штамм-прототип АТСС 13161 (30 ед/мл). Использование предлагаемого штамма служит не только основой для последующей селекции высокоактивного штамма, но и позволит создать технологию промышленного производства отечественного антибиотика вирджиниамицина. (56) Biotechnology of Industrial Antibiotics, eg. E. J. Vandamme Marcel Dekker, Inc. 1984, p. 695.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces virginae ВКПМ S-1046 - продуцент антибиотика вирджиниамицина.