Способ исследования процесса сборки иммуноглобулиновых рецепторов в-лимфоцитов

Способ исследования процесса сборки иммуноглобулиновых рецепторов в-лимфоцитов

Реферат

 

Использование: медицина, клиническая иммунология, для исследования процесса сборки иммуноглобулиновых рецепторов B-лимфоцитов. Целью изобретения является повышение информативности способа. Сущность изобретения: исследуют процесс сборки иммуноглобулиновых рецепторов (I_g= R) B-лимфоцитов в динамике с помощью люминесцентной антиглобулиновой сыворотки, регистрируют пять основных параметров фазовых состояний рецепторов клетки - "ринг", "петч", "кэп", "петч + эндоцитоз", "эндоцитоз". Для характеристики особенностей сборки I_g= R в норме и патологии введен коэффициент (К), представляющий собой сумму отношений максимального значения параметра "петч + эндоцитоз" к максимальным значениям остальных параметров. Среднее значение К у здоровых детей равно 18,6 ед., у детей же с различными патологическими состояниями он колеблется от 13 ед. и ниже. Способ позволяет установить наличие двух путей сборки рецепторов ИКК. Для (I_g= R) B-лимфоцитов у здоровых детей основным является "петч + эндоцитоз". Введение К дает возможность количественно охарактеризовать преобладание того или иного пути сборки R у конкретного индивидуума, что может быть использовано для уточнения патогенеза заболевания, для дифференциальной диагностики и т.д. Способ доступен для педиатрических клиник, так как не требует большого количества крови и обладает большой информативностью. 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии.

Взаимодействие лигандов с рецепторами (R) иммунокомпетентных клеток приводит к изменению расположения последних. При этом R на поверхности клеток могут собираться в форме кластеров, петчей или кэппов (что обусловливается состоянием мембраны, цитоскелета и/или других факторов) с последующим погружением их внутрь цитоплазмы - эндоцитоз. В то же время известно, что основным механизмом работы иммуноглобулиновых рецепторов (I_g - R) B-лимфоцитов является "петч+эндоцитоз" (Р.Н.Глебов, 1987).

Одним из способов определения функционального состояния I_g - R В-лимфоцитов является метод регистрации кэппобразования с помощью люминесцентной антиглобулиновой сыворотки. При этом учитываются два параметра: "кэп", "эндоцитоз".

При дифференцированном подходе к оценке иммунофлюоресцентного свечения мембраны клетки, авторами было отмечено, что большой процент клеток имеет существенные отличия картины свечения от описанных ранее. В связи с этим предлагается ввести дополнительные показатели и регистрировать различные фазовые состояния рецепторов по следующим пяти основным параметрам: 1) "ринг" - равномерное свечение внешней оболочки клетки; 2) "петч" - гранулярное свечение по всей внешней оболочке; 3) "кэп" - свечение одного из полюсов клетки (с учетом особенностей - О-образный, грушеобразный кэп); 4) "петч + +эндоцитоз" - гранулярное свечение внешней оболочки с отдельными свечениями внутри клетки; 5) "эндоцитоз" - светящиеся включения внутри клетки (цитоплазмы) при отсутствии свечения внешней оболочки (см.фиг.1).

Процесс сборки I_g - R В-лимфоцитов рассматривается в динамике (в течение 30 мин) с параметрированием по всем пяти показателям в фиксированных препаратах через определенные промежутки времени (0'; 2'; 5'; 8'; 12; 16; 20; 30 мин).

Аналогов не выявлено.

Целью разработки метода и изобретения стало расширение и углубление объема иммунологического обследования, в частности поиск новых подходов к изучению механизмов работы рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток в норме и при различных патологических состояниях.

Описание метода.

3 мл венозной гепаринизированной крови разводится стерильным 0,9%ным физиологическим раствором или средой 199 в соответствии 1:2 и осторожно (чтобы не произошло смешение сред) наслаивается на 2 мл фиколлверографинового инградиента с плотностью 1,077, для выделения взвеси лимфоцитов. Центрифугируют в течение 45 мин при 1500 об/мин. Отсасывается лимфоцитарное кольцо с границы "плазма - фиколл" верографин, переносится в центрифужную пробирку и дважды отмывается в 6 мл физиологического раствора или среды 199 с последующим центрифугированием в течение 15-20 мин в том же режиме. Осадок разводится в стерильном физиологическом растворе или среде 199 для получения взвеси клеток в концентрации 2 10⁶ в 1 мл.

Для приготовления "подложки" для получения монослоя клеток, обезжиренные стекла (8 шт.) обрабатываются 0,5%-ным раствором формвара (Formvar, 1595Е) в дихлорэтане и помещаются во влажные камеры (чашки Петри). 0,1 мл взвеси лимфоцитов наносится в центр формваровой "подложки" и инкубируется 12-15 мин при 37^оС для прикрепления клеток. (Нанесение клеток на предметные стекла должно производится не ранее, чем через 15-20 мин после приготовления формвароной "подложки", для исключения гибели клеток под воздействием дихлорэтана). После инкубации чашки Петри с предметными стеклами помещаются в водно-ледяную камеру и производится троекратное отмывание препаратов в охлажденном физрастворе или среде 199. На прикрепленные клетки наслаивается 0,1 мл люминесцентной антиглобулиновой сыворотки (производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, разведенной согласно указанному титру), и водно-ледяная камера, с находящимися в ней чашками Петри, помещается в холодильник (Т = -4^оС) на 12-15 мин, для соединения лиганда с рецепторами и искусственного затормаживания процесса сборки R. Троекратно отмывают препараты в охлажденном физрастворе или среде 199. Первый препарат, соответствующий 0-мин исследования, тут же фиксируется 2%-ным раствором формалина. Остальные препараты (7 шт.), находящиеся во влажных камерах, помещаются в термостат при 37^оС и поочередно фиксируются 2%-ным раствором формалина на 2, 5, 8, 12, 20 и 30 мин.

Микроскопирование готовых препаратов проводится в день исследования на люминесцентном микроскопе под постоянным контролем морфологии клеток в световом режиме, при использовании объектива 60, окуляра 7 в формалиновой среде.

В первом препарате (0-мин) производят подсчет светящихся лимфоцитов из 100 лимфоцитов, определенных в световом поле, что указывает на процентное содержание В-лимфоцитов у данного индивидуума.

В остальных препаратах, соответствующих определенному интервалу времени, единомоментно дифференцированно регистрируются все пять параметров фазовых состояний R клетки - "ринг", "петч", "кэп", "петч + эндоцитоз", "эндоцитоз" на 100 В-лимфоцитов. Данные параметрирования заносят в таблицу для последующей статистической обработки и построения кинетических кривых, что отображено в табл. 1 и 2 и на фиг. 2 и 3 соответственно.

Результаты исследований характера сборки I_gR B-лимфоцитов подтвердили данные литературы, что основным вариантом сборки R этих клеток у здоровых детей является "петч + эндоцитоз" - 70-80% клеток на 2-5 мин, в то время как на кэппообразующие клетки приходится 20-30% (на 8-30 мин).

Для характеристики особенностей сборки I_gR в норме и патологии авторами был введен коэффициент (К), представляющий собой сумму отношений максимальных значений основного параметра - "петч + эндоцитоз" - к максимальным значениям остальных параметров - "ринг", "петч", "кэп", "эндоцитоз".

Установлено, что значение коэффициента (К) у здоровых детей в среднем равно 18,6 ед. (14-26,5 ед.), в то время как у детей с различными патологическими состояниями он колеблется от 13 ед. и ниже.

Формула изобретения

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА СБОРКИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В-ЛИМФОЦИТОВ, включающий обработку сыворотки крови люминесцентной антиглобулиновой сывороткой и исследование полученного препарата под микроскопом, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности способа, процесс сборки рецепторов исследуют в динамике в течение 30 мин, при этом регистрируют состояния рецепторов, характеризующиеся равномерным свечением внешней оболочки клетки, гранулярным свечением по всей внешней оболочке клетки, свечением одного из полюсов клетки при учете типа свечения, гранулярным свечением внешней оболочки с отдельными свечениями внутри клетки, а также состояние, характеризующееся и светящимися включениями внутри клетки при отсутствии свечения внешней оболочки, затем рассчитывают диагностический показатель, как сумму отношений максимального значения четвертого из перечисленных показателей к максимальным значениям остальных показателей, по которому осуществляют оценку характера направленности процесса сборки.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5