Ферментный препарат протеолитического действия для офтальмологии

Ферментный препарат протеолитического действия для офтальмологии

Реферат

 

Изобретение относится к области офтальмологии и может быть использовано в качестве средства лечения больных с внутриглазными кровоизлияниями и помутнениями стекловидного тела травматической и увеальной этиологии. Препарат представляет собой высокоочищенный препарат пептидил-пептид гидролазы (КФ 3.4.24.4), полученный из коммерческого препарата протосубтилин при использовании ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе. Протолизин - это белый порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе натрия хлорида. Оптимальные условия действия: температура 50°С, pH 7,0 - 7,5. Ингибиторы: ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты. Растворы протолизина наиболее устойчивы при pH 7,0 - 8,0 и температуре 5 - 10°С. Протеолитическая активность препарата при 37°С составляет 3,5 - 4,2 ПЕ/мг белка. Препарат выпускают в герметически закрытых флаконах с дозировкой по 10 ПЕ, он может быть введен субконъюнктивально, в виде инстилляций, с помощью электрофореза и фонофореза, прошел клинические испытания и показал более высокую эффективность по сравнению с трипсином и фибринолизином. 3 табл.

Изобретение относится к созданию нового лекарственного препарата протеолитического действия, способного избирательно разрушать некротизированные ткани. Препарат может найти применение, в частности, в офтальмологии.

Цель изобретения - использование в офтальмологии препарата протолизин, который может быть получен из коммерческого препарата протосубтилин по следующей схеме: - растворение протосубтилина в буферном растворе или дистиллированной воде при рН 6,2-7,5 с последующим добавлением в ферментный раствор 0,1-0,5% CaCl₂ для стабилизации металлопротеиназы и коагуляции балластных белков, отделение осадка центрифугированием; - обессоливание раствора протосубтилина методом гель-фильтрации на любом подходящем сорбенте, например сефадексе G-25; - ионообменная хроматография обессоленного ферментного раствора на карбоксиметилцеллюлозе с целью разделения ферментативного комплекса протосубтилина; - концентрирование протеолитической фракции методом ультрафильтрации до содержания протеиназы в концентрате 8-11 ед/мл; - осаждение ацетоном при рН 8,2-8,4, отделение осадка центрифугированием; - растворение осадка в дистиллированной воде, взятой в количестве, необходимом для получения ферментного раствора с активностью 11-14 ед/мл; - фильтрация через стерилизующий фильтр; - лиофилизация.

Протолизин представляет собой белый или светло-бежевый порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Растворы протолизина наиболее устойчивы при рН 7,0-8,0 и температуре 5 - 10^оС. Оптимальные условия действия протолизина: температура 50^оС, рН 7,0-7,5. Ингибиторы - ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты. Изоэлектрическая точка - 8,3, молекулярная масса активного белка протолизина - 30,5-34,0 кДа.

Установлено, что протолизин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот и не действует на пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот. Препарат активно расщепляет белки, содержащие ароматические аминокислоты. Протеолитическая активность протолизина не ниже 1 ПЕ/мг, удельная активность при 37^оС составляет 3,5-4,2 ПЕ/мг белка. Протолизин расщепляет вязкие секреты, экссудаты, омертвевшие участки тканей, фибринозные образования. Препарат служит эффективным средством лечения больных с внутриглазными кровоизлияниями, помутнениями стекловидного тела травматической и увеальной этиологии.

Протолизин выпускают в герметически закрытых флаконах по 10 ПЕ. Раствор препарата готовится непосредственно перед использованием. Протолизин может быть введен субконъюнктивально, в виде инстилляций, с помощью электрофореза и фонофореза. Побочных действий у препарата не обнаружено.

Терапевтический эффект протолизина при лечении больных с гемофтальмом был изучен по сравнению с препаратами трипсин (из тканей животных) и фибринолизин (из крови человека). Известно, что указанные препараты используются в офтальмологической практике как тромболитическое средство при кровоизлияниях в переднюю камеру глаза, а также при заболеваниях роговой оболочки (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие по фармакотерапии для врачей. - Издание одиннадцатое стереотипное. - М.: Медицина, 1988. - ч. 2). Препараты применялись в виде субконъюнктивальных инъекций. Для этого использовали свежеприготовленные 0,25%-ные растворы препаратов. После анестезии конъюнктивальной полости 0,5%-ным раствором дикаина по конъюнктиву вводили 0,3 мл раствора препарата. Инъекции проводили через 24-48 ч. Результаты исследований представлены в табл. 1. Критерием оценки служили следующие показатели: появление рефлекса с глазного дна, степень повышения остроты зрения, сокращение сроков клинического выздоровления. Результаты клинического испытания протолизина у больных с гемофтальмом показали более высокую эффективность этого препарата по сравнению с трипсином и фибринолизином. Протолизин более устойчив в растворе. При температуре не выше 10^оС он сохраняет свою терапевтическую активность в течение 4-5 сут, а растворы трипсина и фибринолизина - лишь в течение 12 ч.

Клинические испытания препарата протолизин при лечении больных с кровоизлияниями и помутнениями стекловидного тела показали эффективность применения этого препарата методом фонофореза. Использовались следующие виды обследования больных: определение остроты и поля зрения, исследования в проходящем свете, офтальмоскопия, определение порога электрической чувствительности по фосфену, эхография. Наблюдаемые больные были разделены на 3 группы. В первую группу входили больные (34 человека, 35 глаз), у которых фонофорез протолизина с активностью 0,5 ПЕ/мл применялся в виде самостоятельного метода лечения. Вторая группа в составе 23 больных (23 глаза) получала фонофорез протолизина в сочетании с другой комплексной терапией. Третью группу (контрольную) составили 21 больной (21 глаз), которым лечение проводилось в виде комплексной общепринятой терапии без применения фонофореза протолизина. Критерием оценки эффективности проводимого лечения служили сроки рассасывания кровоизлияния или помутнения стекловидного тела (в койко-днях), повышение остроты зрения, сокращение длительности пребывания больного в стационаре. Фонофорез протолизина проводили, используя ультразвук частотой 880 кГц, интенсивностью 0,2 Вт/см², длительностью 5 мин. Курс состоял из 6-12-ежедневных сеансов в зависимости от состояния глаза.

Комплексное общепринятое лечение включало применение антибиотиков, сульфаниламидных препаратов, осмо-, аутогемо-, тканевую и витаминную терапию, специфическую гипосенсибилизирующую терапию.

Сравнение результатов лечения в трех группах больных свидетельствует о том, что лучшие результаты наблюдались при использовании фонофореза протолизина в комплексе с другими видами общепринятой рассасывающей терапии (табл. 2).

Повышение остроты зрения на 0,2-0,9 после лечения больных этой группы достигнуто на 14 из 23 глаз, т.е. в 60,8% (табл. 3).

Применение фонофореза протолизина в комплексе с общепринятыми средствами консервативной терапии позволило проводить лечение в минимальные сроки - 10,90,8 дня у больных с кровоизлияниями в стекловидное тело и 17,2 0,4 дня у больных с помутнениями стекловидного тела. Использование фонофореза протолизина в качестве самостоятельного метода лечения больных также приводит к сокращению сроков лечения больных в случае кровоизлияний в стекловидное тело с 18,1 0,8 дня (для больных контрольной группы) до 14,40,9 дня, а в случае помутнения стекловидного тела с 22,70,6 до 20,90,3 дня.

Результаты проведенных клинических испытаний позволяют рекомендовать с целью повышения эффективности лечения включение фонофореза протолизина в комплексную терапию кровоизлияний и помутнений стекловидного тела больных, которым показано нехирургическое лечение.

Протолизин хорошо переносится больными, не обладает раздражающим действием, не разрушает тканей в месте введения, что свойственно протеиназам животного происхождения.

Протолизин обладает хорошим латальным действием, т.е. при введении в глаз действует лишь на девитализированные ткани (гемофтальм, спайки, гной). В отличие от протолизина трипсин и фибринолизин способны разрушать и здоровые ткани.

Протолизин хорошо совместим с антибиотиками и кортикостероидами.

Формула изобретения

ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОФТАЛЬМОЛОГИИ, выделенный из культуры Bacilbis subtilis, характеризующийся тем, что он способен катализировать гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, проявляет специфическую активность при рН 7,0 - 7,5 и температуре 50^oС, наиболее стабилен при рН 7,0 - 8,0 и температуре не выше 20^oС, имеет молекулярную массу протеиназы 80,5 - 34,0 кДа и изоэлектрическую точку 8,3, ингибируется ионами тяжелых металлов и металлохелатными агентами.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 26-2000

(73) Патентообладатель:Автономная некоммерческая организация Научно-технический центр "ЛЕКБИОТЕХ" (RU)

Договор № 9996 зарегистрирован 29.02.2000

Извещение опубликовано: 20.09.2000        

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:Некоммерческое партнерство Научно-технический центр "Лекарства и биотехнология"

(73) Патентообладатель:Некоммерческое партнерство Научно-технический центр "Лекарства и биотехнология"

(73) Патентообладатель:ОАО "Система-Венчур"

Договор № РД0007248 зарегистрирован 16.03.2006

Извещение опубликовано: 10.05.2006        БИ: 13/2006