Штамм streptomyces fradiae - продуцент тилозина

Штамм streptomyces fradiae - продуцент тилозина

Реферат

 

Использование: микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Streptomyces fradiae ВКПМ-S 1112 получен методом направленной селекции культуры Streptomyces fradiae с применением антибиотика церуленина, солей арсената натрия и аналога глюкозы. Он характеризуется улучшенными технологическими свойствами, устойчивостью к актинофагам, стабильностью признака антибиотикообразования и устойчивостью к катаболитной репрессии и ингибированию неорганическим фосфором. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству макролидного антибиотика тилозина, используемого в животноводстве и ветеринарии для лечения сельскохозяйственных животных, а также в качестве стимулятора роста молодняка птицы и крупного рогатого скота.

Известны штаммы Streptomyces fraadiae - продуценты антибиотика тилозина, отселектированные с применением мутагенов химической и физической природы [1, 2].

В описании изобретения к авторскому свидетельству НРБ N 20697 приводятся данные о штамме Streptomyces fradiae Б-45, имеющем активность 1330 ед/мл тилозина. Этот штамм был передан во Всесоюзную коллекцию промышленных микроорганизмов и согласно акту передачи синтезирует 1770 ед/мл.

Коллекционный номер штамма ВКПМ-542. Имеется ряд публикаций, касающихся механизма биосинтеза антибиотика, генетики продуцента, а также биологической и химической трансформации тилозина.

Для повышения продуктивности культуры в ферментационные среды добавляют продукты деградации тилозина: дезмикозин, тилонолид, микаминозу, мицинозу и микарозу (патент США N 3433711, патент Англии N 1155310, патент Франции N 1497830).

Стимуляция биосинтеза тилозина также может быть достигнута добавлением в ферментационную среду натриевой соли фумаровой или малеиновой кислот (авт. свид. НРБ N 25152). Кроме указанных веществ для увеличения скорости образования тилозина в среду добавляют глутамат натрия (авт. свид.. N 20697).

В последние годы появились патенты, касающиеся различных производных тилозина (патенты США N 4385116, 4528369, 4440857 фирмы Еli Lilly).

В описании изобретения к авторскому свидетельству СССР N 755837 [2] приводятся данные об активности предлагаемого штамма, (шт. 3830), который на 216 ч ферментации синтезирует в среднем 3820 ед/мл антибиотика тилозина.

Недостатками штамма-прототипа являются его низкая антибиотическая активность, чувствительность к производственным актинофагам Pg-56 и Pg-57, фосфорному ингибированию и катаболитной репрессии углеродом, что значительно снижает выход тилозина в промышленных условиях.

Данные лабораторных микробиологических исследований свидетельствуют о том, что в штамме-прототипе 3830 актинофаги Pg-56 и Pg-57 с высокой эффективностью развиваются как на твердой, так и в жидкой питательной средах, достигая титра для обоих фагов порядка 110¹⁰-110¹¹ фаговых частиц на 1 мл.

Цель изобретения - получение нового варианта штамма культуры Str. fradiae, обладающего улучшенными технологическими свойствами, фагоустойчивостью и повышенным синтезом антибиотика при промышленном получении препарата тилозина, устойчивого к катаболитной репрессии углеродом и ингибированию неорганическим фосфором.

Новый штамм Str. fradiae ВНИИгенетика-25В получен направленной селекцией культуры Str. fradiae с применением антибиотика церуленина, солей арсената натрия и аналога глюкозы 2-дезоксиглюкозы и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-S-1112.

Полученный штамм Str. fradiae ВКПМ-S-1112-устойчив к актинофагам Pg-56 и Pg-57, обладает повышенным синтезом антибиотика, устойчив к катаболитной репрессии углеродом и ингибированию неорганическим фосфором.

В табл. 1 и 2 приведены данные по эффективности титрования и развитии актинофагов Pg-56 и Pg-57 на твердой и жидкой средах для предлагаемого штамма и штамма-прототипа.

В табл. 3 приведены данные по сохранению стабильности при многократных пересевах при промышленном использовании предлагаемого штамма по сравнению с прототипом.

На чертеже показано изменение антибиотической активности у предлагаемого штамма и штамма-прототипа на регламентной среде и средах с избытком неорганического фосфора и глюкозы. Из приведенных данных видно, что на средах с избытком глюкозы и неорганического фосфора происходит ингибирование синтеза тилозина у штамма-прототипа почти на 50%, а у предлагаемого штамма в обоих случаях активность сохраняется полностью.

Характеристика штамма Str. fradiae ВКПМ-S-1112. Морфологические и культуральные признаки Клетки мицелия нитевидной формы, спороносцы прямые и крючкообразные, споры гладкие и овальные.

Рост на агаразованных средах Ваксмана и СР-15 (на десятые сутки роста при 29^оС).

На среде Гаузе 1 штамм Str. fradiae ВКПМ-S-1112 образует выпуклые колонии диаметром 5-6 мм, округлые с ровными или слегка изрезанными краями. Воздушный мицелий обильный, белого или светло-кремового цвета, край колоний слабо опущенный.

На среде Ваксмана штамм характеризуется слабо развитым белым воздушным мицелием, субстратный мицелий светло-кремовый. Колонии округлые, слегка выпуклые в центре, с диаметром 5-6 мм. Диффундирующий пигмент отсутствует на всех средах. На жидкой ферментационной среде (состав приводится ниже) штамм ВКПМ-S-1112 образует крупные сплетения мицелия с хорошо выраженной базофилией.

На среде СР-15 образует колонии диаметром 8-10 мм, округлые, плоские, воздушный мицелий светло-серый. Обратная сторона колонии темно-серая.

Физиологические и биохимические свойства.

Желатину не разжижает, крахмал гидролизует, хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, рамнозу, слабее - арабинозу, ксилозу, целлюлозу, лактозу. Источники азота. Хорошо растет на синтетических питательных средах, содержащих минеральные источники азота (хлористый, азотнокислый и сернокислый аммоний, азотнокислый калий), При культивировании штамма ВКПМ-S-1112, кроме минеральных источников азота, могут быть использованы также источники органического азота, например соевая, кукурузная и рыбная мука, соевый или мясной пептон, казеин.

В качестве источника углерода может быть использован крахмал, меласса, кукурузный экстракт, глюкоза. Источником ростовых факторов может служить дрожжевой экстракт и смесь аминокислот.

Оптимальная величина рН всех используемых сред для штамма ВКПМ-S-1112 составляет 7,4-7,7, оптимальный температурный режим 29^оС. Штамм продуцент сохраняют на скошенном агаре при 4^оС и в лиофильно высушенном состоянии: а также при t= -70^оС.

Антагонистические свойства.

Продуцируемый штаммом антибиотик тилозин подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, сарцин, активен против микоплазмы.

Штамм не патогенен.

Пример использования штамма.

Колонии штамма Str. fradiae ВКПМ-S-1112 выращивают в течение 8-10 сут на агаризованной среде СР-15 следующего состава: соевая мука 5 г - 0,5%, кукурузный экстракт 5 г - 0,5%, меласса 5 г - 0,5% , крахмал 5 г - 0,5%, (NH4)₂SO₄ 500 мг - 0,05%, MgSO₄ 700 мг - 0,07%, NaCl 500 мг - 0,05%, СаСО₃ 1 г - 0,1%, агар 20 г - 2%. Затем пересевают на косяки с этой же средой. Культуру на косяках выращивают при 29^оС в течение 10-12 сут.

Посевным материалом, выращенным на косяках, засевают колбы Эрленмейера объемом 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, мас.%: соевая мука 0,5; дрожжи БВК 0,3; кукурузный экстракт 0,3; мел 0,3; соевое масло 0,3 мл в каждую колбу, водопроводная вода до 100 мл.

Инокулят выращивают при t =29^оС в течение 48 ч на качалке, имеющей 220 об/мин. Затем 5% инокулята переносят в колбы с ферментационной средой следующего состава, мас.%: рыбная мука 2,0; меласса 2,0; крахмал 1,5; однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,02; хлористый натрий 0,2; сернокислый магний 0,2; мел 0,3; соевое масло по 2 мл в каждую колбу, водопроводная вода до 100 мл.

Ферментацию проводят на круговой качалке при 220 об/мин и температуре 29^оС. Количество тилозина определяют микробиологическим методом диффузии в агар с использованием в качестве тест-культуры Bac. subtilis 720.

Через 160 ч ферментации в среде накапливается антибиотик тилозин на 100% больше, чем на 216 ч ферментации при использовании штамма-прототипа.

Для проверки штамма ВКПМ-S-1112 на устойчивость к актинофагам Pg-56 и Pg-57 получают чистые культуры актинофагов, размножают актинофаги двухслойным методом, внося в верхний слой среды ПКА-5 с 0,8% агара (пропись среды приведена ниже) приблизительно 110³ спор чувствительной культуры и актинофаг в количестве, достаточном для образования слившихся негативных колоний. Через 18-20 ч инкубации верхний слой снимают шпателем и центрифугируют 15-20 мин при 5 тыс. об/мин. Проверку выросшей культуры штамма ВКПМ-S-1112 на устойчивость к актинофагам проводят на твердой питательной среде ПКА-5 следующего состава, мас.%: глюкоза 1,0; кукурузный экстракт 0,5; хлористый натрий 0,5; хлористый кальций 0,05; агар 1,5. Для этого полученные актинофаги наносят на культуру штамма ВКПМ-S-1112. Отсутствие негативных колоний на чашке свидетельствует об устойчивости заявляемого штамма к фагам Pg-56 и Pg-57.

Таким образом, основными отличительными признаками предлагаемого штамма ВКПМ-S-1112 является его высокая антибиотическая активность, фагоустойчивость, способность сохранять исходную активность при многократных пересевах, устойчивость к катаболитной репрессии глюкозой и к ингибированию неорганическим фосфором, а также укороченный процесс ферментации.

Совокупность полученных новых признаков делает заявляемый штамм более технологичным и при использовании его в промышленных условиях позволяет снизить себестоимость выпускаемого продукта тилозина, увеличив его продуктивность за счет съема продукта с 1м³ среды.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces fradiae - S - 1112 - продуцент тилозина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2