Производные борсодержащих пептидов

Производные борсодержащих пептидов

Реферат

 

Назначение: в биохимии и медицине, в качестве ингибитора трипсиноподобных сериновых протеаз, таких как тромбин, калликреин плазмы и плазмин. Сущность изобретения: производные борсодержащих пептидов. Приведена ф-ла. Реагент 1: соответствующий амин. Реагент 2: R - Z - OH. Конденсацию ведут в растворителе в присутствии триэтиламина. Полученный продукт обрабатывают азидом щелочного металла с последующим восстановлением в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бензолсульфокислоты и взаимодействием с цианамидом в низшем спирте при 50 - 150°С. 18 табл. Формула: , где R₁ = H, Ac, Br, Boc, BocHu; R₂=(CH₂)_nNHC(NH)NH₂; n= 3,4; y - остаток пинаконового и пинандиолового эфира; HW = C₆H₅SO₃, HCl, HBr; Z = D- или L-Phe, DPhe - Pro, DPhe - Phe, Ala - huS, Pro - Phe, Ala - Phe, Glu - Phe, Ala - Ghe, Glu - Gly, Gly - Leu - Ala, Pyro - Glu - Phe, Val - Val, (D)Val - Leu, Lys - Pro, Leu - Thr. 18 табл.

Изобретение относится к борсодержащим пептидам, новым биологически активным соединениям, которые могут найти применение в биохимии в качестве ингибиторов трипсинподобных сериновых протеаз, таких как тромбин, калликреин плазмы и плазмин.

Известны ингибиторы тромбина - высокоэффективные пептидные хлорметилкетоны (Ki = 37 нМ), которые являются эффективными в предотвращении коронарного тромбоза в модели кролика [1].

Замещенные аргининамиды, состоящие из вторичных аминов, например (2R, 4R)-4-метил-1 {N²-[(3-метил-1,2,3,4-тетрагидро-8-хинолинил)-сульфонил]-L-аргин- ил}- 2-пиперидинкарбоновая кислота [2], являются ингибиторами тромбина (Ki = 19 нМ).

Этот ингибитор повышает протромбиновые сроки плазмы в анализах на свертывание крови in vitro в 2 раза при 1 мкМ и является фибринолитически усиливающим средством для использования в сочетании с тканевым активатором плазминогена.

Наиболее эффективным из известных ингибиторов тромбина является N- -/2-нафтилсульфонилглицил/-4-амидинофенил -аланин-пиперидин [3] (Ki = 6 нМ). Его эффективность определена у мышей и крыс in vivo.

Цель настоящего предложения - изыскание новых производных пептидной природы - малотоксичных, обладающих более высокой ингибирующей активностью и более широким спектром действия, растворы которых могут быть приготовлены без использования солюбилизатора (органического растворителя).

Поставленная цель достигается описываемыми производными борсодержащих пептидов общей формулы RZNHBYHW, (I) где R₁ = H, Ac, Bz, Boc, Boc-Leu; R₂ = (CH₂)_nNHC(NH)NH₂; n = 3, 4; Y = остаток пинаконового или пинандиолового эфира; HW:C₆H₅SO₃H, HCl, HBr; Z = D или L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, Ala-Lys, Pro-Phe, Ala-Phe, Glu-Phe, Ala-Glu, Glu-Gly, Gly-Leu-Ala, Pyro-Glu-Phe, Val-Val, DVal-Leu, Lys-Pro, Leu-Thr. Их получают, например, взаимодействием амина формулы H₂N (II) где n = 3, 4; W и W^I = Cl, Br; Y - остаток пинаконового или пинандиолового эфира, вводят во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы R₁-Z-OH, (III) где значения R₁ и Z указаны выше, и полученный продукт формулы RZNW (IV) где значения R₁, Z, Y, W, W^I и n - указаны выше, обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединения формулы RZNHW (V) где значения R₁, Z, Y, W и n - указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бензолсульфокислоты, с образованием соединения RZNH (VI) значения R₁, Z, Y, W и n - указаны выше, и последнее подвергают взаимодействию с цианамидом в низшем спирте при температуре 50-150^оС.

В описании изобретения используются следующие сокращения для аминокислотных остатков: Ala = L-аланин Arg = L-аргинин Asn = L-аспарагин Asp = L-аспарагиновая кислота Gys = L-цистеин Gln = L-глутамин Glu = L-глутаминовая кислота Gly = глицин His = L-гистидин Ile = L-изолейцин Leu = L-лейцин Lys = L-лизин Met = L-метионин Phe = L-фенилаланин Pro = L-пролин Ser = L-серин Thr = L-треонин Trp = L-триптофан Tyr = L-тирозин Val = L-валин Там, где прибавлен префикс D, упомянутые выше сокращения обозначают аминокислоту D-конфигурации. Там, где прибавлен префикс D или L, упомянутые выше сокращения обозначают то, что аминокислота может иметь или конфигурацию D, или конфигурацию L.

Используемый термин "N-концевая защитная группа" относится к аминоконцевым защитным группам, используемым в синтезе пептидов. Пригодные группы включают ацильную защитную группу, ацетил (Ас), бензоил (Bz) или алифатические уретановые защитные группы, например третбутоксикарбонил (Вос).

Приводимые далее в описании примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения. Все указанные точки плавления не откорректированы. Все части приведены в массовых частях, а температура указана в ^оС. Химические сдвиги в результате спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса (ЯМР или ^1НЯМР) указаны в дельта-единицах, частях на млн., исходя из внутреннего тетраметилсиланового стандарта. Многочисленные сокращения, используемые в указанных примерах, имеют следующие значения: ТFA - трифторуксусная кислота; DMF - -N,N-диметилформамид; МС - масс-спектрометрия; ТСХ - тонкослойная хроматография; оф-ТСХ - тонкослойная хроматография с обращенной фазой. Сложноэфирные защитные группы борных кислот имеют аббревиатуры: -C₆H₁₂ = пинаконовая группа и -C₁₀H₁₆ = пинандиоловая группа.

Все аминокислотные остатки представлены в L-конфигурации, если не оговорено особо.

ТСХ и оф-ТСХ осуществляют на пластинках из силикагеля 60 фирмы "Е.Мерк" и пластинках КI18F для оф-ТСХ фирмы Whatman. Нейтральные соединения наблюдали в УФ-области и после экспонирования парами йода. Соединения, содержащие свободные аминогруппы, подкрашивали нин гидрином, а соединения с гуанидиногруппами подкрашивали красителем Sakaguchi. Краситель Sakaguchi проявляет значительную специфичность к монозамещенным гуанидинам, например которые содержатся в бораргининовых пептидах.

П р и м е р 1а. 1-Амино-4-бром-бутилборонат пинандиол HCl.

NH₂-CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₁₀H₁₆ HCl 4-Бром-1-хлорбутилборонатпинандиол получают по методике, описанной Matte Son и др. В обычном эксперименте осуществляют гидроборирование аллилбромида (173 мл, 2,00 моль) бораном пирокатехина (240 мл, 2,00 моль) путем прибавления борана к аллилбромиду с последующим нагреванием реакционной смеси в течение 4 ч до 100^оС в атмосфере азота. Полученный продукт, пирокатехин 3-бромпропилбороната (т. кип. 95-102^оС, 0,25 мм), выделяют перегонкой с выходом 49% . Указанный пирокатехиновый эфир (124 г, 0,52 моль) трансэтерифицируют (+) -пинандиолом (88 г, 0,52 моль) при смешивании их в 50 мл тетрагидрофурана (THF), интенсивно перемешивая указанную смесь в течение 0,5 ч при 0^оС, а затем 0,5 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривают и прибавляют 250 мл гексана. Пирокатехин удаляют в виде кристаллического твердого вещества. Количественный выход получают путем последовательного разбавления гексаном до объема 500 и 1000 мл с выделением кристаллов при каждом разведении. При упаривании растворителя получают продукт (147 г) в виде масла.

C₁₃H₂₂O₂BrB.

Вычислено, %: C 51,85; H 7,38; Br 26,54.

Найдено, %: C 52,85; H 7,30; Br 26,58.

4-Бром-1-хлорбутилбороната пинандиол получают гомологизацией соответствующего пропилбороната. Хлористый метилен (34,8 мл, 0,540 моль) растворяют в 500 мл THF и затем медленно прибавляют к 1,54М н-бутиллития в гексане (350 мл, 0,540 ммоль) при температуре -100^оС. Пинандиол 3-бромпропилбороната (148 г, 0,490 моль) растворяют в 500 мл THF, охлаждают до точки замерзания указанного раствора и вводят в реакционную смесь. Хлорид цинка (33,5 г, 0,246 моль) растворяют в 250 мл THF, охлаждают до 0^оС и прибавляют несколькими порциями к реакционной смеси. Реакционную смесь при одновременном перемешивании нагревают постепенно до комнатной температуры в течение ночи. Затем растворитель упаривают, а полученный осадок растворяют в гексане и промывают водой. После просушивания над безводным сульфатом магния и фильтрования, растворитель удаляют с выходом целевого продукта (140 г).

Пинандиол 1-амино-4-бромбутилбороната получают путем растворения гексаметилдисилизана (28,0 г, 80,0 ммоль) в 30 мл THF, охлаждения полученного раствора до -78^оС и прибавления к нему 1,62 н. н-бутиллития в гексане (49,4 мл, 80,0 моль). Затем раствор медленно нагревают до комнатной температуры, повторно охлаждают до -78^оС и прибавляют пинандиол 4-бром-1- -хлорбутилбороната (28,0 г, 80,0 моль) в 20 мл THF. Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Растворитель удаляют упариванием, вводят сухой гексан (400 мл) и получают осадок, который выделяют фильтрованием в атмосфере азота. Фильтрат охлаждают до -78^оС и добавляют 4н. HCl в диоксане (60 мл, 240 моль). Затем реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и при этой температуре перемешивают ее 2 ч. Полученный продукт (20 г) выделяют фильтрованием в виде твердого вещества. После просушивания в вакууме неочищенный продукт растворяют в хлороформе и нерастворившееся вещество выделяют фильтрованием. Фильтрат упаривают и осадок растворяют в этилацетате. Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с выходом его 15,1 г (т.пл. 142-144,5^оС, [] _D^-25 = +16,7 0,80; c = 1,0, в абсолютном метаноле.

C₁₄H₂₆NO₂BrClB.

Вычислено, %: C 45,87; H 7,16; N 3,82; B 2,95.

Найдено, %: C 45,76; H 7,21; N 3,79; B 3,04.

П р и м е р 1b.

(D,L) 1-амино-4-бромбутилборонатпинакон HCl.

(D,L) NH₂-CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₆H₁₂ HCl.

Пинакон 4-бром-1-хлорбутилбороната получают по методу, описанному для получения соответствующего пинандиола (пример Ia), за исключением того, что вместо пинандиола используют пинакон, и пинакон 3-бром-пропилбороната (т. кип. 60-64^оС, 0,35 мм) и 4-бром-1-хлорбутилбороната пинакон (т.кип. 110-112^оС, 0,20 мм) перегоняют.

C₁₀H₁₉O₂BrClB.

Вычислено, %: C 40,38; H 6,45.

Найдено, %: C 40,70; H 6,37.

Хлористоводородную соль пинакона 1- -амино-4-бромбутилбороната также получают по методике примера 1а. Целевой продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гексан с выходом его 52%.

C₁₀H₂₂NO₂BrClB.

Вычислено, %: C 38,19; H 7,05; N 4,45; Cl 11,27; Br 25,41.

Найдено, %: C 38,28; H 7,39; N 4,25; Cl 11,68; Br 26,00.

П р и м е р 1с. Хлористоводородная соль пинакона 1-амино-4-хлорбутилборонат.

(D,L)NH₂-CH[(CH₂)₃Cl]BO₂-C₆H₁₂ HCl.

Пирокатехин 3-хлорпропилборонат (т. кип. 80-85^оС, 0,30 мм) и пинакон 3-хлор- пропилового эфира бороновой кислоты (т.кип. 63^оС, 0,20 мм) получают по методике примера 1а, за исключением того, что вместо аллилбромида используют аллилхлорид, а вместо пинандиола берут пинакон.

C₉H₁₈O₂ClB.

Вычислено, %: C 52,85; H 8,89; Cl 17,33.

Найдено, %: C 53,41; H 8,15; Cl 16,81.

Гомологизацию также осуществляют по методике примера 1а, а полученный продукт выделяют перегонкой (т.кип. 95^оС, 0,25 мм) с 65%-ным выходом.

С₁₀Н₁₉О₂Cl₂B.

Вычислено, %: С 47,47; Н 7,58; Cl 28,02.

Найдено, %: C 47,17; H 7,45; Cl 27,75.

Хлористоводородную соль пинакона 1- -амино-4-хлорбутилового эфира бороновой (борной) кислоты получают по методике, аналогичной в примере 1а. Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с получением 8,8 г продукта (т.пл. 132-135,5^оС) и 2,2 г продукта (т.пл. 145-147^оС). Продукт с т.пл. 145-147^оС используют для анализа.

C₁₀H₂₂NO₂ClB.

Вычислено, %: C 44,47; H 8,23; N 5,19; B 4,00.

Найдено, %: C 44,01; H 8,23; N 4,77; B 3,80.

П р и м е р 1d (D,L) 1-амино-5-бромпентилового эфира бороновой кислоты пинакон HCl.

(D,L) NH₂-CH[(CH₂)₄Br]BO₂C₆H₁₂ HCl.

Пинакон 4-бромбутилового эфира бороновой кислоты получают по методу, описанному для получения пинандиола 3-бромпропилового эфира борной кислоты (пример 1а), за исключением того, что аллилбромид заменяют на 4-бром-1-бутен, а пинандиол - на пинакон. Продукт выделяют в виде масла (т.кип. 77^оС, 0,3 мм). После гомологизации получают 5-бром-1-хлорпентилового эфира бороновой кислоты пинакон.

Масс-спектроскопия (Cl): C₁₁H₂₁O₂BrClB.

Вычислено, -Н: 310,47.

Найдено, -Н: 310.

Целевой продукт хлористоводородную соль пинакона 1-амино-5-бромпентилового эфира бороновой кислоты получают по методике примера 1а при выходе 35%.

С₁₁H₂₄NO₂BrBCl.

Вычислено, %: C 40,22; H 7,36; N 4,26; Cl 10,79; Br 24,32; B 3,29.

Найдено, %: C 39,23; H 7,18; N 4,04; Cl 15,21; Br 25,66; B 3,75.

П р и м е р 2. Boc-(D)Phe-Pro-NH- -CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₁₀H₁₆.

Синтез дипептида Boc-(D)Phe-Pro-OH осуществляют сначала с получения дипептидного бензилового эфира, а затем удаления указанного сложного эфира каталитическим гидрированием. Boc-(D) -Phe-OH (10,0 г, 37,7 ммоль) растворяют в 50 мл THF и к полученному раствору прибавляют N-метилморфолин (4,14 мл, 37,7 ммоль). Раствор охлаждают до -20^оС, а затем к нему прибавляют изобутиловый эфир хлормуравьиной кислоты (4,90 мл, 37,7 ммоль). Через 5 мин в реакционную смесь вводят Н-Pro-OBr 1-.HCl (9,11 г, 37,7 ммоль), растворенный в 50 мл хлороформа и охлажденный до -20^оС. Прибавляют триэтиламин (5,25 мл, 37,7 ммоль) и полученную смесь перемешивают 1 ч при -20^оС и 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате с последующим промыванием 0,2н. HCl, 5% -ным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают с получением 15,2 г Boc-(D) Phe-Pro-OBz 1 в виде масла. Полученный бензиловый эфир (15,2 г) растворяют в 100 мл метанола и затем гидрируют при начальном давлении 40 фунтов/дюйм² (2,812 кг/см²) в аппарате Парра в присутствии 0,5 г 10% палладиевой черни (Pd/C). Реакционный раствор фильтруют через цеолиттм и упаривают с выходом твердого вещества. Указанный твердый продукт выделяют и промывают этилацетатом, а затем простым эфиром с получением 10,0 г требуемого продукта (т.пл. 176,5-177^оС).

C₁₉H₂₆N₂O₅ Вычислено, %: C 62,95; H 7,24; N 7,73.

Найдено, %: C 62,91; H 7,15; N 7,53.

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH₂)₃Br] BO₂-C₁₀H₁₆ получают связыванием указанного дипептида с соответствующим амином по методике смешанного ангидрида. Смешанный ангидрид Boc- -(D)Phe-Pro-OH получают при растворении указанной кислоты (4,94 г, 13,6 ммоль) в 30 мл THF c последующим прибавлением N-метилморфолина (1,50 мл, 13,6 ммоль). Затем реакционный раствор охлаждают до -20^оС и добавляют изобутиловый эфир хлормуравьиной кислоты (1,77 мл, 13,6 ммоль). После перемешивания в течение 5 минут при -20^оС, в реакционную смесь вводят амин, который получен в примере 1а, NH₂- -CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₁₀H₁₆HCl (5,0 г, 13,6 ммоль), растворенный в 10 мл охлажденного хлороформа. Охлажденный тетрагидрофуран (10 мл) и триэтиламин (1,90 мл, 13,6 ммоль) прибавляют к реакционной смеси, и перемешивают смесь в течение 1 ч при -20^оС и примерно 2 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют и оставшуюся жидкость в фильтрате упаривают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают 0,2н. HCl, 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, а растворитель упаривают с выходом 9,0 г продукта в виде масла. Указанный продукт растворяют в метаноле и хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см с LH-20. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают с получением 5,8 г твердого вещества. ТСХ в смеси метанол/хлороформ (1:9) показывает единичное пятно; R_f 0,70.

C₃₃H₄₉N₃O₆BBr.

Вычислено, +Н: 674,30.

Найдено, +Н: 674,30.

П р и м е р 3. Boc-(D)Phe-Pro-NH- -CH[(CH₂)₃N₃]BO₂-C₁₀H₁₆.

Продукт примера 2, Boc-(D)Phe-Pro-NH--CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₁₀H₁₆ (4,4 г, 6,54 ммоль) растворяют в 7 мл диметилформамида (DMF) и азид натрия (0,919 г, 14,1 ммоль) прибавляют к указанному раствору. Реакционную смесь нагревают при 100^оС в течение 3 ч. Прибавляют этилацетат (100 мл) к реакционной смеси и затем промывают водой и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают. Получают 4,1 г твердого продукта. Указанный продукт хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см из LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, оставшуюся жидкость упаривают с выходом 2,3 г названного азида. ТСХ в системе метанол: хлороформ (1:9) показывает единичное пятно; R_f 0,76.

C₃₃H₄₈N₆O₆B.

Вычислено, %: C 62,35; H 7,63; N 13,33; B 1,70.

Найдено, %: C 63,63; H 8,02; N 11,58; B 1,80.

Масс-спектроскопия (FAB) C₃₃H₄₈N₆O₆B.

Вычислено, %: +H 637,39.

Найдено, %: +H 637,49.

П р и м е р 4. Boc-(D)Phe-Pro-NH- -CH[(CH₂)₃NH₂]BO₂-C₁₀H₁₆ Бензолсульфокислота.

Азид примера 3 (8,80 г, 13,8 ммоль) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют на установке Парра при давлении 40 фунтов/дюйм² (2,812 кг/см²) в присутствии 0,50 г 10% палладиевой черни и бензолсульфокислоты (2,19 г, 13,8 ммоль). Через час катализатор удаляют, и после упаривания раствора получают 9,9 г требуемого продукта. оф-ТСХ в системе растворителей метанол: вода (85: 15) показывает пятно в УФ области; R_f 0,91 и пятно, позитивное к нингидрину, R_f 0,52.

П р и м е р 5. Boc-(D)Phe-Pro-NH- -CH[(CH₂)₃-NH-C(NH)NH₂]BO₂-C₁₀H₁₆ бензолсульфокислота.

Boc-(D)Phe-Pro-бороArg-C₁₀H₁₆ бензол- сульфокислота.

Boc-(D)Phe-Pro-бороArg-C₁₀H₁₆ бензолсульфокислоту, полученную в примере 4 (4,6 г, 6,11 ммоль), нагревают с обратным холодильником при 100^оС в 20 мл абсолютного этанола, содержащего цианамид (50 мг/мл). Ход реакции регулируют оф-ТСХ в системе растворителей метанол:вода (85:15), где наблюдается исчезновение нин- гидринового пятна из исходного материала амина (R_f 0,54) и появление красителя Sakaguchi на полученном продукте (R_f 0-0,13). Указанный продукт можно обнаружить после нагревания с обратным холодильником в течение 18 ч, причем его уровень постепенно повышается. Через 7 дней, когда амин нельзя обнаружить, реакционный раствор концентрируют до примерно 50% объема пассивным упариванием. Затем реакционный раствор фильтруют, сгущают и хроматографируют на 2,5 х 100 см колонке с LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и после упаривания получают 3,7 г требуемого продукта. Порцию продукта (2,3 г) кристаллизуют смесью этилацетат:гексан, с выходом 0,89 г вещества, а остаток (1,2 г) получают порошкованием простым эфиром в виде твердого продукта.

Масс-спектроскопия (FAB) для С₃₄H₅₃N₆O₆SB.

Вычислено, % : +H 653,42.

Найдено, %: +H 653,38.

Элементный анализ для С₄₀Н₅₉N₆O₉SB. H₂O, %.

Вычислено, %: C 57,95; H 7,43; N 10,14; B 1,30.

Найдено, %: C 57,20; H 7,14; N 10,94; B 1,01.

П р и м е р 6. Н-(D)Phe-Pro-бороArg- -C₁₀H₁₆ 2HCl.

Продукт примера 5, Boc-(D)Phe-Pro-бороArg-C₁₀H₁₆, бензолсульфокислота (1,17 г, 1,54 ммоль), подвергают взаимодействию с 5 мл 4н. хлористого водорода в диоксане в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный продукт осаждают при добавлении простого эфира, выделяют и промывают простым эфиром с просушиванием в вакууме. Затем продукт растворяют в 10 мл воды и наносят на анионно-обменную колонку 5 мл анионно-обменную колонку (Cl^--форма Bио-RAD AGI X8_тм Richmond, CA) c последующим промыванием колонки водой (примерно 30 мл). Элюент упаривают в вакууме, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом требуемого продукта (0,80 г).

Масс-спектроскопия (FAB) для C₂₉H₄₅N₆O₄B: Вычислено, %: +H 553,37.

Найдено, %: + H 553,40 и 538,40 (не идентифицирован).

Элементный анализ H-(D)Phe-Pro-бороArg-C₁₀H₁₆ I BSA.TFA: Найдено, %: 553,4.

П р и м е р ы 7-8. Ac-(D)Phe-Pro-бороArg--C₁₀H₁₆ HCl (пример 7).

Ac-(D)Phe-Pro-бороArg-OH HCl (пример 8).

Boc-(D)Phe-Pro-бороArg-C₁₀H₁₆ бензолсульфокислота, продукт примера 5 (0,86 г, 1,13 ммоль), подвергают взаимодействию с безводной трифторуксусной кислотой (TFA) (примерно 5 мл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Избыток TFA удаляют упариванием, а полученный осадок порошкуют простым эфиром с выходом 0,76 продукта. Указанный продукт (0,70 г, 0,91 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл диоксана и 1 мл воды. Уксусный ангидрид (0,47 мл, 5,0 ммоль) и бикарбонат натрия (0,42 г, 5,0 ммоль) прибавляют к реакционному раствору. Затем полученную смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют этилацетат (50 мл) и воду (5 мл). Образовавшиеся фазы разделяют и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. После фильтрования и удаления растворителя упариванием получают 0,56 г полутвердого вещества.

Полученную пробу растворяют в 4 мл ледяной уксусной кислоты с последующим разбавлением раствора 16 мл воды. Затем сразу же наносят на колонку с 15 мл SP-сефадексатм (Н⁺-форма) и уравновешивают 20%-ным раствором уксусной кислоты. Колонку промывают 300 мл 20%-ной уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентраций от 100 мл 20%-ной уксусной кислоты, до 100 мл 20%-ной уксусной кислоты, хлористоводородную кислоту. Фракции, собранные в градиенте концентрации от 0,08 до 0,17н. HCl, содержат N-ацетиловый пептид (0,29 г) в виде смеси из свободной бороновой кислоты и сложного пинандиолового эфира.

Сложный эфир пинандиола и свободную бороновую кислоту разделяют хроматографией на 2,5 х 100 см колонке, содержащей 1Н-20 в метаноле. Размер фракций составляет 8,2 мл. Пинандиоловый эфир (102 мг) элюируют в фракциях 41-43, в то время как свободную борную кислоту (131 мг) постепенно вымывают в фракциях 45-129.

Масс-спектроскопия (FAB) (пример 7): Ac-(D)Phe-Pro-бороArg-C₁₀H₆ для C₃₁H₄₇N₆O₅B: Вычислено, +Н: 595,33.

Найдено, +Н :595,33.

Масс-спектроскопия (FAB) (пример 8): Ac-(D)Phe-Pro-бороArg-OH HCl для C₂₁H₃₃N₆O₅: Вычислено, +Н: 449,60.

Найдено, +Н^I: 579,24-581,24.

Последние данные нельзя объяснить. Тем не менее, данные ЯМР совпадают со структурой свободной бороновой кислоты, так как заданные полосы испускания для пинандиоловой группы, например как синглеты метильных групп при 0,85 (3Н), 1,30 (3Н) и 1,36 (3Н), не наблюдались. В качестве дополнительного доказательства этой структуры, образец продукта свободной бороновой кислоты переэтерифицируют с выходом материала примера 7. Аналитическую пробу (20 мг) обрабатывают двукратным избытком пинандиола (14 мг) в 3 мл метанола в течение 5 мин. Растворитель упаривают, а избыток пинандиола удаляют порошкованием простым эфиром указанного образца с выходом требуемого продукта (26 мг).

Масс-спектроскопия (FAB) (найдено: 595,38) и данные ЯМР совпадают со структурой, предполагаемой для этерифицированного продукта и почти идентичны пинандиоловому продукту примера 7.

П р и м е р 9. Ac-Phe-бороArg-C₁₀H₁₆ HCl.

По методике, описанной в примере 2, получают Ac-Phe-NH-CH[CH₂)₃Br]BO₂- -C₁₀H₁₆. Затем получают смешанный ангидрид Ac-Phe-OH (0,565 г, 2,73 ммоль) в 10 мл TFA, который связывают с NH₂-CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₁₀H₁₆HCl (продукт примера 1а, 1,00 г, 2,73 ммоль), растворенного в 10 мл охлажденного THF c выходом 1,47 г белой пены. Указанный продукт перемешивают в течение ночи вместе с гексаном. Получают твердое вещество 1,01 г (т.пл. 106,5-109^оС).

Элементный анализ для C₂₅H₃₆N₂O₄BrB, %: Вычислено, %: C 57,81; H 7,00; N 5,40; Br 15,40; B 2,08.

Найдено, %: C 58,33; H 7,33; N 4,76; Br 14,18; B 1,80.

Масс-спектроскопия (FAB) для С₂₅Н₃₆N₂O₄BrB.

Вычислено, +Н: 519,20.

Найдено, +Н: 519,23.

Ac-Phe-NH-CH[(CH₂)₃N₃] BO₂-C₁₀H₁₆ получают при обработке Ac-Phe-NH- -CH[(CH₂)₃Br]BO₂-C₁₀H₁₆ (3,22 г, 6,20 ммоль) натрийазидом по методике, описанной в примере 3. Полученный продукт (3,03 г) хроматографируют на колонке с LH-20. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и упаривают. Осадок порошкуют гексаном с выходом 2,21 г указанного азида.

Бензолсульфонат Ac-Phe-бороОrn-C₁₀H₁₆ получают из указанного азида Ac- -Phe-NH-CH[(CH₂)₃N₃] BO₂-C₁₀H₁₆ (2,21 г, 4,59 ммоль) по методике примера 4, за исключением того, что гидрирование осуществляют при атмосферном давлении. После фильтрования и упаривания растворителя путем порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (2,22 г).

Ac-Phe-бороArg-C₁₀H₁₆ бензолсульфонат получают путем обработки соединения Ac-Phe-бороOrn-C₁₀H₁₆ бензолсульфокислота (2,0 г, 3,26 ммоль) 10 мл раствора цианамида (100 мг/мл) в этаноле. Реакцию гуанидирования осуществляют по методике примера 5, за исключением того, что реакционное время составляет 3 дня, а реакционная смесь содержит смесь из исходного материала и полученного продукта. Указанная смесь требует дополнительной очистки, которую по всей вероятности можно не проводить, продлив продолжительность реакции. Реакционный раствор далее концентрируют и хроматографируют на колонке 2,5 х 100 см из LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, обнаруженные при помощи подкрашивающего агента Sakaguchi, объединяют и упаривают с выходом 1,4 г продукта. Полученный продукт (1,2 г) растворяют в 6 мл уксусной кислоты, разбавляют 30 мл воды и получают раствор молочного цвета. Этот раствор наносят на колонку объемом 30 мл с SP-Сефадексомтм С-25 (Н⁺-форма), доведенного до равновесного состояния 20%-ным водным раствором уксусной кислоты. Далее колонку промывают 240 мл 20%-ной уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентрации от 250 мл 20%-ной уксусной кислоты до 250 мл 20%-ной уксусной кислоты, содержащей 0,30 н. соляной кислоты. Фракции, элюированные из колонки в интервале от 0,12 до 0,16 н. соляной кислоты, объединяют с выходом 0,42 г требуемого пептида в виде смеси свободной борной кислоты и сложного эфира пинандиола. Указанную смесь растворяют в метаноле (10 мл) и для этерификации свободной борной кислоты прибавляют 80 г пинандиола. После перемешивания в течение 30 мин растворитель упаривают, а после порошкования осадка простым эфиром получают 0,28 г требуемого продукта.

Элементный анализ для C₂₆H₄₀N₅O₄B HCl 2H₂O, %: Вычислено: C 54,78; H 8,15; N 12,30; B 1,90.

Найдено: C 55,34; H 7,83; N 11,66; B 1,99.

Масс-спектроскопия (FAB) для C₂₆H₄₀N₅O₄B: Вычислено, +Н: 498,32.

Найдено, +Н: 498,31.

П р и м е р 10. Ac-(D,L)Phe-(D,L)-бороArg--C₆H₁₂.

Промежуточное соединение Ac- -(D,L)Phe-(D,L)-NH-CH-[(CH₂)₃Br]BO₂-C₆H₁₂ получают модифицированием методов, описанных в примере 1 и 2. Хлорангидрид Ac- -Phe-OH получают при взаимодействии Ac-Phe-OH (30 г, 0,145 моль) с пентахлоридом фосфористой кислоты (30 г, 0,144 моль) в 175 мл THF при -10^оС. Реакционную смесь перемешивают при 0^оС приблизительно в течение 1 ч, затем разбавляют до объема 350 мл охлажденным простым эфиром, продукт выделяют в виде твердого вещества, промывают холодным простым эфиром и после высушивания в вакууме получают 21 г продукта. Активированное ацетилфенилпроизводное (14,8 г, 65,6 ммоль) растворяют в 40 мл THF и прибавляют к продукту взаимодействия пинакона 4-бром-1-хлорбутилбороната и гексаметилдисилизана (приготовленных в 20 ммольной концентрации) при -78^оС. Затем реакционную смесь нагревают до комнатной температуры с последующим перемешиванием ее в течение ночи. Растворитель удаляют путем упаривания. Осадок растворяют в этилацетате и промывают последовательно водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органическую фазу полученной смеси сушат над безводным сульфатом натрия и после концентрирования получают требуемый продукт в виде кристаллического твердого вещества (1,37 г; т.пл. 146,5-148^оС). При исследовании структуры кристалла получен следующий химический состав.

Элементный анализ для C₂₁H₃₂N₂O₄BrB, %: Вычислено: C 53,98; H 6,92; N 6,00; Br 17,10; B 2,31.

Найдено: C 54,54; H 6,78; N 5,89; Br 16,46; B 3,40.

Алкилбромид превращают в соответствующий азид по методике примера 3. Продукт выкристаллизовывают из этилацетата (т.пл. 143-144^оС).

Элементный анализ для C₂₁H₃₂N₅O₄B, %: Вычислено: C 58,74; H 7,53; N 16,31; B 2,53.

Найдено: C 58,85; H 7,48; N 16,53; B 2,93.

Полученный азид превращают в соль бензолсульфокислоты Ac-(D,L)Phe-(D, L)-бороOrn-C₆H₁₂ по методике примера 4, за исключением того, что гидрирование проводят при атмосферном давлении.

Ac-(D, L)Phe-(D, L)бороOrn-C₆H₁₂ бензолсульфокислота (0,243 г, 0,433 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом (0,20 г, 0,476 ммоль) при 100^оС в 2 мл абсолютного этанола в течение ночи. Раствор концентрируют и после порошкования простым эфиром получают 0,21 г белого вещества. При оф-ТСХ отмечено характерное положительное окрашивание полосы при использовании красителя Sakaguchi в случае бороаргининовых пептидов, R_f 0-0,55, и дискретное пятно, R_f 0,68, соответствующее непрореагированному исходному материалу. Полученный продукт (81 мг) повторно обрабатывают 2 мл раствора цианамида (10 мг/мл) в течение ночи по вышеуказанной методике и после порошкования простым эфиром получают 71 мг целевого продукта.

Масс-спектроскопия (FAB) для C₂₂H₃₇N₅O₄B: Вычислено, +H: 446,30.

Найдено, +Н: 446,23 и 404,19 (соответствующий непрореагированному боронитиновому пептиду) .

Следует иметь в виду, что методика по примеру 5, представляет собой наилучший способ получения бороаргининовых пептидов и отличается в том, что используют больший избыток цианамида и более продолжительное время взаимодействия.

П р и м е р 11. Boc-(D)Phe-бороArg- -C₁₀H₁₆-бензолсульфонат.

Boc-(D)Phe-Phe-OH получают по методике, описанной для получения дипептида Boc-(D)Phe-Pro-OH в примере 2. После гидрирования сложного бензилового эфира, полученный продукт выкристаллизовывают из смеси хлороформ:гексан с выходом требуемого пептида (т.пл. 133-133,5^оС).

Элементный анализ для C₂₃H₂₈N₂O₅, %: Вычислено: C 66,96; H 6,86; N 6,79.

Найдено: C 66,75; H 6,79; N 6,56.

Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH₂)₃Br] BO₂-C₁₀H₁₆ получают путем смешивания Boc-(D)Phe-Phe-OH (6,00 г, 14,5 ммоль) с NH₂-CH[(CH₂)₃Br]BO_2-C₁₀H₁₆ HCl (пример 1а, 5,33 г, 14,5 ммоль) по методике, описанной в примере 2, за исключением того, что не выполняют хроматографии на колонке с LH-20. Полученный продукт выкристаллизовывают из этилацетата с выходом в первом погоне 2,47 г продукта (т. пл. 132-134^оС и 5,05 г продукта (т.пл. 133-135^оС) во втором погоне. При оф-ТСХ в системе метанол:вода (85:15) отмечено единичное пятно, R_f 0,29.

Элементный анализ для C₃₇H₅₁N₃O₆BrB, %: Вычислено: C 61,32; H 7,11; N 5,80; Br 11,03.

Найдено: C 61,21; H 7,02; N 5,59; Br 10,22.

Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH₂)₃N₃]BO₂-C₁₀H₁₆ получают при обработке соответствующего алкилбромида (7,15 г, 9,87 ммоль) азидом натрия по методике, описанной в примере 3, за исключением того, что для очистки не нужно проводить хроматографического разделения на колонке с LH-20. Требуемый продукт элюируют из смеси растворителей этилацетат:гексан в виде геля и после выделения и промывания гексаном получают 3,0 г требуемого продукта в первом погоне и 2,9 г во второй порции. Бензолсульфонат Boc-(D)Phe-Phe-бороOrn-C₁₀H₁₆ получают из указанного азида (5,37 г, 7,82 ммоль) по методике, описанной в примере 4 с выходом 5,33. При оф-ТСХ в смеси метанол:вода (85: 15) отмечается интенсивное положительное окрашивание нингидрином, R_f 0,42 и слабое пятно в УФ-области, 0,92 (образование пятна в УФ-области при R_f 0,92 характерно для аминов или гуанидиновых соединений, которые являются солями бензолсульфокислоты).

Масс-спектроскопия (FAB) для С₃₇H₅₃N₄O₆B: Вычислено, +Н: 661,76.

Найдено, +H: 661,14.

Boc-(D)Phe-Phe-бороArg-C₁₀H₁₆ получают по методике, описанной в примере 5. Бороорнитиновый пептид (4,83 г, 5,90 ммоль) обрабатывают раствором цианамида (50 мг/мл) в 20 мл абсолютного этанола в течение 7 дней. Из реакционной смеси выделяют порцию продукта, соответствующую 1,0 г исходного материала, и нагревают отдельно без обратного холодильника в течение ночи с полным превращением амина в гуанидино-соединение. После хроматографии на колонке с LH-20 и порошкования продукта простым эфиром получают 0,52 г требуемого бонила.

Элементный анализ для C₄₄H₆₁N₆O₉SB, %: Вычислено: C 61,38; H 7,16; N 9,76; B 1,25.

Найдено: C 59,69; H 7,41; N 9,82; B 1,26.

Масс-спектроскопия (FAB) для C₃₈H₅₅N₆O₆B.

Вычислено, +Н: 703,43.

Найдено, +Н: 703,49.

П р и м е р 12. H-(D)Phe-Phe-бороArg- -C₁₀H₁₆ 2HCl.

Бензолсульфонат Boc-(D)Phe-Phe-бороArg-C₁₀H₁₆ (полученный по примеру 11, 0,59 г, 1,25 ммоль) деблокируют по методике примера 6, за исключением того, что пробу наносят на ионнообменную колонку в 20%-ном этаноле с последующим промыванием указанной колонки 20%-ным раствором этанола. Продукт получают (0,424 г) в виде белого твердого вещества.

Масс-спектроскопия (FAB) для C₃₃H₄₇N₆O₄B: Вычислено, +Н: 603,38.

Найдено, +Н: 603,41.

П р и м е р 13. Бензолсульфат Ac-Ala-Lys(Boc)-бороArg-C₁₀H₁₆.

Ac-Ala-Lys(Boc)-OH получают путем сопряженной реакции N-оксиянтарной кислоты имидоэфира Ac-Ala-OH (полученного по методу Anderson) c H-Lys(Boc)-OH. N-оксисукцинимид Ac-Ala-OH (6,25 г, 27,4 ммоль) растворяют в 30 мл диоксана и прибавляют к раствору H-Lys(Boc)-OH (7,50 г, 30,4 ммоль), который растворен в смеси, состоящей из 30 мл 1,0 н. NaOH и триэтиламина (2,12 мл, 15,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, а затем подкисляют соляной кислотой. Для получения требуемой насыщаемости раствора добавляют нужное количество сухого хлорида натрия. Продукт экстрагируют в этилацетате и затем промывают 0,2 н. HCl, полученной в насыщенном водном растворе хлористого натрия. Растворитель удаляют путем упаривания. После кристаллизации продукта из смеси этилацетат:гексан получают 7,3 г требуемого продукта, (т.пл. 86-89^оС).

Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH₂)₃Br] BO₂-C₁₀H₁₆ получают по методике примера 2 за исключением того, что получаемый продукт очищают фракционированной кристаллизацией из этилацетата. В продукте (1,13 г), полученном во второй и третьей фракции, отмечается единичное пятно при оф-ТСХ в смеси растворителей метанол: вода (85: 15) при значении R_f 0,51. Тонкослойную пластинку подвергают воздействию паров хлористоводородной кислоты, на которой после прибавления нингидринового индикатора обнаруживают целевой амин.

Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH₂)₃N₃] BO₂-C₁₀H₁₆ получают из соответствующего алкилбромида (1,95 г, 2,90 ммоль) по методике описанной в примере 3, за исключением того, что очистку продукта осуществляют кристаллизацией его из этилацетата, а не хроматографией на LH-20. После кристаллизации неочищенного продукта (1,60 г) получают 0,55 г чистого продукта (т.пл. 79-84^оС) и 0,96 г осадка. Ниже представлен химический состав кристаллического продукта.

Элементный анализ для C₃₀H₅₂N₇O₇B, %: Вычислено: C 56,86; H 8,29; N 15,48; B 1,71.

Найдено: C 56,76; H 8,26; N 15,89; B 1,65.

Бензолсульфонат Ac-Ala-Lys(Boc)-бороOrn-C₁₀H₁₆ получают из соответствующего алкилазида (0,433 г, 0,683 ммоль) по методике, описанной в примере 4. После удаления кристаллизатора и растворителя получают названный продукт (0,45 г) при порошковании простым эфиром.

Масс-спектроскопия (FAB) для C₃₀H₅₄N₅O₇B: Вычислено, +Н: 608,42.

Найдено, 608,49.

Бензолсульфонат Ac-Ala-Lys(Boc)-бороArg-C₁₀H₁₆ получают при взаимодействии соответствующего бороорнитинового пептида с цианамидом по методике, оп