Способ получения растений, устойчивых к насекомым

Способ получения растений, устойчивых к насекомым

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия растений, получение устойчивых к насекомым растений. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую химерный ген, содержащий промотор CaMV35S или MAS, или SSRUBISCO, последовательность ДНК, кодирующую кристаллический белок B.thuringiensis, токсичный для жесткокрылых и 3¹ -нетранслируемую последовательность гена накоплении белка сои культурной. 29 ил., 6 табл.

Изобретение относится к области генной инженерии, биохимии и трансформации растений, в частности касается трансформации растительных клеток, приводящей к экспрессии химерного гена, кодирующего белок, токсичный для жесткокрылых насекомых.

Bacillus thuringiensis (B.t.) является спорообразующей почвенной бактерией, которая известна как бактерия, способная продуцировать параспоровый кристаллический белок, токсичный для широкого круга насекомых. Большинство штаммов активны по отношению к чешуекрылым насекомым (моли и мотылькам) и немногие штаммы активны по отношению к двукрылым насекомым (москитам и комарам, см. Aronson и др., 1986 г.) Токсиновые гены от различных штаммов были клонированы, и токсины были экспрессированы в гетерологических хозяйствах (Schnepf и др. 1981 г.; Klier и др., 1982 г.). За последние годы были идентифицированы штаммы В. t. вида tenebrionis (B.t.t., Krieg и др., 1983 г; Krieg и др. , 1984 г.) и В.t. вида san diego (B.t. sd., Herrnstadt и др., 1986) как штаммы, активные по отношению к жесткокрылым насекомым. Был клонирован токсиновый ген от В.t.sd., но токсин, продуцируемый в Е.сoli был больше по своему объему, чем токсин из кристаллов В.t.sd., но активность этого рекомбинантного токсина B.t.sd. была меньше.

Насекомые, чувствительные к действию белкового токсина бактерий Bacillus thuringiensis колеоптеранового типа (для жесткокрылых) включают (но не ограничиваются ими); жука колорадского (Leptinotarsa decemlineata), долгоносика хлопкового (Anthonomus grandis), желтого мучного червя (Tenebrio molitor), жука-листоеда (Pyrrhalta luteola) и южную блошку длинноусую (Diabrotica undecimpunctata howardi).

Таким образом, можно заранее предвидеть возможности растений, выращенных с использованием способов генной инженерии, которые обнаруживают токсичность или стойкость к жесткокрылым насекомым, если такие растения могут быть трансформированы таким образом, что экспрессируют токсин колеоптеранового типа в инсектицидно эффективном количестве. Сельскохозяйственные культуры, имеющие важное промышленное значение, на которые отрицательно воздействуют жесткокрылые насекомые, включают люцерну, хлопок, кукурузу, картофель, капусту (редьку), рис, табак, томаты, сахарную свеклу и подсолнух.

Хотя некоторые химерные гены были экспрессированы в трансформированных растительных клетках и растениях, эта экспрессия никак не является прогрессирующим. В частности, особенно проблематичная экспрессия белков токсина В.t. лепидоптеранового типа (для чешуекрылых). Имеющиеся в литературе данные, как было теперь установлено, касающиеся токсиновых белков лепидоптеранового типа (для чешуекрылых) В.t. в растениях, не распространяются на токсиновые белки В.t. колеоптеранового типа (для жесткокрылых). Этот вывод прямо противоположен существующим ранее утверждениям, согласно которым считалось, что можно осуществлять одни и те же генетические манипуляции для получения полезного выражения таких токсинов в трансформированных растениях.

Согласно одному из аспектов изобретения предусматривается способ получения генетически трансформированных растений, которые выражают токсичность по отношению к жесткокрылым насекомым, включающий: (а) вставку в генном растительной клетки, чувствительной к жесткокрылым насекомым, химерного гена, включающего: (i) промотор, который функционирует в растительных клетках таким образом, что вызывает продуцирование рибонуклеиновой кислоты (РНК); (ii) последовательность дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая вызывает продуцирование последовательности РНК, кодирующей токсиновый белок Bacillus thuringiensis колеоптеранового типа; и (iii) 3' нетранслированную последовательность ДНК, которая функционирует в растительных клетках таким образом, что вызывает присоединение аденилатнуклеотидов к 3' концу последовательности РНК; (b) получение трансформированных растительных клеток и (с) регенерацию из трансформированных растительных клеток генетически трансформированных растений, проявляющих стойкость к жесткокрылым насекомым.

Согласно следующему аспекту изобретения предусматривается химерный растительный ген, включающий в последовательном расположении; (а) стимулятор, который функционирует в растительных клетках таким образом, что вызывает продуцирование РНК; (b) последовательность ДНК, которая вызывает продуцирование последовательности РНК, кодирующей токсиновый белок Bacillus thuringiensis колеоптеранового типа; и (с) 3' нетранслированную область, которая функционирует в растительных клетках таким образом, что вызывает присоединение полиаденилатнуклеотидов к 3' концу последовательности РНК.

Согласно следующему аспекту изобретения предусматриваются также бактериальные клетки, трансформированные растительные клетки и векторы трансформации растений, которые содержат соответственно ДНК, включающую указанные элементы (а), (b) и (с).

Согласно следующему аспекту данного изобретения предусматривается видоизмененное растение, которое включает трансформированные растительные клетки, как описано выше, которое проявляет токсичность по отношению к жесткокрылым насекомым. Кроме того, изобретение охватывает семена, которые продуцируют описанные трансформированные растения.

На фиг. 1 показаны ДНК пробы, используемые для выделения токсинового гена В. t. t.; на фиг. 2 - этапы, используемые для получения плазмиды pMON 5432; на фг. 3 - ориентация фрагмента 3,0 кб Hind III, кодирующего токсиновый ген в рМОN 5420 и рМON 5421, относительно мгновенной связующей молекулы PUC119; на фиг. 4 - операция, осуществляемая для построения последовательности токсинового гена В.t.t., содержащегося в рМОN 5420 и рМON 5421; на фиг. 5-14 - последовательность ДНК и расположение ограничительных точек для ORF 1932 bp. гена B.t.t., кодирующего 644 аминокислотный токсиновый белок; на фиг. 15 - показаны полосы, наблюдаемые для токсина В.t.t. путем анализа SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле); на фиг. 16 - N-концевая группа белков, выраженных от токсинового гена В.t.t. или протеолитически продуцированных в условиях ин виво в В.t.t.; на фиг. 17-18 - видоизмененные гены В.t.t., используемые для анализа критичности 2-терминальной части токсина; на фиг. 19-20 - видоизмененные гены В.t.t., используемые для анализа критичности N-терминальной части токсина; на фиг. 21 - делеции, продуцированные при оценке мутантов токсиновых белков В.t.t.; на фиг. 22 - этапы, осуществляемые для получения плазмид рМОN 9758, рМОN 9754 и рМОN 9753; на фиг. 23 - этапы, осуществляемые для получения плазмиды рМОN 9791; на фиг. 24 - этапы, осуществляемые для получения плазмиды рМОN 9792; на фиг. 25 - плазмидная карта для кассетного вектора трансформации растения pМON 893; на фиг. 26 - этапы, осуществляемые для получения плазмиды рМОN 9741; на фиг. 27 - этапы, осуществляемые для получения плазмиды рМОN 5436; на фиг. 28 - элементы, включающие Т-ДНК область неусиленного Agrobacterium ACO; на фиг. 29 - последовательность ДНК для усиленного промотора СаМV 35S.

Изобретение охватывает способ трансформации растений с целью проявления токсичности по отношению к чувствительным жесткокрылым насекомым. В частности, изобретение охватывает трансгенные растения, которые выражают токсиновый белок колеоптеранового типа (для жесткокрылых) Вacillus thuringiensis в инсектицидной концентрации.

Согласно одному из аспектов, изобретение охватывает химерные гены, которые функционируют в растениях и продуцируют трансгенные растения, которые проявляют токсичность по отношению к чувствительным жесткокрылым насекомым. Выражение растительного гена, который существует в форме двухниточной ДНК, включает транскрипцию одной нити ДНК посредством РНК полимеразы, в результате чего продуцируется информационная РНК (мРНК), и обработку первичной транскрипты (мРНК) внутри ядра клетки. Эта обработка включает 3' нетранслированную область, которая соединяет полиаденилатнуклеотиды с 3' концом информационной РНК.

Транскрипция ДНК приводящая к продуцированию информационной РНК (мРНК), регулируются областью ДНК, которая обычно рассматривается как промотор. Эта промоторная область включает последовательность нуклеотидов, которая дает сигнал РНК полимеразе к ассоциации с ДНК, и инициирует продуцирование транскрипты мРНК с использованием нити молекулы ДНК, расположенной ниже от промотора, как модель для получения соответствующей нити РНК.

В литературе уже описаны различные промоторы, которые активны в растительных клетках. Эти промоторы включают нопалинсинтазу (NOS), октопинсинтазу (OCS) и маннопинсинтазу (МАS), которые несут индуцирующие опухоль плазмиды Agrobacterium tumefaciens, промоторы вирусамозаики цветной капусты (СаМV) 19S и 35S, и индуцируемый светом промотор от небольших субмолекулярных структур риболозо-бисфосфаткарбоксилазы (ss RUBISCO, очень обильный растительный полипептид). Эти типы промоторов были использованы для различных типов построений ДНК, которые были выражены в растениях; смотри, например, РСТ публикацию WO 84/02913 (Rogers и др., Монсанто).

Согласно изобретению могут использоваться промоторы, которые уже известны или которые, как обнаружено, вызывают продуцирование транскрипты мРНК в растительных клетках. Пригодные для данной цели промоторы могут включать как промоторы, которые получены от гена, который естественно выражен в растениях, так и синтетические последовательности промотора, которые могут включать избыточные или гетерологические усиливающие последовательности. Выбранный промотор должен быть способен вызывать выражение, достаточное для продуцирования эффективного количества токсинового белка для того чтобы придать растению токсичность к жесткокрылым насекомым. Для специалистов в данной области должно быть ясно, что количество токсинового белка, необходимого для индуцирования желаемой токсичности, может изменяться в зависимости от типа жесткокрылого насекомого, от которого должно быть защищено растение. Хотя промоторы СаMV 35S, ss RUBISCO и МАS являются предпочтительными, следует иметь в виду, что эти промоторы могут и не быть оптимальными для всех случаев, охватываемых изобретением.

мРНК, продуцируемая химерным геном, также содержит 5' нетранслированную основную последовательность. Эта последовательность может быть получена от специфического отобранного промотора, такого как промотор СаМV 35S, ss RUBISCO или МАS. 5' Нетранслированная область также может быть получена от другой подходящей последовательности эйкариотических генов или синтетических генов. Для специалистов в данной области должно быть известно, что требуемая функциональность 5' нетранслированной основной последовательности заключается в усилении связывания транскрипты мРНК с рибосомами растительной клетки для усиления трансляции мРНК при продуцировании кодированного белка.

Химерный ген также содержит структурную кодирующую последовательность, которая кодирует токсиновый белок Bacillus thuringiensis колеоптеранового типа или его инсектицидно активный фрагмент. Примерами источников таких структурных кодирующих последовательностей являются B.t. tenebronis и В.t. san diego. Согласно этому, изобретение охватывает структурную кодирующую последовательность от Bacillus thuringiensis вида tenebrionis и его инсектицидно активные фрагменты. Для специалистов в данной области должно быть известно, что может использоваться и другая структурная кодирующая последовательность, гомологичная токсину, кодирующему последовательность В.t.t., согласно описанию изобретения, что также охватывается объемом изобретения.

3' Нетранслированная область содержит сигнал полиаденилирования, который функционирует в растении, вызывая присоединение полиаденилатнуклеотидов к 3' концу молекулы РНК. Примерами таких 3' областей являются: (I) 3' транскрибированные нетранслированные области, содержащие полиаденилатный сигнал индуцирующих опухоль (Ti) плазмидных генов Agrobacterium, например нопалинсинтазный ген (NOS), и (2) растительные гены, типа накапливаемого белкового гена сои и ss RUBSICO. Примерами предпочтительных 3' областей являются области от генов NOS, ss RUBSICO и накапливаемых белковых генов, описанных более подробно в примерах.

Токсиновые белковые гены колеоптеранового типа, отвечающие изобретению, вставляются в геном растения любым подходящим способом. Пригодные для этой цели векторы трансформации растений включают векторы от Ti плазмиды Agrobacterium tumefaciens описанные, например, в публикации Европейского патента ЕРО 131 620 (Rogers и др.), Herrera-Esteella 1983 г., Bevan 1983 г. Кlee 1985 г., и публикация патента ЕРО 120 516 (Schilperoort и др.). Наряду с векторами трансформации растений, полученными от Ti или индуцирующих укоренение (Ri) плазмид Agrobacterium, могут использоваться альтернативные способы для вставки токсиновых белков генов колеоптеранового типа, отвечающих изобретению, в растительные клетки. Такие способы могут включать, например, липосомы, электропорацию, химические реагенты, которые увеличивают поглощение ДНК, и использование вирусов или пыльцы в качестве векторов. При желании в хромосомы растения может быть вставлен более чем один ген такими способами, как повторение трансформации, и более чем однократный цикл отбора.

Модифицированный таким путем растительный материал может быть проанализирован путем точечного покрытия Northern на присутствиe мРНК токсинового белка колеоптеранового типа. Если мРНК токсинового белка (или в слишком малом количестве для титра) обнаруживается, то промотор, используемый в построении химерного гена, заменяется другим, потенциально более сильным промотором, и повторно анализиpуется другое видоизмененное построение. Как вариант, концентрация токсинового белка может быть определена методом иммунопробы, таким как точечный метод Вестерна (Western). Во многих случаях наиболее чувствительным анализом токсинового белка является анализ методом биологической пробы на насекомых.

Контроль может осуществляться во всем объеме регенерированного растения. В любом случае, когда достигается требуемое продуцирование мРНК токсинового белка, и трансформированные клетки (или протопласты) регенерируются в весь объем растений, последние отбираются на стойкость к воздействию жесткокрылых насекомых. Выбор методики осуществления этапа регенерации не является критически важным, причем уже имеются протоколы осуществления операций для хозяев от Leguminosae (люцерна, соя, культурная, клевер, и т.д.), Umbelliferae (морковь, сельдерей, пастернак посевной), Cruciferae (капуста, редька, семя рапса, и т. д. ), Cucurbitaceae (дыня и огурцы), Gramineae (пшеница, рис, кукуруза и т.д.), Solanaceae (картофель, табак, томаты, перец), Malvaceae (хлопок, и т.д.), Chenopоdiaceae (сахарная свекла, и т.д.) и различные цветковые культуры. Смотри, например, публикацию Ammirato и др. , 1984 г. Все белковые структуры, приведенные в изобретении, представлены в общепринятом порядке; аминогруппа у N-терминального звена, находится слева, и карбоксильная группа у С-терминального звена находится справа. Аналогично, аминокислотная номенклатура для естественно присутствующих в белке аминокислот следующая: аланин (ala; A), аспаргин (Asn; А); аспаргиновая кислота (Asp; D), аргинин (Arg; R), цистеин (Сys; С); глутаминовая кислота (Glu; E), глутамин (Gln; Q); глицин (Gly; G), гистидин (His; H), изолейцин (Ile; I), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Меt; M), фенилаланин (Рhe; F), пролин (Pro; P), серин (Ser; S), треонин (Thr; T); триптофан (Тrp; W), тирозин (Tyr; V) и валин (Val; V).

Выделение токсинового гена В.t.t.

Ген В.t.t. кодирующий токсиновый белок колеоптеранового типа был выделен следующим образом.

Выделение белковых кристаллов В. t. tenebrionis был выращен в сoевом питательном бульоне Триптиказы (TSB) с целью выделения белковых кристаллов. При попытке выделения неповрежденных кристаллов из В.t.t.. было отмечено значительное различие между этими кристаллами и кристаллами лепидоптеранового типа. Хотя кристаллы лепидоптеранового типa обычно выделяются на градиентах, образуемых из Ренографина, Хипак (Hypague) или NaBr, установлено, что кристаллы B.t.t. растворяются в этих градиентах среды. Установлено, что кристаллы В.t.t. стойки в градиентах сахарозы, и градиенты сахарозы использовались для выделения кристаллов В.t.t.; Выделение токсина В.t.t. из кристаллов Очищенные кристаллы анализировались на их белковый состав методом SDS электрофореза на полиакриламидном геле. Результаты этих экспериментов показывают, что кристаллы B.t.t. содержат, по меньшей мере, два белковых компонента с мол.м. соответственно примерно 68-70 кДа и примерно 60 кДа. Относительные количества компонентов были различными при различных приготовлениях препаратов. Кроме того, можно утверждать, что более высокомолекулярный компонент может состоять более чем из одного белка. Бернардом (1986 г) были описаны белки с мол.м. примерно 68 кДа и 50 кDa как компоненты кристаллов B. t.t. Herrnstadt и др., 1986 г., сообщал о том, что кристаллы B.t. sah diego состоят из белка мол.м. примерно 64 кDa. В противоположность этому, штаммы В. t. t. типа лепидоптерана, такие как В.t. kurstaki обычно содержат более высокомолекулярный белок с мол.м. от 130 до 140 кDa. Этот результат показывает значительное различие в структуре между лепидоптерановыми и колеоптерановыми токсиновыми белками.

Были сделаны некоторые попытки очистки отдельных белковых компонентов кристаллов. Изоэлектрическое фокусирование не было успешным для данной цели, поскольку все белки осаждались. Анионообменная жидкостная хроматография высокого давления (НPLC) на колонке Моно Q не позволила разделить компоненты. Катионообменная хроматография на колонке Моно S в присутствии мочевины 4М позволила выделить пять пиков. Анализ этих пиков методом SDS гель электрофореза показал, что пик А соответствует лишь полосе более высокомолекулярного компонента от всего кристалла. Пик В богат данной полосой, соответствующей более высокомолекулярному компоненту, и включает незначительное число полос, соответствующих более низкомолекулярному компоненту. Пик С богат полосой, соответствующей более низкомолекулярному компоненту, и включает незначительное число полос, соответствующих более высокомолекулярному компоненту. Пики D и Е представляют собой смеси обеих полос. В большинстве препаратов полоса, соответствующая более высокомолекулярному компоненту, отвечающая пикам А и В, представляла собой полосу преобладающего белка в кристаллах. Для материала, разделенного методом НPLC пики А и В представляли собой наибольшую часть выделенного белка.

Были определены N-терминальные аминокислотные последовательности, соответствующие пикам А, В и С. Пики А и В, как установлено, имели одинаковую N-терминальую последовательность, в то время как последовательность С пика была другой. Определяемые последовательности были следующими: Пик А и В Мt Asn Pro Asn A Arg Ser Glu His Asp Thr Ile Lys Thr T Пик С Mt X Pro X Tr Arg Ala Leu A Asp Thr Ile Lys A V Ile Glyn Lys, где Х является неопределяемой аминокислотой.

Токсичность белков B.t.t. к насекомым Некоторые препараты В. t.t. и белков B.t.t. испытывали на токсичность действия по отношению к различным насекомым, включая чешуекрылых и жесткокрылых. Никакой активности действия не было обнаружено по отношению к чешуекрылым насекомым (совка хлопковая, совка ипсилон, бабочка-бражник и совка капустная). Из числа жесткокрылых наблюдалось активное действие против колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) и долгоносика хлопкового (Anthonomus grandis). Более низкая активность действия наблюдалась в отношении блошки П-точечной Говарда (Diabrotica undecimpunctata howardi). Было обнаружено инсектицидное действие у сырых бактериальных культур, очищенных кристаллов, солюбилизированных кристаллов и выделенных пиков С. D. Е (соединенных), А и В.

Анализ на токсичность действия по отношению к колорадскому жуку осуществлялся на томатных листьях так, что вредные насекомые могли находиться на обработанных листьях в течение четырех дней. Анализ на токсичность действия против долгоносика хлопкового и блошки П-точечной Говарда осуществлялся путем ввода испытываемого материала в соответствующую питательную смесь.

Идентификация и клонирование токсинового гена B.t.t. в Е. соli и Pseudomonas Используя информацию от N-терминальной белковой последовательности, были приготовлены пробы синтетической ДНК (фиг. 1), которые использовались при выделении клонов, содержащих токсиновый ген В.t.t. Эти пробы по концам метились [-³² p] АТР согласно Maniatis (1982 г.) В. thuringiensis разновидности tenebrionis выращивался в течение 6 ч при 37^оС в среде Spizizen (Spizizen, 1958), дополненной 0,1% дрожжевым экстрактом и 0,1% глюкозой (SPY) для выделения всей ДНК. Вся ДНК была выделена из В.t.t. способом Kronstad (1983 г.) Клетки выращивались на агаровых пластинах Luria для выделения кристаллов В.t.t., используемых в исследовании на токсичность. Культуры Е. coli и Pseudomonas выращивались обычным образом в питательном бульоне Luria Broth (LB) с ампициллином (Ар, 200 мкг/мл), канамицином (Кm, 50 мкг/мл), или гетамицином (Gm, 15 мкг/мл), вводимых для отбора и сохранения плазмиды.

Выделение и обработка ДНК Плазмида ДНК была экстрагирована из Е.coli и Pseudomonas клеток способом Birnboim и Doly (1979 г.), и большие количества этой плазмиды были очищены с использованием смолы NACS-52 (Научно-исследовательская лаборатория Bethesda) cогласно инструкциям изготовителя. Согласно инструкциям изготовителя использовались ограничительные эндонуклеазы, щелочная фосфатаза теленка и лигаза Т4 ДНК (Биолаборатория New England). Ограничительные продукты вываривания анализировались на 0,8% агарозном геле, подвергнутом электрофорезу в трис-ацетатном буферном растворе. Фрагменты ДНК для клонирования очищались от агарозы с использованием метода замораживания - оттаивания. Построение молекул рекомбинантной ДНК осуществлялось согласно Maniatis и др. , 1982 г. Трансформация в E.coli осуществлялась согласно Maniatis (1982 г.).

Клонирование токсинового гена B.t.t.

Осуществлялся анализ Southern (Southern, 1975), модифицированным методом с использованием высушенного геля (Conner и др., 1983 г.). Для обнаружения токсиновых клонов B.t.t. осуществлялась фильтр гибридизация колонии с использованием метода тетраметиламмонийхлорида (Wood и др., 1985 г.).

Анализ методом Southern общей ДНК B.t.t.. вываренной с BamHI и Hind III, позволил идентифицировать фрагмент 5,8 кb BamHI и 3,0 кв Hind III, который гибридизировался с синтезированной АI пробой. BamHI фрагменты ДНК B. t. t. (5,4-6,5 кb) были очищены от агарозных гелей и сшиты с обработанной щелочной фосфатазой рU C119, вываренной с BamHI. PU C119 приготавливалась путем выделения фрагмента 476 bp HgiAI/DraI бактериофага М13 и затупления концов данного фрагмента полимеразой Т4 ДНК (Биолаборатории New England). Затем этот фрагмент вставлялся в pU C19, который был выварен c Nde I и был наполнен ДНК полимеразой Кленова (Биолаборатории New England). Сшитая В.t. t. и рUC119 ДНК затем использовалась для трансформации клеток Е. coli IM101. После нескольких попыток были получены лишь стойкие колонии 150 Ар. Фрагменты Hind III B.t.t. ДНК (2,8-3,5 кb) также были клонированы в точку Hind III плазмиды рUC119, и было получено 1100 колоний. Все колонии просеивались путем гибридизации колонии с пробой AI (фиг. I). Одиннадцать клонов Hind III показали сильную гибридизацию, но ни одна из колоний Bam HI не показала какой-либо гибридизации. Затем колонии, идентифицированные гибридизацией с АI, были отсеяны с использованием синтезированной пробы А2 (фиг. 1), и две колонии показали гибридизацию со второй пробой. Ограничительные вываренные структуры двух колоний показали, что один и тот же фрагмент 3,0 кb Hind III находится в обоих колониях, но имеет противоположные ориентации. Эти клоны были обозначены рMON 5420 и рМОN 5421 (фиг. 3). Для подтверждения того, что эти клоны не содержат ген для токсинового белка B.t.t. была построена последовательность однониточной ДНК из обоих клонов с использованием вырожденных проб А1 и А2 в качестве затравок для ди-деоксипоследовательности (Sanger, 1977 г.). Анализ последовательности пробой А1 в качестве затравки обнаруживает открытый для отсчета скелет (ORF), последовательность которого идентична аминокислотам с 9 по 15 аминокислотной последовательности, определяемой для очищенных пиков А и В токсинового белка В.t.t.

Проба А2 продуцировала последовательность ДНК, которая начиналась за пределами конца заданной аминокислотной последовательности, но эта последовательность ДНК была идентична последовательности, продуцируемой АI. Эти результаты подтверждают, что был клонирован желаемый токсиновый ген B.t.t.

Гибридизация Southern с общей ДНК В.t.t. с использованием вырожденных проб на основе N-терминала пика С не позволила обнаружить специфические полосы, подтверждающие, что данная аминокислотная последовательность, определяемая для пика С, была неправильной или наиболее вероятно была получена из смеси двух или более белков, заключающих в себе пик С.

Анализ белков, продуцируемых в Е.coli.

Осуществлялось исследование кристаллических белков B.t.t. и рекомбинантных белков B. t. t. методом SDS электрофореза на полиакриламидном геле (Laemmli, 1970 г. ). Один миллилитр (Е.coli) центрифугировали, гранулы повторно суспензировали в 100 мкг буферного раствора пробы SDS и 10 мкл пробы подвергались электрофорезу на 7,5%-ных полиакриламидных гелях. Эти гели либо окрашивались красителем Комассьи синим, либо анализировались на перекрестную активность к антителам, вызываемым против очищенных токсиновых кристаллов В. t.t. Осуществлялся точечный анализ Вестерна с использованием антитела, образующего сопряженную связь с пероксидазой хрена обыкновенного (Towbin и др., 1984 г.). Высокомолекулярные сигнальные гены были получены из Bio Rad.

Следующим подтверждением было то, что продуцированный клонами токоин В. t.t. был получен путем точечного анализа Вестерна белков, продуцированных в Е. coli. Клетки E.Coli IMIOI, содержащие либо pUC119, либо pMON 5420, либо рMON 5421, были выращены в течение ночи в присутствии IPTG (0,1 ммоль), индуцируя промотор lac. Осуществлялся анализ двойных проб методом электрофореза на полиакриламидном геле с использованием в качестве контрольных образцов очищенных кристаллических белков B.t.t. Точечный анализ Вестерна одного геля обнаружил продуцирование двух перекрестно активных белков посредством Е. coli содержащим рМОN 5420 или рМОN 5421. Эти белки были идентичными по размеру основному и второстепенному белкам кристалла B.t.t. Молекулярная масса этих белков определяли путем сравнения со стандартными молекулярными весами на втором геле, окрашенном красителем Комассьи синим. Определено, что основной токсиновый белок имеет мол.м. 74 кDa и второстепенный токсиновый белок имеет мол.м. 68 кDa. Количество токсиновых белков B. t.t. продуцируемых посредством рМОN 5420, увеличивалось путем ввода IPТG, в то время как продуцирование токсиновых белков посредством рМОN 5421 оставалось неизменным.

Продуцирование токсина (токсинов) B.t.t. в Pseudomonas fluorescens.

Вектор хозяина широкого диапазона, рМОN 5432, был построен путем клонирования pMON 5420, вываренной с Bam HI, в точку Bam HI pMON 5420, как показано на фиг. 2. Этот вектор был затем спарен в Р. fluorescens 701E1 с целью анализа продуцирования токсина. Осуществлялись трехродительские спаривания в Pseudomonas fluorescens как описывалось ранее (Ditta и др., 1980 г.). Приготавливались пробы ночных культур, выращенных с IPTG и без IPTG, с целью проведения точечного анализа Вестерна и исследования токсичности к насекомым. Белки, продуцируемые Pseudomonas, идентичны по своему размеру продуцируемым E.coli белкам, и выражение белка увеличилось с вводом IPTG.

Анализ на токсичность к насекомым.

Осуществляли анализ на токсичность действия токсина на жесткокрылых насекомых, используя свежевыведенных колорадских жуков (Leptinotarsa decemlineata) на томатных листьях. Культуры E.coli и Pseudomonas были выращены в течение ночи в присутствии IPTG, затем они подвергались центрифугированию и повторному суспензированию при различных концентрациях в 10 ммоль MgSO₄. Клетки разрушались под действием прозвучивания (три 15-секундные пульсирующие обработки на льду). Вводили Твин-20 (0,1%), и пробу наносили на томатный лист, помещенный в чашку Петри (9 см) с влажной фильтровальной бумагой. На каждый лист помещали десять личинок колорадского жука. По прошествии четырех дней рассчитывали процент смертности (процент выживших насекомых и контрольных пробах минус процент выживших насекомых в обработанных пробах поделенный на процент выживших насекомых в контрольных пробах), используя формулу Аббота (Abbott, 1925 г.). Анализы осуществлялись по два раза и данные суммировались. В качестве позитивной контрольной пробы использовался препарат B.t.t. кристалл/cпора.

Культуры Е.соli клонов pMON 5420 и рМОN 5421 анализировались на токсичность к жесткокрылым с использованием различных концентраций культур, выращенных с добавлением IPТG. Сравнение активностей рекомбинантного и дикого типа токсина B.t.t. показано в табл. 1. Данные результаты показывают, что рекомбинантные белки B. t. t. токсичны по отношению к колорадскому жуку. Двукратно концентрированная индуцированная IPTG культура pMON 5420 умерщвляла 100% насекомых, как и контрольная культура В.t.t. спора/кристалл. Эти токсичности показывают, что такой клонированный В.t.t. ген является геном, который кодирует токсиновый белок B.t.t.

Анализ с подачей насекомых показал, что продуцированные Pseudomonas токсичны по отношению к колорадскому жуку. Относительная токсичность культур Pseudomonas зависит от количества продуцируемого токсинового белка, которое определяется точечным анализом Вестерна, по сравнению с культурами E.coli.

Последовательность токсинового гена B.t.t.

Расположение и ориентацию гена B.t.t. в клонированном фрагменте определяли основываясь на следующей информации: а) Последовательность ДНК была получена от однониточной модели pMON 5421.

b) Точка Pst I, идентифицированная путем анализа последовательности ДНК, около начала трансляции, размещалась на карте в рМОN 5420 и pMON 5421.

с) Были нанесены на карту некоторые другие ограничительные точки.

d) была построена делеция от точки Bgl II до точки Bam HI, которая отбирает 130 основных пар (bp), и были продуцированы оба белка полной длины цепи. Эта информация использовалась для построения карт рМОN 5420 и pMON 5421. Как показано на фиг. 4 кодирующая область токсина начинается с 500 bp от точки 5' Hind III, и 150 bp вверх от точки Pst I. Эта кодирующая зона завершается примерно 450 bp от точки 3' Hind III. Точка Bgl II составляет примерно 350 bp ниже от стоп-кодона.

Плазмиды.

В табл. 2 приведены плазмиды, образуемые для построения последовательности инсектицидного токсинового гена B.t.t. Родительские плазмиды, pMON 5420 и рМОN 5421 являются независимыми изолятами от фрагмента Hind III, клонированного в pU С119 в противоположной ориентации.

Приготовление однониточной модели для построения последовательности.

Осуществление операции как указано обеспечивает воспроизводимо высокие выходы однониточной модели для построения последовательности. Однониточная колония, содержащая pU C119 с данным фрагментом, последовательность которого должна быть построена, подвергалась штриховой разводке на L-агаре (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl и 15 г агара на литр), содержащем ампициллин (200 мкг на мл). Одиночная колония от этой модели инокулировалась в 3 мл L-питательного бульона (200 мкг на мл ампициллина) и инкубировалась при температуре 37^оС в течение ночи с взбалтыванием. От этой культуры 50 мкл инокулировалось в 10 мл 2 х УТ (20 г триптона и 10 г дрожжевого экстракта на литр) с 200 мкг ампициллина на мл в 150-миллилитровой колбе с боковой рукояткой и инкубировалось при температуре 37^оС с взбалтыванием. После 2-3 ч (показатель Клетта 50) вводили 100 мкл М13К07 (вспомогательный фаг), выращенный в Е.соli IМ101 для индуцирования культуры. Колбу встряхивали в течение 1 ч, после чего вводили 20 мл 2 Х УТ, доводя конечную концентрацию канамицина до 70 мкг на мл ампициллина до 200 мкг на мл. Культуры взбалтывались в течение 16-18 ч при температуре 37^оС. Как было определено, в общей сложности 3 м л индуцируемой в течение ночи культуры было достаточно для извлечения требуемого количества модели для четырех экспериментов построения последовательности. Эти 3 мл вытягивались в 1,5 мл трубках эппендорфа в течение 1 мин, декантировались и фильтровались через 0,2 мкм Gelman Sciences Acrodisc. Данный этап обеспечивал удаление клеточных остатков и неповрежденных Е.сoli. После осаждения в полиэтиленгликоле (20% полиэтиленгликоля, 2,5 мол. NaCl, 500 мкл на 2 мл лизата) при комнатной температуре в течение 10 мин осуществлялось центрифугирование в течение 10 мин. Поверхностный слой удаляли, после чего осуществлялось быстрое вытягивание (15 с) и удаление остаточного полиэтиленгликоля. Любой оставшийся полиэтиленгликоль проходил через выделенную модель и оказывал нежелательное влияние на реакции построения последовательности ДНК. Полученные гранулы суспензировались в 100 мкл ТЕ (10 ммоль трис- 1 ммоль этилендиамин тетрауксусной кислоты, рН 8,0) соединялись и тщательно перемешивались с 200 мкл буферного раствора фенола (буферный раствор приготавливался путем получения равновесной смеси с равным объемом 1 моль) трис-HCl, рН 8,0 затем 0,1 моль трис-HCl. рН 8,0, и затем с равным объемом ТЕ). После инкубации при температуре 55^оС в течение 10 мин добавляли равный объем (200 мкл) смеси фенол-хлороформ (1:1), подвергали вихревому перемешиванию и центрифугировали в течение 2 мин. Верхний слой удаляли, экстрагировали 200 мкл хлороформа, центрифугировали, и водную фазу удаляли. Однониточная молекулярная модель осаждалась посредством 25 мкл 3 моль ацетата натрия (рН 5,2) и 600 мкл 95%-ного этанола, инкубировалась на сухом льду в течение 5 мин и центрифугировалась в течение 10 мин. Осадок снова суспензировали в 25 мкл Н₂О и 2 мкл пробы анализировали на агарозном геле на точный размер, относительную концентрацию и загрязнение ДНК.

Образующие последовательность реагенты и условия Процедуры построения последовательности ДНК описаны подробно в справочном пособии фирмы Amercham Corpiration. Реагенты (нуклеотиды, затравка, буферный раствор, вытягивающий раствор и полимераза Кленова) получены из системы Amercham М13 (каталог 4502). Используемые для построения последовательности смеси в системе Amersham подготавливались для эффективного получения последовательности обогащенного А - Т гена В.t.t. Вместо рекомендуемой смеси dNTH c dd NTP в соотношении 1:1, наиболее подходящими были следующие соотношения компонентов: 40 мкл dATP: 10 мкл ddATP, 35 мкл dТТР; 15 мкл ddТТР, 15 мкл dGTP: 35 мкл ddGTP, и 10 мкл dCTP: 40 мкл ddСТР. В реакциях построения последовательности использовалась радиоактивная сера [(-³⁵S] dATP) (Каталог Amercham # 1304). Образующие последовательность гели (приготовленные как описано в справочном пособии Amersham) обрабатывались в аппаратуре Hoeffer "Роker Face" мощностью 70 Вт (1200-1400 В), что обеспечивало очень высокое разрешение. Более высокое напряжение приводило к нечетким полосам.

Последовательность токсинового гена В.t.t.

Выделенные плазмиды, pMON 5420 и рМON 5421, содержали фрагмент 3,0 Hind III противоположной ориентации (см. фиг. 3). Основной белок кристалла B.t. t. , который использовался как основа для олигонуклеотидных проб, имел мол. м. примерно 73-76 кДа, соответствующий примерно 2 кb ДНК. Начальная последовательность от А1 и А2 затравок (синтезированные олигонуклеотиды, основанные на аминокислотной последовательности пика А; (см. табл. 3) подтверждает, что данная последовательность ДНК соответствует предполагаемой аминокислотной последовательности.

Точка Pst I располагалась в начальной последовательности, которая использовалась для идентификации положения и вероятностной ориентации генa B.t. t. в рМON 5420 и рМОN 5421 (см. фиг. 3 и 4). Построение карты ограничительных точек с числом ферментов (НраI, Xba I, Nde I, Eco RV и Bgl II) и многочисленными одиночными очистками, оставшимися в части рU C119 как плазмиды рМОN 5420, так и плазмиды pMON 5421, дает возможность получить последовательность с использованием универсальной образующей последовательность затравки. Были образованы делеции как в рМОN 5420, так и в рМОN 5421, несущие гомологичную область универсальной затравки в непосредственном соседстве с внутренними зонам гена. На участках, где нелегко образуются последовательность за счет генерируемых делеций, в качестве з