Способ получения биологически активных веществ из ламинарии

Способ получения биологически активных веществ из ламинарии

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения биологически активных веществ из ламинарии. Цель изобретения - интенсификации переработки сырья для одновременного получения нескольких биологических активных веществ и повышение выхода водорастворимого полисахаридного комплекса. Сущность: последовательное экстрагирование измельченных слоевищ Zaminaria saccharina u z. digitata с целью получения по единой технологии продукта: маннита, водорастворимого полисахарида комплекса, ламинарана, фукоидана и альгината натрия. Положительный эффект заключается в одновременном получении нескольких продуктов, обладающих сильно выраженным слабительным действием, а также альгината натрия, обладающего радионуклидсвязывающим действием, а также в повышении выхода водорастворимого полисахаридного комплекса до 12,6%. 36 табл.

Изобретение относится к методам одновременного получения маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия из беломорских водорослей рода Laminaria и может быть использовано в медицине, фармации, микробиологии, в производствах, связанных с радиоактивными металлами.

Известен способ получения полисахаридов из морской капусты Laminaria saccharina L. ) путем измельчения, промывки слоевищ морской капусты, экстракции горячей водой при 80^oC методом настаивания или противоточной перколяции, отделения экстракта от сырья, упаривания экстракта до соотношения 1: 0,8-1: 1,2, прибавления к горячему экстракту 96%-ного этилового спирта в соотношении экстракт: этанол 1: 1. Затем образовавшуюся смесь отстаивают, отделяют нижний слой взвеси, центрифугируют и после отделения маточного раствора осадок промывают 96% этиловым спиртом. Промытый осадок сушат, измельчают. Выход готового продукта составляет 5,6% к загруженному сырью. Полученный комплекс полисахаридов оказывает слабительное действие и известен как лекарственный препарат "Ламинарид". Данный способ получения близок к заявляемому и выбран за прототип.

Недостатками указанного способа являются: а) получение только одного продукта из водорослей (полисахаридов), при этом отходами производства являются ценные биологически активные вещества - маннит, ламинаран, фукоидан, альгинат натрия; б) низкий выход полисахаридов (5,6% к сырью); в) неполное осаждение полисахаридов этанолом за счет недостаточного количества этанола; г) потеря этанола при добавлении его к горячему концентрированному экстракту для осаждения полисахаридов.

Целью изобретения является комплексная переработка беломорских водорослей с целью одновременного получения маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия, повышение выхода водорастворимого полисахаридного комплекса, расширение сырьевой базы, повышение биологической активности целевого продукта, расширение спектра биологического действия.

Цель достигается тем, что способ одновременного получения маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия, обладающих слабительным, гиполипидемическим, радионуклидсвязывающим, гепатозащитным, противоязвенным действием, из беломорской ламинарии (естественной смеси двух видов ламинарии - Laminaria saccharina L. и Laminaria digitata L.) осуществляют путем измельчения сырья, последовательного экстрагирования 90-96%-ным этанолом, горячей водой и 1,5% раствором карбоната натрия; этанольное извлечение концентрируют и кристаллизуют из него маннит; из водного экстракта 96%-ным этанолом осаждают водорастворимый полисахаридный комплекс; при этом оставшийся спиртовый маточный раствор упаривают и 80% этанолом осаждают ламинаран и фукоидан, для разделения последних полученный осадок обрабатывают 0,4%-ным раствором соляной кислоты и добавляют 0,5 М раствор цетавлона для переведения кислых полисахаридов в осадок, экстракт обрабатывают этанолом (для высаждения ламинарана), а оставшийся осадок вновь растворяют в 0,4% растворе соляной кислоты и обрабатывают 70% этанолом (фукоидан); из карбонатного извлечения после предварительной обработки концентрированной серной кислотой, раствором двууглекислого натрия получают альгинат натрия.

Согласно заявляемому способу сначала проводят сушку сырья при 50^oC, после чего освобождают его от механических примесей. Затем сырье измельчают до размера частиц 3 мм и экстрагируют 90-96%-ным этанолом в соотношении сырье: этанол 1: 6 в аппарате Cокслета при температуре кипения экстрагента в течение 3 ч. Профильтрованный спиртовый экстракт упаривают до сгущенного остатка, кристаллизуют, выпавшие кристаллы маннита очищают перекристаллизацией. Далее, после удаления остатков спирта из водорослей, последние экстрагируют двукратно водой в соотношении 1:10 при температуре 80^oC в течение 30 мин, водные экстракты объединяют, фильтруют, упаривают под вакуумом при остаточном давлении 0,3 атм и температуре 70^oC до плотности 1,05-1,06 г/см³; водорастворимый полисахаридный комплекс осаждают 96% этанолом из охлажденного экстракта в соотношении экстракт:этанол 1:2, комплекс фильтруют, трехкратно очищают 96% этанолом, сушат. Оставшийся после осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса спиртовый маточный раствор упаривают до 1/10 первоначального объема, после чего сгущенный экстракт обрабатывают 80% этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Полученный осадок (ламинаран и фукоидан) центрифугируют. Для разделения ламинарана и фукоидана отцентрифугированный осадок обрабатывают 0,4% раствором соляной кислоты при соотношении осадок:раствор соляной кислоты 1:5 при комнатной температуре в течение 2,0 ч; затем к полученному раствору добавляют 0,5 М раствор цетавлона для переведения кислых полисахаридов в осадок. Осадок отделяют, а надосадочную жидкость обрабатывают 80% этанолом (для высаждения ламинарана) в соотношении надосадочная жидкость:этанол 1:3. Полученный ламинаран фильтруют, очищают 96% этанолом, сушат. Осадок, образованный после добавления цетавлона, растворяют в 0,4% растворе соляной кислоты в соотношении осадок:раствор соляной кислоты 1:10 и обрабатывают 70% этанолом в соотношении раствор: этанол 1:3, выпадает осадок фукоидана, который фильтруют, очищают, сушат. После этого оставшийся жом водорослей экстрагируют 1,5% раствором карбоната натрия в соотношении 1:20 при температуре 50^oC в течение 1 ч; водно-щелочной экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают концентрированной серной кислотой, выпавший при этом осадок отделяют, обрабатывают 1,5%-ным раствором карбоната натрия и получают альгинат натрия осаждением 96% этанолом в соотношении раствор:этанол 1:5. Альгинат натрия фильтруют, сушат.

Преимущества заявляемого способа заключаются в комплексной переработке ламинарии: одновременном получении из беломорской ламинари пяти продуктов: маннита, водорастворимого полисахаридного комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия. Все целевые продукты обладают биологическим действием. Описано слабительное действие только для полисахаридного комплекса из ламинарии. Разработанная нами технологическая схема позволяет получить целевые продукты с выраженным слабительным действием, превосходящим действие официального препарата "Ламинарид": маннит проявляет слабительное действие, превосходящее "Ламинарид" на 41,1%, водорастворимый полисахаридный комплекс - на 5,2-60,0% (в зависимости от используемых методик испытаний и видов животных), ламинаран и фукоидан - на 20,5%, альгинат натрия - на 141,1%. Кроме того, водорастворимый полисахаридный комплекс обладает выраженным радионуклидсвязывающим, гиполипидемическим, гепатозащитным и противоязвенным действием, превосходящим или повторяющим аналогичное действие официальных препаратов. Альгинат натрия также проявляет выраженное радионуклидсвязывающее и гипохолестеринемическое действие. Все виды биологического действия для всех целевых продуктов, кроме слабительного действия полисахаридного комплекса, нами установлены впервые. Сочетание слабительного и радиопротекторного действия для альгината натрия и водорастворимого полисахаридного комплекса способствует быстрому выведению этими продуктами радионуклидов из организма.

Кроме того, заявляемый способ обеспечивает получение целевых продуктов с высоким выходом (в пересчете на сухое исходное сырье): маннит - 7,85%; водорастворимый полисахаридный комплекс - 12,60%; ламинаран - 4,53%; фукоидан - 2,14%; альгинат натрия - 12,41%. Предлагаемый способ может быть использован в условиях промышленной переработки ламинарии. В данном способе используется естественная смесь двух видов сырья, произрастающих в морском бассейне Белого моря: Laminaria saccharina L. и Laminaria digitata L.

Полученные целевые продукты были подвергнуты качественному и количественному анализу (табл. 1,2,3,4,5,6,7,8,9).

I. Маннит.

Идентификацию полученного маннита проводили методом бумажной хроматографии.

Количественное содержание маннита определяли методом обратной йодометрии в присутствии индикатора крахмала. Титрование проводили до появления зеленой окраски раствора. Содержание маннита составило 99,56%.

Таким образом, коэффициент распределения (R_f), температура плавления, удельное вращение, зольность полученного маннита, соответствующие аналогичным показателям стандартного маннита, а также высокое количественное содержание маннита свидетельствуют о высокой чистоте полученного продукта.

II. Водорастворимый полисахаридный комплекс.

Идентификацию полисахаридов проводили с помощью цветных реакций, хроматографически.

Результаты анализа водорастворимого полисахаридного комплекса, приведенные в табл.3,4, аналогичны для препарата "Ламинарид", что свидетельствует о соответствии полученного полисахаридного комплекса препарату "Ламинарид".

Количественное содержание полисахаридов определяли по сумме восстанавливающих сахаров по реакции с пикриновой кислотой, спектрофотометрически. Содержание восстанавливающих сахаров составило 76,55% в водорастворимом полисахаридном комплексе. В препарате "Ламинарид" содержание восстанавливающих сахаров достигало 25,64%, т.е. содержание суммы редуцирующих сахаров в образце, полученном по заявляемому способу, в 3 раза превышает этот показатель по сравнению со способом, принятым за прототип.

Таким образом, в результате анализа водорастворимого полисахаридного комплекса идентифицированы полисахариды, установлено высокое содержание редуцирующих сахаров и показано соответствие полученного водорастворимого полисахаридного комплекса официальному препарату "Ламинарид".

III. Ламинаран.

Полученные показатели (таблица 5) согласуются с известными литературными данными.

Моносахаридный состав полученного ламинарана определяли с помощью гидролиза 2 н. серной кислотой при 100^oС в течение 6 ч с последующей нейтрализацией гидролизата карбонатом бария методом бумажной хроматографии. Результаты представлены в табл.6.

Полученный ламинаран подвергали ферментативному расщеплению с помощью 1,3- -глюканазы. При этом ламинаран расщеплялся до глюкозы. Последнюю определяли колориметрическим методом. Содержание ламинарана в полученном образце составило 81,22%.

Итак, результаты анализа подтверждают идентичность и высокое содержание ламинарана.

IV. Фукоидан.

Полученный фукоидан гидролизовали 2 н серной кислотой при 100^oC в течение 6 ч с последующей нейтрализацией гидролизата карбонатом бария. Гидролизат анализировали методом бумажной хроматографии. Результаты представлены в табл.7.

Количественное определение фукоидана проводили спектрофотометрическим методом по реакции взаимодействия фукоидана с тиогликолевой кислотой в среде серной кислоты. Содержание фукоидана составило 72,25%.

Полученные результаты подтверждают идентичность фукоидана.

V. Aльгинат натрия.

Количественное определение альгината натрия проводили методом обратного титрования раствором гидроксида натрия избытка серной кислоты, оставшейся после взаимодействия ее с альгинатом натрия. Содержание альгината натрия составило 91,15%.

Таким образом, полученные результаты анализа подтверждают подлинность и высокое количественное содержание альгината натрия.

Нами изучена зависимость выхода целевых продуктов от ряда технологических параметров (табл. 10-31).

Как видно из таблицы 10, наибольший выход маннита обеспечивается при концентрации этанола 90-96%.

Как следует из табл.11, максимальный выход маннита обеспечивается при использовании соотношения сырье:экстрагент 1:6.

Из таблицы 12 видно, что наибольший выход маннита достигается при продолжительности экстракции 3 ч.

Как следует из табл.13 наибольший выход водорастворимого полисахаридного комплекса обеспечивается при температуре экстрагента 80^oC.

Результаты, представленные в табл.14 свидетельствуют об оптимальном соотношении сырье:экстрагент 1:10, так как при этом обеспечивается наибольший выход полисахаридного комплекса.

Как следует из табл.15, оптимальной продолжительностью экстракции является 30 мин, так как при этом достигается максимальный выход водорастворимого полисахаридного комплекса.

Из табл.16 следует, что оптимальное соотношение экстракт:этанол при осаждении водорастворимого полисахаридного комплекса достигается в случае 1: 2. Это объясняется наибольшим выходом полисахаридного комплекса.

Как видно из табл.17 наибольший выход ламинарана и фукоидана обеспечивается при использовании 80%-ного этанола.

Из табл.18 видно, что наибольший выход суммы ламинарана и фукоидана достигается при использовании экстрагента в соотношении экстракт:этанол 1:3.

Наибольшая растворимость суммы ламинарана и фукоидана (1,21 г в 100 мл кислоты) обеспечивается при концентрации соляной кислоты 0,4%.

Из табл.20 следует, что наилучшая растворимость осадка достигается при обработке его 0,4% раствором соляной кислоты в соотношении осадок:раствор кислоты 1:5.

Из табл.21 следует, что наиболее полное растворение осадка ламинарана и фукоидана достигается при продолжительности обработки кислотой 2 ч.

Из табл. 22 следует, что максимальный выход ламинарана достигается при концентрации осадителя 80%.

Из табл.23 следует, что наиболее полное осаждение ламинарана обеспечивается при соотношении экстракт:этанол 1:3.

Как видно из табл. 24, наибольший выход фукоидана обеспечивается при использовании этанола в концентрации 70%.

Из табл. 25 следует, что максимальный выход фукоидана достигается при обработке солянокислого раствора этанолом в соотношении 1:3.

Из табл.26 следует, что максимальный выход альгината натрия обеспечивается при использовании экстрагента - карбоната натрия - в концентрации 1,5% .

Из табл.27 видно, что наибольший выход альгината натрия достигается при соотношении сырье:экстрагент 1:20.

Из табл. 28 следует, что оптимальной температурой экстракции альгината натрия является 50^oC, так как эта температура обеспечивает наибольший выход альгината натрия.

Из табл.29 следует, что оптимальной продолжительностью экстракции сырья является 1,0 ч, при которой выход альгината натрия максимальный (12,41%).

Из табл.30 видно, что наиболее полное осаждение альгината натрия происходит при использовании этанола в концентрации 96%.

Из табл.31 видно, что наиболее полное осаждение альгината натрия происходит при обработке щелочного раствора этанолом в соотношении 1:5.

Заявляемый способ одновременного получения маннита, водорастворимого полисахариднго комплекса, ламинарана, фукоидана, альгината натрия поясняется следующими примерами конкретного выполнения.

П р и м е р 1. Беломорские водоросли (L. saccharina L. и L. digitata L. ) высушивают при 50^oC в сушильном шкафу, затем освобождают их от механических примесей, моллюсков. Далее отвешивают 100 г водорослей с точностью 0,0002 г, измельчают на лабораторном измельчителе до размера частиц 3 мм и экстрагируют 600 мл 90%-ного этилового спирта в аппарате Сокслета при температуре кипения этанола в течение 3 ч. Полученный спиртовый экстракт фильтруют на воронке Бюхнера под вакуумом, упаривают до образования сгущенного экстракта (примерно 30 мл), добавляют около 10 мл воды, образующуюся пигментную пленку отделяют, далее раствор кристаллизуют при температуре +4^oC в холодильнике. Выпавшие кристаллы маннита двукратно очищают перекристаллизацией из спирто-водного раствора. Чистые кристаллы маннита фильтруют через бумажный фильтр и сушат при температуре 60^oC в вакуум-сушильном шкафу. Выход маннита составляет 7,85 г или 7,85% к сырью.

Целевой продукт - маннит - представляет собою кристаллы белого цвета, без запаха, хорошо растворим в воде и кипящем спирте, мало растворим в холодном спирте, нерастворим в эфире.

Далее, водоросли, оставшиеся после извлечения маннита, "сушат" под тягой для удаления остатков спирта, после чего их загружают в колбу вместимостью 2 л и заливают 1000 мл горячей (температуре 80^oC) дистиллированной воды. Нагревание смеси проводят на электроплитке при температуре 80^oC (контроль температуры осуществляли по термометру). Экстракцию проводят в течение 30 мин двукратно. Полученные горячие водные экстракты сливают с жома, объединяют, фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через двойную капроновую ткань. Объединенный профильтрованный экстракт упаривают в колбе Вюрца под вакуумом при остаточном давлении 0,3 атм и температуре 70^oC до плотности 1,05-1,06 г/см³ (примерно 1/7 от первоначального объема). Полученный водный концентрат обрабатывают двухкратным объемом 96%-ного этанола. Выпавши й осадок водорастворимого полисахаридного комплекса декантируют и фильтруют на воронке Бюхнера под вакуумом через двойную капроновую ткань. Осадок трехкратно промывают на воронке 96%-ным этанолом, сушат при температуре 60^oC в вакуум-сушильном шкафу.

Выход водорастворимого полисахаридного комплекса типа "Ламинарид" составляет 12,60 г или 12,60% к сырью.

Целевой продукт - водорастворимый полисахаридный комплекс типа "Ламинарид" представляет собой аморфный порошок серовато-желтого цвета без запаха. Практически не растворим в спирте. В воде растворяется умеренно с образованием мутного слизистого раствора.

Оставшийся после осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса типа "Ламинарид" спиртовый маточный раствор (примерно 300 мл) упаривают под вакуумом до 1/10 объема. Затем полученный концентрат обрабатывают 90 мл 80% -ного этанола. Выпавший осадок центрифугируют на лабораторной центрифуге при 2000 обор./мин. К отфугованному осадку в стакане добавляют 40 мл 0,4% раствора соляной кислоты, стакан со смесью закрывают и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. После 2 ч к образовавшемуся раствору добавляют 0,5 М раствор цетавлона. При этом кислые полисахариды переходят в осадок. Добавление 0,5 М раствора цетавлона проводят до тех пор, пока не прекратится образование осадка кислых полисахаридов, т.е. в надосадочной жидкости прибавление цетавлона не приводит к образованию осадка. Через 10 мин после отстаивания осадок отделяют фильтрованием через бумажный фильтр. Надосадочную жидкость (35 мл) обрабатывают 105 мл 80%-ного этанола. Выпадает осадок ламинарана, его фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера, промывают дважды 96%-ным этанолом, сушат в вакуум-сушильном шкафу при 60^oC. Выход ламинарана составляет 4,53 г или 4,53% к сырью.

Целевой продукт - ламинаран - представляет собою порошок светло-бежевого цвета, без запаха, растворим в воде, в кислотах, нерастворим в этаноле.

Далее, осадок кислых полисахаридов, образованный после добавления цетавлона, растворяют в 20 мл 0,4% раствора соляной кислоты путем перемешивания смеси на магнитной мешалке в течение 15 мин. Полученный раствор фукоидана обрабатывают 60 мл 70% этанола. При этом выпадает в осадок фукоидан, осадок фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера, промывают дважды 70%-ным этанолом, сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60^oC. Выход фукоидана составляет 2,14 г или 2,14% к сырью.

Целевой продукт - фукоидан - представляет собою порошок светло-розового цвета, без запаха, растворим в воде, в кислотах, нерастворим в этаноле.

Жом водорослей, оставшийся после экстракции описанных выше четырех продуктов, помещают в колбу вместимостью 3 л, заливают 2 л 1,5% раствора карбоната натрия и экстрагируют на водяной бане при температуре 50^oC в течение 1 ч. Водно-щелочной экстракт далее декантируют с жома и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера. Затем водно-щелочной экстракт обрабатывают примерно 100 мл концентрированной серной кислоты (99,95%) путем медленного добавления небольших порций кислоты (примерно по 5 мл) к экстракту. При этом выделяется осадок альгиновой кислоты, который отделяют фильтрованием на воронке Бюхнера. Этот осадок переносят количественно в колбу вместимостью 3 л, добавляют 300 мл 1,5%-ного раствора карбоната натрия, перемешивают, осадок альгиновой кислоты переходит в раствор альгината натрия. Альгинат натрия высаждают из раствора путем добавления к нему 1,5 л 96% этанола. Образующийся осадок фильтруют на воронке Бюхнера, сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60^oC. Выход альгината натрия составляет 12,41 г или 12,41% к сырью.

Целевой продукт - альгинат натрия - представляет собою тонкие пластинки светло-оранжевого цвета, без запаха, слизистого вкуса, растворимый в воде, нерастворимый в спирте.

Маточные спиртовые растворы подвергаются обработке с целью регенерации из них спирта.

П р и м е р 2. Беломорские водоросли сушат при 50^oC, освобождают от механических примесей, отвешивают 100 г для анализа. Навеску водорослей измельчают до частиц 3 мм и экстрагируют 700 мл 96%-ного этанола в аппарате Сокслета при температуре кипения этанола в течение 4 часов. Полученный спиртовой экстракт фильтруют на воронке Бюхнера под вакуумом, упаривают до образования сгущенного остатка (примерно 30 мл), добавляют около 10 мл воды и кристаллизуют при + 4^oC в холодильнике. Выпавшие кристаллы маннита двукратно очищают перекристаллизацией. Кристаллы маннита фильтруют и сушат при 60^oС. Выход маннита составляет 7,80 г или 7,80% к сырью.

Далее водоросли, оставшиеся после извлечения маннита, "сушат" под тягой для удаления остатков спирта, после чего их загружают в колбу вместимостью 2 л и заливают 1500 мл горячей (температура 90^oС) дистиллированной воды. Нагревание смеси проводят на электроплитке при температуре 90^oC. Экстракцию проводят в течение 45 мин двукратно. Полученные горячие водные экстракты сливают с жома, объединяют, фильтруют под вакуумом. Объединенный профильтрованный экстракт упаривают в колбе Вюрца под вакуумом при остаточном давлении 0,3 атм и температуре 70^oC до плотности 1,05-1,06 г/см³. Полученный водный концентрат обрабатывают трехкратным объемом 96%-ного этанола. Выпавший осадок водорастворимого полисахаридного комплекса декантируют и фильтруют на воронке Бюхнера под вакуумом. Осадок трехкратно промывают на воронке 96% -ным этанолом, сушат при температуре 60^oC в вакуум-сушильном шкафу.

Выход водорастворимого полисахаридного комплекса типа "Ламинарид" составляет 12,48 г или 12,48% к сырью.

Оставшийся после осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса типа "Ламинарид" спиртовый маточный раствор (примерно 400 мл) упаривают под вакуумом до 1/10 объема. Затем полученный концентрат обрабатывают 160 мл 90%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугируют на лабораторной центрифуге при 2000 обор./мин. К отфугованному осадку в стакане добавляют 45 мл 0,5% раствора соляной кислоты, стакан со смесью закрывают и оставляют на 2,5 ч при комнатной температуре. После 2,5 часов к образовавшемуся раствору добавляют 0,5 М раствор цетавлона для переведения кислых полисахаридов в осадок. Добавление 0,5 М раствора цетавлона проводят до тех пор, пока не прекратится образование осадка кислых полисахаридов. Через 10 мин после отстаивания осадок отделяют через фильтр. Недосадочную жидкость (45 мл) обрабатывают 180 мл 90%-ного этанола. Выпавший осадок ламинарана фильтруют под вакуумом, промывают дважды 96%-ным этанолом, сушат в вакуум-сушильном шкафу при 60^oC. Выход ламинарана 4,50 г или 4,50% к сырью.

Далее, осадок кислых полисахаридов, образованный после добавления цетавлона, растворяют в 20 мл 0,5% раствора соляной кислоты путем перемешивания смеси на магнитной мешалке в течение 15 мин. Полученный раствор фукоидана обрабатывают 80 мл 80% этанола. При этом выпадает осадок фукоидана, который фильтруют под вакуумом, промывают дважды 80%-ным этанолом, сушат при 60^oC. Выход фукоидана состаляет 2,10 г или 2,10% к сырью.

Жом водорослей, оставшийся после экстракции описанных выше 4-х продуктов, помещают в колбу вместимостью 3 л, заливают 2,5 л 2,0% раствора карбоната натрия и экстрагируют на водяной бане при температуре 60^oC в течение 1,5 ч. Водно-щелочной экстракт далее декантируют с жома и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера. Затем водно-щелочной экстракт обрабатывают примерно 150 мл концентрированной серной кислоты (99,95%) путем медленного добавления небольших порций кислоты (5 мл) к экстракту. При этом выделяющийся осадок альгиновой кислоты фильтруют, переносят количественно в колбу вместимостью 3 л, добавляют 300 мл 1,5%-ного раствора карбоната натрия, перемешивают, осадок альгиновой кислоты переходит в раствор альгината натрия. Альгинат натрия высаждают из раствора путем добавления к нему 1,8 л 96%-ного этанола. Образующийся осадок фильтруют и сушат при температуре 60^oC. Выход альгината натрия составляет 12,35 г или 12,35% к сырью.

П р и м е р 3. Беломорские водоросли сушат при 50^oC, освобождают от механических примесей, отвешивают 100 г для анализа. Навеску водорослей измельчают до частиц 3 мм и экстрагируют 500 мл 85%-ного этанола в аппарате Сокслета при температуре кипения этанола в течение 2 ч. Полученный спиртовый экстракт фильтруют на воронке Бюхнера под вакуумом, упаривают до образования сгущенного остатка (примерно 30 мл), добавляют около 10 мл воды и кристаллизуют при 4^oC в холодильнике. Выпавшие кристаллы маннита двукратно очищают перекристаллизацией. Кристаллы маннита фильтруют и сушат при 60^oC. Выход маннита составляет 7,13 г или 7,13% к сырью.

Далее, водоросли, оставшиеся после извлечения маннита, "сушат" под тягой для удаления остатков спирта, после чего их загружают в колбу вместимостью 2 л и заливают 500 мл горячей (температура 70^oC) дистиллированной воды. Нагревание смеси проводят на электроплитке при температуре 70^oC. Экстракцию проводят в течение 15 мин двукратно. Полученные горячие водные экстракты сливают с жома, объединяют, фильтруют под вакуумом. Объединенный профильтрованный экстракт упаривают в колбе Вюрца под вакуумом при остаточном давлении 0,3 атм и температуре 70^oC до плотности 1,05-1,06 г/см³. Полученный водный концентрат обрабатывают однократным объемом 96%-ного этанола. Выпавший осадок водорастворимого полисахаридного комплекса декантируют и фильтруют на воронке Бюхнера под вакуумом. Осадок трехкратно промывают на воронке 96% -ным этанолом, сушат при температуре 60^oC в вакуум-сушильном шкафу. Выход водорастворимого полисахаридного комплекса типа "Ламинарид" составляет 11,38 г или 11,38% к сырью.

Оставшийся после осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса типа "Ламинарид" спиртовый маточный раствор (примерно 200 мл) упаривают под вакуумом до 1/10 объема. Затем полученный концентрат обрабатывают 40 мл 70% -ного этанола. Выпавший осадок центрифугируют на лабораторной центрифуге при 2000 обор./мин. К отфугованному осадку в стакане добавляют 30 мл 0,3% раствора соляной кислоты, стакан со смесью закрывают и оставляют на 1,5 часа при комнатной температуре. После 1,5 ч к образовавшемуся раствору добавляют 0,5 М раствор цетавлона для переведения кислых полисахаридов в осадок. Добавление 0,5 М раствора цетавлона проводят до тех пор, пока не прекратится образование осадка кислых полисахаридов. Через 10 мин после отстаивания осадок отделяют через фильтр. Недосадочную жидкость (25 мл) обрабатывают 50 мл 70%-ного этанола. Выпавший осадок ламинарана фильтруют под вакуумом, промывают дважды 96%-ным этанолом, сушат в вакуум-сушильном шкафу при 60^oC. Выход ламинарана 4,11 г или 4,11% к сырью.

Далее, осадок кислых полисахаридов, образованный после добавления цетавлона, растворяют в 20 мл 0,3% раствора соляной кислоты путем перемешивания смеси на магнитной мешалке в течение 15 мин. Полученный раствор фукоидана обрабатывают 40 мл 60% этанола. При этом выпадает осадок фукоидана, который фильтруют под вакуумом, промывают дважды 60%-ным этанолом, сушат при 60^oC. Выход фукоидана составляет 1,95 г или 1,95% к сырью.

Жом водорослей, оставшийся после экстракции описанных выше 4-х продуктов, помещают в колбу вместимостью 2 л, заливают 1,5 л 1,0% раствора карбоната натрия и экстрагируют на водяной бане при температуре 40^oC в течение 0,5 ч. Водно-щелочной экстракт далее декантируют с жома и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера. Затем водно-щелочной экстракт обрабатывают примерно 50 мл концентрированной серной кислоты (99,95%) путем медленного добавления небольших порций кислоты (5 мл) к экстракту. При этом выделяющийся осадок альгиновой кислоты фильтруют, переносят количественно в колбу вместимостью 2 л, добавляют 300 мл 1,5%-ного раствора карбоната натрия, перемешивают, осадок альгиновой кислоты переходит в раствор альгината натрия. Альгинат натрия высаждают из раствора путем добавления к нему 1,2 л 90%-ного этанола. Образующийся осадок фильтруют и сушат при температуре 60^oC. Выход альгината натрия составляет 12,01 г или 12,01% к сырью.

Целевые продукты были проверены на биологические активности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МАННИТА а) ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ В опытах на 36 белых крысах массой 200-230 г методом Кербера при пероральном введении установлено для маннита LD₅₀>5000 мг/кг. Согласно классификации токсичности веществ маннит следует отнести к группе практически нетоксичных веществ.

б) CЛАБИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ Изучено слабительное действие маннита описанным в литературе способом, для чего регистрировалась масса кала за 24 часовой отрезок времени, после перорального введения маннита в дозе 200 мг/кг в виде водного раствора в объеме 5 мл. Опыты ставились на 36 белых крысах массой 200-220 г. В качестве препарата сравнения использовалось официнальное слабительное средство "Ламинарид" в той же дозе. Установлено, что суточная масса кала после введения маннита составила 2,4 0,18 г против 0,70,04 г в контрольных опытах с введением физиологического раствора (Р<0,05) и 1,70,18 г в опытах с введением ламинарида (Р<0,05).

2. ХАРАКТЕРИСТИКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛАМИНАРАНА И ФУКОИДАНА а) ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ В опытах на 36 белых крысах массой 190-230 г методом Кербера при пероральном введении установлено для ламинарана и фукоидана LD₅₀>5000 мг/кг, что позволяет отнести данное вещество к группе практически нетоксичных веществ.

б) СЛАБИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ Изучение слабительного действия ламинарана и фукоидана путем регистрации суточной массы кала после перорального его введения в дозе 200 мг/кг в объеме 3 мл водного раствора в опытах на 36 белых крысах показало, что масса кала в опытах с ламинараном и фукоиданом составила 2,05 0,32 г против 0,630,11 г в контрольных опытах с введением физиологического раствора (Р<0,05) и 1,7 0,18 г в опытах с введением официнального слабительного средства ламинарида (Р>0,05).

Таким образом, слабительное действие ламинарана и фукоидана превосходило уровень контрольных опытов на 225,3%, а ламинарида - официнального слабительного препарата - на 20,5%, что позволяет рекомендовать исследуемые вещества в качестве эффективных слабительных средств.

3. ХАРАКТЕРИСТИКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬГИНАТА НАТРИЯ а) ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ В опытах на 36 белых крысах массой 210-230 г методом Кербера при пероральном введении установлено для альгината натрия LD₅₀>5010 мг/кг, что позволяет отнести альгинат натрия к группе практически нетоксичных веществ.

б) СЛАБИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ Изучение слабительного действия путем определения суточной массы кала после перорального введения альгината натрия в дозе 200 мг/кг в опытах на 36 белых крысах показало, что масса кала в опытах с альгинатом натрия составила 4,10,3 г против 0,7 0,09 г в контрольных опытах с введением физиологического раствора (Р<0,05) и 1,7 0,18 г в опытах с введением официнального слабительного препарата ламинарида (Р<0,05). Таким образом, слабительное действие альгината натрия превышало аналогичный эффект контрольных опытов на 485,7%, официнального препарата ламинарида - на 141,1%.

в) ГИПОХОЛЕСТЕРИНЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Гипохолестеринемическое действие альгината натрия изучалось на 30 белых крысах с гиперхолестеринемией, вызванной однократным внутрибрюшинным введением тритона в дозе 50 мг/кг. Установлено, что пероральное введение животным с гиперхолестеринемией альгината натрия в дозе 200 мг/кг обусловило снижение в сыворотке крови общего холестерина до 1,960,13 ммоль/л против 3,64 0,26 ммоль/л у животных с гиперхолестеринемией (контроль), т.е. на 46,3% (Р<0,001). У интактных животных уровень общего холестерина в сыворотке крови составил 1,29 0,26 ммоль/л. Таким образом, альгинат натрия вызывает значительное снижение общего холестерина в крови, по-существу обеспечивая нормализацию его содержания у животных с гиперхолестеринемией (разница в уровне холестерина у здоровых животных и животных, получавших альгинат натрия, была мало существенной Р>0,05).

г) РАДИОНУКЛИДСВЯЗЫВАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ Изучение радионуклидсвязывающей активности (РНСА) альгината натрия проводилось по разработанной в Киевском государственном институте усовершенствования врачей методике, которая защищена авт.св. N 274598. В качестве индикатора использовали стронций-85. Эталоном сравнения служил цитрусовый пектин. Результаты испытаний представлены в табл.32.

Полученные результаты позволяют заключить, что альгинат натрия обладает радионуклидсвязывающей активностью, превышающей такую активность эталано - цитрусовго пектина - на 45,36%.

Результаты изучения слабительного, гипохолестеринемического, радионуклидсвязывающего действия альгината натрия, а также его низкая токсичность позволяет оценить его как перспективное лечебное средство.

4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА а) ОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ В опытах на 36 белых крысах массой 180-240 г методом Кербера при пероральном введении установлено для водорастворимого полисахаридного комплекса LD₅₀>3500 мг/кг. В опытах на 36 белых мышах массой 20-40 г методом Кербера при внутрибрюшинном введении для данного комплекса установлено LD₅₀>1000 мг/кг. Согласно классификации токсических веществ исследованное вещество следует отнести к группе малотоксичных веществ.

б) СЛАБИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ Слабительное действие изучаемого вещества изучалось на белых крысах и собаках описанными методами. В одном случае (опыты на 18 крысах) о слабительной активности веществ судили по величине пассажа (в мм) по кишечнику с использованием метки. Метка делалась путем введения крысам зондом в желудок 5% взвести активированного угля. За 20 мин до перорального введения исследуемых веществ в дозе 200 мг/кг в объеме 2 мл водного раствора. Животных забивали через 2 ч декапитированием и замеряли степень продвижения активированного угля (метки). В других опытах (опыты на 18 крысах и 12 собаках) о слабительном действии исследуемых веществ судили по величине дефекации животных (количестве и консистенции кала), помещенных в специальные для этих целей клетки. В этом случае животным перорально вводились исследуемое вещество в дозе 200 мг/кг в объеме 2 мл крысам или 300 мл собакам водного раствора с последующим (через 24 ч) взвешиванием фекалий (в г) и описан