Способ получения зимогенной формы человеческого белка с

Способ получения зимогенной формы человеческого белка с

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия, в частности рекомбинатная технология получения белков. Сущность изобретения: способ состоит в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рLРС-167G или рLРС-167F, кодирующую зимогенную форму человеческого белка С, культивируют трасформанты 293/рLРС-167G, или 293/р LРС-167F, или АV12/рLРС-167G, или АV12/рLРС, выделяют и очищают целевой продукт. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к новым ДНК-соединениям и клинирующим векторам рекомбинантной ДНК, кодирующим новые зимогенные формы человеческого белка С. Эти зимогены могут быть активированы in vivo одним тромбином с клинически значительной скоростью и более чувствительны к активации тромбин/тромбомодулином, чем нативный зимоген белка С. Векторы экспрессии являются простым и эффективным средством экспрессии этих зимогенов человеческого белка С в рекомбинатных клетках-хозяевах. Нативные зимогены человеческого белка С требуют обработки высокими концентрациями тромбина, или тромбина и тромбомодулина, или другими дорогостоящими ферментами для достижения активации. В данном изобретении предлагается способ получения зимогенных форм человеческого белка С, служащих более хорошими субстратами тромбина и, следовательно, способных активироваться в присутствии более низких концентраций тромбина, тромбин-тромбомодулина или других ферментов. Наиболее важно, что зимогенные формы человеческого белка С по данному изобретению можно активировать тромбином даже в присутствии физиологических ионов Са²⁺, которые ингибируют активацию тромбином нативного зимогена белка С. Новые зимогенные формы человеческого белка С отличаются от известных аминокислотной последовательностью остатка активационного пептида, который отщепляется от зимогенных форм с образованием активированного человеческого белка С. Эти новые зимогенные формы белка С обладают особыми преимуществами при лечении заболеваний крови, включая коагуляцию.

Белок С, витамин К - зависимый плазменный белок, физиологически очень важен для контроля гемостаза и играет важную роль при регулировании свертывания крови. Белок С синтезируется в виде неактивной молекулы, называемой здесь выделившимся белком С. Выделившийся белок С подвергается сложной обработке, давая множество различных неактивных молекул. Неактивная, секретированная форма белка С называется здесь зимогенным белком С. Активация белка С происходит в крови путем реакции с вовлечением тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный белок С вместе с его кофактором - белком S, является антикоагулянтом, имеющим важное физиологическое значение. Активированный белок С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и подавлять рост имеющихся тромбов. Механизм действия активированной формы белка С и механизм активации неактивного зимогена в активную протеазу был прояснен в последние годы ( Gardiner I.E., Griffin I.H., Progress in Hematology, vol XIII. pp. 265-278, ed Elmer B.Brown. Grune and Strattom Inc. , 1983,).

Активация белка С протекает с участием тромбина, последней сериновой протеазы каскада свертывания и связанного с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеина, называемого тромбомодулином. Тромбомодулин образует прочный стехиометрический комплекс с тромбином. Закомплексованный с тромбином тромбомодулин полностью изменяет функциональные свойства тромбина. В норме тромбин свертывает фибриноген, активирует тромбоциты и превращает факторы свертывания V и VIII в их активные формы Va и VIIIa. И наконец, тромбин активирует белок С, но очень малоэффективно и медленно, причем активация ингибируется физиологическими ионами Cа²⁺. В отличие от этого тромбин, закомплексованный с тромбомодулином, не свертывает фибриноген, не активирует тромбоциты и не превращает факторы свертывания V и VIII в их активные формы Va и VIIIa, но становится более активным активатором зимогенного белка С в присутствии физиологических концентраций Са²⁺. Константа скорости активации зимогенного белка С тромбомодулин-тромбином более чем в 1000 раз выше, чем константа скорости для одного тромбина.

Для понимания того, как активированный белок С снижает свертываемость крови, приводится следующее краткое описание системы свертывающих ферментов. Систему свертывания наиболее удобно представить как цепь реакций, включающую последовательное активирование зимогенов в активные сериновые протеазы. В конце этой цепи реакций вырабатывается фермент тромбин, который путем ограниченного протеолиза превращает плазменный фибриноген в нерастворимый фибриновый гель. Двумя ключевыми моментами каскада свертывания являются превращение фактора свертывания Х в Ха свертывающими фактором IXa и превращение протромбина в тромбин фактором свертывания Ха. Обе эти реакции протекают на поверхности клеток, в основном на поверхности тромбоцитов, и требуют кофакторов. Основные кофакторы, факторы V и VIII циркулируют в системе в виде относительно неактивных предшественников, но как только образуются первые несколько молекул тромбина, они тут же вмешиваются в более ранние стадии и активируют кофакторы путем ограниченного протеолиза. Активированные кофакторы, Va и VIIIa, ускоряют как превращение протромбина в тромбин, так и фактора Х в фактор Ха приблизительно на 5 порядков. Активированный белок С в основном вызывает протеолитическое разложение, гидролиз и необратимое разрушение факторов свертывания Va и VIIIa, активных форм неактивных факторов свертывания V и VIII. В отличие от этого свертывающие факторы V и VIII являются очень плохими субстратами активированного белка С in vivo.

Важным кофактором для активированного белка С является белок S, другой витамин - К-зависимый плазменный белок. Белок S значительно (в 25 раз) усиливает вызываемый активированным белком С гидролиз факторов Va и VIIIа.

Белок С считается ценным терапевтическим агентом (Европейские патенты N , 215549 и 0191606). Активированный белок С является новым антикоагулянтом, имеющим более широкий терапевтический индекс, чем доступные антикоагулянты, такие как гепарин и орально вводимые антикоагулянты типа оксикумарина. Ни зимогенный белок С, ни активированный белок С не являются эффективными до момента появления тромбина, поскольку тромбин необходим для превращения факторов свертывания V в Va и VIII в VIIIa, активированные формы этих двух кофакторов являются предпочтительными субстратами для активированного белка С. Тромбин необходим также для активирования зимогенного белка С, причем без тромбомодулин-тромбинового комплекса зимоген белка С не превращается в активную форму.

Существует потребность в активированном белке С как в антикоагулянте, поскольку активированный белок С инактивирует кофакторы Va и VIIIa. Поскольку тромбин необходим для превращения факторов V и VIII в их активные формы Va и VIIIa, то белок С начинает действовать как антикоагулянт только после образования тромбина. Обычные антикоагулянты в отличие от активированного белка С поддерживают стабильное антикоагулянтное состояние через циркуляцию в течение того времени, пока пациенту вводится антикоагулянт, поэтому в данном случае значительно повышается риск кровотечений по сравнению с белком С или активированным белком С. Активированный белок С нужен как антикоагулянт широкого клинического применения для использования в качестве антикоагулянта, альтернативного гепарину и оксикумаринам.

При некоторых заболеваниях, таких как наследственный дефицит белка С, зимоген белка С очень важен терапевтически. При врожденном гомозигозном дефиците белка С смерть наступает в раннем младенческом возрасте от purpura fulminans, частой летальной формы диссеминирующего внутрисосудистого тромбоза. При гетерозиготном дефиците белка С пациенты тяжело страдают от повторных тромбоэмболий. Клинически надежно установлено, что концентраты плазменного белка, предназначенные для лечения гемофилии В или дефицита фактора IX, содержащие белок С в качестве примеси, эффективны при предупреждении и лечении внутрисосудистого тромбоза и гетерозиготного дефицита белка С. Было обнаружено, что концентрация белка С является ненормально низкой при тромботических состояниях, таких как диссименирующий внутрисосудистый тромбоз, и при заболеваниях, располагающих к тромбозу, таких как большая травма, крупное хирургическое вмешательство и рак.

Для облегчения понимания изобретения и активации белка С ниже представлены кодирующая последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность выделившегося человеческого белка С. Эта аминокислотная последовательность и ее соответствующие части характеризуют также нативный человеческий белок С для целей данного изобретения. 10 5^'-ATG TGG CAG C ACA AGC C CTG CTG TTGTG GCC ACC G GGA ATT H₂N-MET TRP GLN LEU HR SER LEU LEU LEU E VAL ALA THR TRP Y ILE 15 T GGC ACA CCGCT CCT CTT C TCA GTG T TCC AGC AGGAG CGT SER GLY THR O ALA PRO LEU ASP R VAL PHE SER SER R GLU ARG 20 GCC CAG GTG CCGG ATC CGAA CGT GCC TCC TTC CGAG ALA HIS N VAL LEU ARG ILE G LYS ARG ALA ASN R PHE LEU GLU 25 GAG CTGT CAC AGC CTG GAG CGAG TGC ATAG GAG ATC GLU U ARG HIS SER SER U GLU ARG GLU CYS E GLU GLU ILE CYS 30 GAC TTC GGAG GCC AAAA ATT TTC AAT GTG GGAC ACA CT P PHE GLU GLU ALA S GLU ILE PHE GLN N VAL ASP ASP THR U 35 GCC TTC TGG AAG CAC GGAC GGT GAAG TGC TTG TTG CCC ALA PHE TRP SER S HIS VAL P GLY ASP GLN CYS U VAL LEU PRO 40 TGAG CAC CCGC GCC AGC TGC TGC GCAC GGC ACGC ATC LEU GLU HIS CYS ALA SER LEU CYS GLY HIS GLY CYS ILE GAC ATC GGC ATTC AGC TGAC TGC CGC GGC TGG GGGC ASP GLY GLY SER PHE SER ASP CYS ARG SER TRP GLU GLY 5 CGC TTGC CAG CGC GTG AGC TCTC AAT TGCG CTG GAC ARG CYS GLN ARG GLU SER PHE LEU ASN SER LEU ASP ASN 10 GGC GGC TACG CAT TAGC CTA GAG GTG GGC TCGG CGC TG GLY CYS THR HIS CYS LEU GLU GLU GLY TRP ARG ARG 15 AGC TGT GCG GGC TAC ACTG GGG GAAC CTC CTG TGT CAC SER CYS ALA PRO TYR LYC LEU GLY ASP LEU LEU GLN HIS 20 CGCA GTG AATC CCT TGT AGG CCC TAAG CGG ATAG AAC PRO ALA VAL PHE PRO CYS GLY PRO TRP LYS ARG GLU LYS 25 AAG AGT CAC CAAA CGA GACA GAA GAC GAA GAC CGTA LYS ARG HIS LEU LYS ARG THR GLU ASP GLN ASP GLN VAL 30 GAT CCGG CTC ATT GGG AAG AACC AGG CGGA GAC AGC ASP ARG LEU ILE ASP LYS MET THR ARG GLY ASP SER PRO 35 TGG CAG GGTC CTG CTAC TCA AAG AAG CTG GTGC GGG GC GLN VAL VAL LEU ASP SER LYS LYS LEU ALA CYS GLY 40 GTG CTC ATC CCC TCC TGTG CTG ACCG GCC CAC ATG GAT VAL LEU ILE HIS SER TRP VAL LEU ALA ALA HIS CYS ASP 45 GTCC AAG AATC CTT GTC CTT GGA GTAT GAC CTGG CGC GLU SER LYS LEU LEU VAL ARG GLY GLU TYR ASP ARG ARG 5 TGG AAG TGG GCTG GAC CTAC ATC AAG GTC TTC GCAC TRP GLU TRP GLU LEU ASP ASP ILE LYS GLU PHE VAL HIS 10 CCC AAAC AGC AAG ACC ACC GAAT GAC ATCA CTG CTG PRO TYR SER LYS SER THR ASP ASN ASP ALA LEU LEU HIC 15 CTG GCC CCCC GCC ACTC TCG CAG ATA GTG CATC TGC CT ALA GLN PRO ALA LEU SER GLN THR VAL PRO ILE CYS 20 CCG GAC AGC CTT GCA GCGC GAG CTAT CAG GCC CAG GAG PRO ASP SER GLY ALA GLU ARG GLU ASN GLN ALA GLY GLU 25 ATC GTG ACC TGG GGC CAC AGC AGA GAG AAG GCC THR LEU VAL GLY TRP GLY TYR SER SER ARG GLU GLU ALA 30 AAG AAC CGC ATC GTC CTC TTC ATC ATT CCC GTC LYS ARG ARG THR THE VAL ASN PHE ILE LYS PRO VAL VAL 35 CCG CAT GAG TGC GAG GTC AGC AAC ATG TCT GAG PRO ASN GLU CYS SER VAL MET SER ASN VAL SER GLU ASN 40 ATG CTG TCG GGC ATC GGG GAC CAG GAT GGC GGG GG LEU CYS ALA GLY LEU GLY ASP ARG ASP ALA CYS GLU 45 GAC AGT GGG CCC ATG GCC TCC TTC GGC ACC TTC CTG ASP SER GLY GLY MET VAL ALA SER HIS GLY THR TRP LEU 5 GGC CTG GTC TGG GGT GGC TGT GTC CTT CAC TAC VAL GLY LEU SER TRP GLY GLU CYS GLY LEU LEU ASN TYR 10 GGC TAC ACC ATC AGC CGC CTC GAC ATC CAT GAC GLY VAL THR LYS VAL SER TYR LEU ASP TRP HIS GLY HIS 15 ATC AGC AAG GAA CCC CAG AGC TGG GCT TAG-3^' ILE ASP LYS GLU ALA GLN LYS SER TRP PRO-COOH 20 где А -дезоксиаденил; G - дезоксигуанил; С - дезоксицитидил; Т - тимидил; АLA - аланин; ARG - аргинин; ASN - аспарагин; ASP - аспарагиновая кислота; -СООН - концевая карбоксильная группа; CYS - цистенин; GLM - глутамин; GLU - глутаминовая кислота; GLY - глицин; Н₂N - концевая аминогруппа; HIS - гистидин; Н₂N - концевая аминогруппа; ILE - изолейцин; LEU - лейцин; LYS - лизин; МЕТ - метионин; РНЕ - фенилаланин; PRO-пролин; SER - серин; ТНР - треонин; TRP - триптофан; TYR - тирозин; VAL - валин.

Указанная ДНК-последовательность получена из ДНК-клонов, полученных из человеческой печеночной м-РНК, кодирующей человеческий белок С. Дегенеративная природа генетического кода дает возможность конструировать множество различных ДНК-последовательностей, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность. Таким образом, указанная к-ДНК-последовательность для выделившегося человеческого белка С представляет собой лишь одну из возможных последовательностей, кодирующих выделившийся человеческий белок С. При конструировании к-ДНК-клонов последовательность 5' poly G, последовательность 3' poly С и обе 5' и 3'-последовательности, распознающие рестрикционный фермент Pst 1, конструируются на концах к-ДНК, кодирующей белок С.

Два из этих к-ДНК-клонов используются для конструирования ДНК-молекулы, включающей в себя как последовательность, кодирующую выделившийся белок С, так и части ДНК, кодирующие нетранслированную м-РНК на концах 5' и 3'-кодирующего участка. Эту молекулу ДНК вводят в Pst 1-сайт плазмиды рВR 322 для конструирования плазмиды рНС7. Таким образом, плазмида рНС7 включает описанную кодирующую последовательность и, снова обозначая лишь одну нить молекулы, содержит также следующие дополнительные последовательности 5'- С TGG AGG GGG GGG GGG GGG CGG GGG CTG TCA TGG CGG CAG GAC GGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC GCC CCT ACA GGT GCC AGT GCC TCC AGA-3' и 5'-CGA CCC TCC CTG CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCT GCA C-3' соответственно на концах 5' и 3' нити кодирующей последовательности для выделившегося человеческого белка С. В силу комплементарной природы пар оснований ДНК последовательность одной нити двунитевой молекулы ДНК достаточна для определения последовательности другой нити. Плазмиду рН С7 можно обычным образом выделить из Е.coli К 12 RRI/рHC7 депонированного штамма, составляющего часть постоянной коллекции культур Исследовательской Лаборатории Северного Региона (NRRL) в Пеории, штат Иллинойс. Культура E.coli K12 RRI/рНС7 может быть получена из NRRL, где она хранится под номером В-15926. Рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды рНС7 представлены на фиг.2.

Выделившийся белок С можно также представить схематически следующим образом где pre-pro - последовательность аминокислотных остатков 1-42, кодирующая сигнальный пептид и пропептид человеческого белка С, важный для направленной секреции и -карбоксилирования белка С; LC - последовательность аминокислотных остатков 43-197 выделившегося белка С, однократно посттрансляционного модифицированного, составляет легкую цепь (LC) как двухцепочечного зимогена, образованного из одноцепочечного зимогена отщеплением KR-дипептида, так и активированных форм белка С; KR - последовательность аминокислотных остатков 198-199 выделившегося человеческого белка С, считается, что эти остатки отщепляются (на основании гомологичности с бычьим белком С), возможно в две стадии, включающие в себя сначала расщепление (по остаткам 197-198 или 199-200), а затем действие карбоксипептидазы или аминопептидазы с образованием двухцепочечного белка С; АР - последовательность аминокислотных остатков 200-211 выделившегося белка С, включающая в себя активационный пептид, отщепляемый от зимогенных форм С с образованием активированного белка С; АНС - последовательность аминокислотных остатков 212-461 выделившегося белка С, однократно посттрансляционного модифицированного, составляет активированную тяжелую цепь (АНС) активного белка С; НС - тяжелая цепь двухцепочечной формы зимогена белка С, однократно посттрансляционно модифицированного, состоит из аминокислотных остатков 200-461, АР и АНС.

Зимоген человеческого белка С является предшественником сериновой протеазы, синтезируемым в печени и присутствующим в крови Для проявления полной биологической активности белок С требует посттрансляционных модификаций, для которых необходим витамин К. Двухцепочечный связанный дисульфидным мостиком зимоген белка С образуется из одноцепочечного зимогена ограниченным протеолизом. Считается, что этот ограниченный протеолиз включает отщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199. Активация двухцепочечного зимогена в активную сериновую протеазу включает в себя протеолитическое расщепление пептидной связи ARG-LЕU (остатки 211 и 212). Это последнее расщепление освобождает додекапептид (остатки 200-211), активационный пептид, составляющий аминоокончание большей (тяжелой) цепи двухцепочечной молекулы зимогена. Белок С гликозилирован в значительной степени; фермент содержит около 23% углеводов. Белок С содержит также большое количество необычных аминокислот, включая -карбоксиглутаминовую кислоту и -оксиаспарагиновую кислоту (эритро-L- -оксиаспарагата). -Карбоксиглутаминовая кислота (gla) образуется -глутамилкарбоксилированием из остатков глутаминовой кислоты с помощью гепатической микросомальной карбоксилазы, требующей витамина К как кофактора.

Активацию человеческого белка С также можно представить схематически, как это показано ниже. Порядок стадий, указанный в схеме, необязательно отражает порядок стадий процесса, протекающего in vivo.

pre-pro-LC-KKR-AP-AHC, выделившийся белок С посттрансляционная модификация, | т.е. -карбоксилирование | особых остатков глутаминовой | кислоты. -гидроксилирование | остатков аспарагиновой кислоты | и гликозилирование, секретирование, удаление остатков | 1-42, что может включать в себя | более чем одно протеолитическое | расщепление LC-KR-AP-AHC, одноцепочечный зимоген удаление остатков 198-199, | приблизительно 90% зимо- | генного белка С найдено в | человеческой крови. | является двухцепочечной | формой (S- S это дисульфид- | ная связь) двухцепочечный зимоген S- активация комплексом | тромбинтромбомодулин активированный белок С S- В данном изобретении предлагаются новые соединения, векторы, трансформанты и способы для рекомбинантной экспрессии новых зимогенов белка С.

В изобретении используются следующие термины: Ad2 LP - основной поздний промотор аденовируса типа 2.

Аминокислотные остатки в описываемых белках и пептидах имеют следующие сокращения. ______________________________________________________________________ Трехбуквенное Аминокислотный Однобуквенное сокращение остаток сокращение ______________________________________________________________________ PHE Фенилаланин F LEU Лейцин L ILE Изолейцин I МЕТ Метионин М VAL Валин V SER Серин S PRO Пpолин Р THR Треонин Т ALA Аланин А TYR Тирозин Y HIS Гистидин Н GLM Глутамин Q ASN Аспарагин N LYS Лизин К ASP Аспарагиновая кислота D GLU Глутаминовая кислота Е CYS Цистеин С TRP Триптофан W ARG Аргинин R GLY Глицин G АрR - устойчивый к ампициллину фенотип или соответствующий ему ген; ВК - ДНК из ВК-вируса, САТ - хлорамфениколацетилтрансферазный ген, Enh или усилитель - усилитель ВК-вируса, ер или SV 40 ер - ДHК-сегмент, включающий в себя ранний промотор 40 гена Т-антигена, сайты связывания Т-антигена, усилитель SV 40 и SV 40 - начало репликации, -карбоксилирование - реакция введения карбоксильной группы в глутаминовые кислоты по -углероду, -карбоксилированный белок - белок, в котором некоторые остатки глутаминовой кислоты подверглись -карбоксилированию, IVS - ДНК, кодирующая интрон, называемый также последовательностью введения, ММТ pro - промотор мышиного гена металлотионеин-1.

Выделившийся белок - полипептид, образующийся при трансляции м-РНК-транскрипта до каких-либо посттрансляционных модификаций. Однако такие посттрансляционные модификации, как -карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспарагиновой кислоты, могут происходить до полной трансляции белка из м-РНК-транскрипта.

NeoR - ген, придающий устойчивость к неомицину, который можно использовать также для придания устойчивости к антибиотику Gf 418.

рА-ДНК - последовательность, кодирующая сигнал полиадениляции.

Промотор - последовательность ДНК, направляющая транскрипцию ДНК в РНК.

Активность белка С - любые свойства человеческого белка С, ответственные за протеолитическую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую (антикоагулянтную или профибринолитическую) и биологическую (антикоагулянтную или профибринолитическую) активность. Способы испытаний белковой антикоагулянтной активности хорошо известны (см.Grinnell и др., 1987, Biotechnology 5:1189).

Клонирующий вектор рекомбинантной ДНК - любой агент, включающий в себя, например, хромосомальные интегрирующие агенты, плазмиды автономной репликации и фаги, содержащие ДНК-молекулу, к которой может или должен быть присоединен один (или больше) сегмент ДНК.

Вектор экспрессии рекомбинатной ДНК - любой клонирующий вектор рекомбинатной ДНК, в который введен промотор, расположенный так, чтобы промотировать экспрессию генного продукта.

Вектор рекомбинантной ДНК - любой вектор экспрессии или клонирующий вектор рекомбинантной ДНК.

Репликон-ДНК - последовательность, позволяющая протекать автономной репликации плазмиды или другого вектора и контролирующая этот процесс.

Рестрикционный фрагмент - любая линейная ДНК - последовательность, образующаяся под действием одного или больше рестрикционного эндонуклеазного белка.

Чувствительная клетка-хозяин - клетка-хозяин, которая не может расти в присутствии данного антибиотика или другого токсического соединения без ДНК-сегмента, придающего устойчивость к этому агенту.

ТcR - устойчивый к тетрациклину фенотип или ответственный за это ген.

Трансформация - введение ДНК в реципиентную клетку-хозяина, изменяющее генотип реципиентной клетки.

Трансформант - реципиентная клетка-хозяин, подвергшаяся трансформации.

Последовательность, активирующая трансляцию, - любая ДНК-последовательность, включающая последовательность, кодирующую рибосомальный связывающий сайт и кодон начала трансляции, такой как 5'-ATG - 3', нужная для трансляции м-РНК-транскрипта в пептид или полипептид.

Зимоген - ферментативно-неактивный предшественник протеолитического фермента. Зимоген белка С соответствует секретированным, неактивным формам - одноцепочечным или двухцепочечным - белка С.

На фиг.1 показано конструирование плазмиды рLPC часть Д. Окончательное конструирование плазмиды pLPC; на фиг.2 - конструирование плазмиды рL133, исходного соединения для конструирования плазмиды рLPC.

Данное изобретение относится к ДНК-соединениям, кодирующим экспрессию новых зимогенных форм человеческого белка С. Было описано несколько способов получения нативного зимогена человеческого белка С и выделившегося белка С (Европейские патенты N 215543 и N 191606). Этими известными способами достигается экспрессия зимогенных форм человеческого белка С, не отличающихся от зимогенных форм, присутствующих в человеческой крови. Зимоген белка С, получаемый этими способами, должен быть обработан такими соединениями, как -тромбин, трипсин или смесь тромбина и тромбомодулина in vivo или in vitro для получения активированного белка С. Кроме того, зимогенная форма человеческого белка С, получаемая технологией рекомбинантной ДНК, идентична зимогенным формам человеческого белка С, естественно присутствующим в человеческой крови, и активируется в теле лишь естественным путем, включающим тромбин-тромбомодулиновый комплекс. Нативный зимоген человеческого белка С можно активировать одним тромбином, однако активация требует отсутствия СА²⁺ и таких высоких концентраций тромбина и/или зимогена белка С, что не существует путей in vivo для значительной активации белка С.

В данном изобретении предлагаются зимогенные формы человеческого белка С, которые могут активироваться in vivo одним тромбином с клинически значительной скоростью. Кроме того, эти зимогенные формы легче подвергаются активации тромбин/тромбомодулином, чем нативный зимоген человеческого белка С. В способе предлагаются также ДНК-соединения, векторы экспрессии рекомбинатной ДНК, трансформированные линии клеток и способы рекомбинатной экспрессии этих новых зимогенных форм человеческого белка С. Способ получения этих зимогенных форм человеческого белка С включает в себя: (А) трансформирование эукариотной клетки-хозяина вектором рекомбинатной ДНК, где указанный вектор содержит: (r) ДНК-последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, где последовательность аминокислотных остатков от аминоокончания до карбоксиокончания включает в себя: а) сигнальный пептид и пропептид -карбоксилированного, секретированного белка; b) легкую цепь человеческого белка С; с) депептид, выбранный из группы, состоящей из LYS-ARG, ARG-LYS, LYS-LYS и ARG-ARG и d) следующую аминокислотную последовательность: ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL ₁₀ R₁ R₂ ARG LEU ILE R₃ GLY LYS MET THP ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASR SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP 15 GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ILE ASP LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS ²⁰ LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU 25 THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN ³⁰ MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS DLY THR TRP PHE LEU 35 VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH 40 где R₁ выбирают из группы, включающей PHE, GLY, TYR и TRR; R₂ выбирают из группы, включающей VAL и PRO; R₃ выбирают из группы, включающей ASP и ASN; ARG - аргнинин; ASN - аспарагин; ASP - аспарагиновая кислота; -СООН - карбоксиокончание; СуS - цистеин; GLN - глутамин; GLU - глутаминовая кислота; GLY - глицин; HIS - гистидин; ILE - изолейцин; LEU - лейцин; LYS - лизин; МЕТ - метионин; РНЕ - фенилаланин; PRO - пролин; SER - серин; THR - треонин; TRP - триптофан; TYR - тирозин; VAL - валин; (ii) промотор, расположенный так, что промотирует экспрессию указанной ДНК-последовательности; (В) культивирование указанной клетки-хозяина, трансформированной на стадии (А), в условиях, позволяющих протекать экспрессии указанной ДНК-последовательности.

В изобретении предлагаются также ДНК-соединения для использования в способе получения этих новых зимогенных форм человеческого белка С. Все эти новые соединения кодируют препропептид, содержащий сигнальный пептид для направления секреции и пропептид из -карбоксилированного (под действием витамин К-зависимой карбоксилазы) белка. Такие пропептидные последовательности хорошо известны в данной области. (Suttil и др., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 634-637). Предпочтительно, для облегчения конструирования, чтобы последовательность, кодирующая сигнальный пептид, и последовательность, кодирующая пропептид, были получены из аминокислотной последовательности препропептида -карбоксилированного белка. Примерами таких -карбоксилированных белков являются фактор VII, фактор IX, фактор Х, протромбин, белок S, белок Z, белок С. ДНК-последовательность, кодирующая препропептид человеческого белка С, наиболее предпочтительна для использования в векторах по данному изобретению.

ДНК-соединения по данному изобретению включают в себя также последовательность, кодирующую легкую цепь человеческого белка С, расположенную в трансляционной структуре считывания сразу за последовательностью, кодирующей препропептид. Легкая цепь человеческого белка С содержит аминокислотные последовательности 43-197 выделившегося белка С. Аминоконцевые части витамин К-зависимых плазменных белков, такие как аминоконцевая часть легкой цепи белка С, ответственны за связывающую кальций активность этих белков. Связывающие кальций домены этих плазменных белков, таких как фактор VII, фактор IX, фактор Х, протромбин и белок S, взаимозаменяемы и эквивалентны связывающему кальций домену легкой цепи человеческого белка С.

ДНК-соединения по данному изобретению включают в себя также последовательность, кодирующую дипептид LYS-ARG (KR), расположенную в трансляционной структуре считывания сразу за последовательностью, кодирующей легкую цепь. Дипептит-диоснование, такой как LYS-ARG, расположен в выделившемся белке на карбоксиконцевом участке легкой цепи. Ориентация дипептита LYS-ARG в экспрессированном белке не играет роли для достижения целей данного изобретения. Дипептид-диоснование, такой как LYS-LYS или ARG-ARG, эквивалентен дипептиду LYS-ARG с точки зрения достижения целей данного изобретения. Предпочтителен дипептид LYS-ARG, который является дипептидом в нативном человеческом белке С.

Сразу за кодонами дипептида LYS-ARS следует последовательность, кодирующая активационный пептид. В соединениях по данному изобретению изменения в последовательности, кодирующей активационный пептид (и в соответствующей аминокислотной последовательности), прежде всего ответственны за свойство повышенной чувствительности этих новых зимог