Штамм культивируемых клеток растений cnidium monnieri (l.) cuss, используемый для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью

Штамм культивируемых клеток растений cnidium monnieri (l.) cuss, используемый для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью

Реферат

 

Использование: для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью, относится к биотехнологии. Сущность изобретения: каллусный штамм Cm - 1 получен из дикорастущего растения Cnidium monnieri (L.) Cuss., заготовленного в Надеждинском районе Приморского края. Ростовой индекс культуры 3030 0,50,5. Препарат представляет собой белковую фракцию, выделенную из биомассы клеток штамма Cm - 1, и имеет следующие характеристики (из расчета на 1 г сухих клеток): суммарная рибонуклеазная активность 52610 - 79990 ед. ; концентрация белка 179 - 198 опт.ед.; удельная рибонуклеазная активность 270 - 438 ед./опт.ед. Максимальное накопление рибонуклеазной активности в клетках наблюдается на 35-е сут культивирования. 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в косметической, парфюмерной, медицинской отраслях промышленности и сельском хозяйстве.

Препараты, обладающие рибонуклеазной активностью, используются в медицине как противовирусный препарат, обладают антимикробным действием, оказывают летальное действие на дрожжи и термофильные бактерии, широко используются как биохимический препарат в молекулярной биологии и генной инженерии.

В настоящее время источниками получения препаратов, обладающих рибонуклеазной активностью, являются бактериальные и животные клетки. В частности, получены неспецифическая бациллярная РНКаза (препарат "биназа") и панкреатическая рибонуклеаза А (Прикладная биохимия и микробиология, 1991, вып. 27, N 3, с. 308-329).

Так как известные источники получения препаратов, обладающих рибонуклеазной активностью, полностью не удовлетворяют потребительский спрос, поиск новых доступных и возобновимых источников является актуальной проблемой. Растительные источники получения препаратов, обладающих рибонуклеазной активностью, не известны.

Предлагается штамм Cm-1 культивируемых клеток растений Cnidium monnieri, используемый для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью.

Травянистое растение Cnidium monnieri (L.) Cuss. (Selinum monnieri L.) - Жгун-корень Моннье распространено в Приморье и Приамурье (Шретер. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока. 1975, с. 328).

Штамм Cnidium monnieri (L.) Cuss. получен и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК (ВР) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 40. Наименование штамма - Cm-1.

Исходным материалом для получения штамма Cm-1 было дикорастущее растение Cnidium monnieri (L.) Cuss., заготовленное в октябре 1987 года в Надеждинском районе Приморского края. Эксплантаты изолированы из стеблей диаметром 3-4 мм.

Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой ткань плотной консистенции, бледно-желтого цвета с зеленоватым оттенком. Ростовой индекс 30 0,5 для каллусов начальной биомассой 200 мг. Живых клеток 90-93% в середине стадии экспоненциального роста, содержание сухого вещества 5,2% . Штамм Cm-1 выращивают при температуре 24 1^оС, относительной влажности воздуха 60 10% в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1500-2300 NH₄NO₃ 350-450 CaCl₂ 2H₂O 400-480 MgSO₄ 7H₂O 350-400 KH₂PO₄ 150-190 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ 4H₂O 15,6-26,7 CoCl₂ 2H₂O 0,02-0,03 CuSO₄ 5H₂O 0,02-0,03 ZnSO₄ 7H₂O 6,0-10,3 Na₂MoO₄ 2H₂O 0,2-0,3 KI 0,53-0,90 FeSO₄ 7H₂O 25,0-30,6 Na₂EDTA 2H₂O 33,6-41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,45-0,55 Никотиновая кислота 0,45-0,55 Мезо-инозид 80-120 Казеина гидролизат 40-60 6-Бензиламинопурин 0,4-0,6 -нафтилуксусная кислота 1,5-2,5 Сахароза 25000-35000 Агар 5800-6200 Среда до автоклавирования имеет рН 5,6-5,8.

Ткань культивируется в пробирках размером 30 х 200 мм, содержащих 30 мл среды. Продолжительность цикла выращивания 35 сут, номер пассажа 30-й.

Цитологические и кариологические характеристики штамма Cm-1.

Ткань представляет собой гетерогенную популяцию, состоящую из двух групп клеток. Первая группа - клетки меристематического типа круглой и овальной формы, имеющие средние размеры 65 х 79 мкм, содержание в популяции 57-65% , и клетки паренхимного типа удлиненной формы, имеющие средние размеры 113 х 172 мкм, содержание в популяции 35-43%. Максимумы митотической активности наблюдаются на 6-е и 24-е сут культивирования, митотический индекс 4,6 и 3,8 соответственно.

Культура характеризуется анеуплоидией, увеличенным по сравнению с интактным растением количеством хромосом (табл. 1).

Характеристика рибонуклеазной активности препарата, полученного из биомассы штамма Cm-1 Cnidium monnieri.

После окончания цикла культивирования (35 сут) биомассу клеток сушат, белки экстрагируют трис-HCl буфером и концентрируют путем дробного высаливания сульфатом аммония.

Полученная белковая фракция представляет собой препарат, обладающий рибонуклеазной активностью.

Рибонуклеазную активность препаратов из биомассы штамма Cm-1 определяют спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстрата дрожжевую рибонуклеазу.

Препарат, полученный из штамма Cm-1, имеет следующие характеристики, из расчета на 1 г сухих клеток биомассы: Суммарная рибонуклеазная активность 52610-79990 ед.; Концентрация белка 179-198 опт. ед.; Удельная рибонуклеазная активность 270-438 ед./опт. ед.

В табл. 2 приведены характеристики препаратов, полученных из биомассы клеток в процессе долговременного культивирования штамма.

Максимальное накопление рибонуклеазной активности в клетках наблюдается на 35-е сут культивирования. Сухие и сырые (нативные) клетки имеют одинаковую активность.

П р и м е р. В пробирки размером 30 х 200 мм наливают по 30 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1900 NH₄NO₃ 400 CaCl₂ 2H₂O 440 MgSO₄ 7H₂O 370 KH₂PO₄ 170 H₃BO₃ 6,2 MnSO₄ 4H₂O 22,3 CoCl ₂2H₂O 0,025 CuSO₄ 5H₂O 0,025 ZnSO₄ 7H₂O 8,6 Na₂MoO₄ 2H₂O 0,25 KI 0,83 FeSO₄ 7H₂O 27,8 Na₂EDTA 2H₂O 37,3 Тиамина гидрохлорид 0,2 Пиридоксина гидрохлорид 0,5 Никотиновая кислота 0,5 Мезо-инозит 100 Казеина гидролизат 50 6-Бензиламинопурин 0,5 -нафтилуксусная кислота 2,0 Сахароза 30000 Агар 6000 Среда имеет рН 5,6.

Пробирки со средой стерилизуют при 117^оС в течение 20 мин, затем в асептических условиях в каждую пробирку помещают по 200 мг клеточной биомассы штамма Cm-1. Культивирование проводят в темноте при 24^оС и относительной влажности воздуха 60% в течение 35-ти сут. Затем биомассу снимают с поверхности питательной среды, взвешивают. В каждой пробирке накапливается от 6 до 10 г сырой биомассы. Биомассу сушат при 55^оС в токе горячего воздуха в течение суток. Биомассу экстрагируют трис-HCl буфером, гомогенизируют и выдерживают при температуре 4^оС. Супернатант сливают, а осадок экстрагируют дважды, как указано выше. Из объединенного супернатанта выделяют белковую фракцию путем дробного высаливания сульфатом аммония: объединенный супернатант высаливают первоначально 20% сульфатом аммония, сформированный осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, затем к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60% насыщения и опять центрифугируют в том же режиме.

Белковая фракция представляет собой препарат, обладающий рибонуклеазной активностью.

Оценка рибонуклеазной активности препарата.

В пробу добавляют 0,5 мл раствора дрожжевой РНК (2 мг/мл), 0,45 мл 0,2 М трис-HCl буфера (рН 6,2) и 0,05 мл исследуемого раствора. Реакционную смесь инкубируют в течение 15 мин при температуре 37^оС. Реакцию останавливают добавлением 2 мл холодного 0,05% спиртового раствора MgCl₂. Для формирования осадка реакционную смесь оставляют на холоде в течение 20 мин. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. В контрольную пробу добавляют все игредиенты, кроме исследуемого раствора.

Активность определяют на спектрофотометре при длине волны 260 нм в пересчете на 1 мл исследуемого раствора фермента. Суммарную активность рассчитывают как произведение активности 1 мл пробы на объем исследуемого раствора.

Концентрацию белка измеряют по поглощению света при длине волны 280 нм, допуская, что 0,1% раствор имеет оптическую плотность, равную единице.

Удельную активность РНКазы определяют путем деления активности данного фермента на его поглощение при длине волны 280 нм и выражают в ед. акт. /опт. ед.

Рибонуклеазная активность всех препаратов определена из расчета на 1 г сухих клеток биомассы штамма Cm-1 (табл. 3, 4).

Таким образом, штамм Cm-1 культивируемых клеток растения Cnidium monnieri является высокопродуктивным и возобновимым источником для биотехнологического получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью.

Формула изобретения

ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ CNIDIUM MONNIERI (L ) CUSS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО РИБОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

Штамм культивируемых клеток растений Cnidium monnieri (L.) Cuss. ВСКК (ВР) N 40, используемый для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2