Способ определения нарушений порфиринового обмена

Способ определения нарушений порфиринового обмена

Реферат

 

Использование: медицина, экологические исследования, радиология, ветеринария для скрининг-диагностики нарушений порфиринового обмена. Целью изобретения является разработка простого, высокопроизводительного инструментального микрометода для определения нарушений порфиринового обмена, основанного на определении уровней цинкпротопорфирина, а также соотношения ЦПП/гем в биологических объектах, в частности в крови, эритроцитарной массе, тканевых экстрактах. Кроме того, целью изобретения является разработка специальной композиции, необходимой для осуществления данного способа и являющейся его ключевым звеном. Сущность изобретения: определяют цинкпорфирины по интенсивности длительной люминесценции. Это свойство они проявляют в специальных условиях (композиция буферного раствора), которые оптимизированы для данной задачи. Способ позволяет также одновременно оценивать содержание гемоглобина в крови и рассчитывать производный показатель, отношение цинк-протопорфирин-гем, которое также имеет высокую диагностическую значимость. Метод предназначен для широкого использования в качестве первичного скрининга на нарушения порфиринового обмена среди больших групп пациентов (диспансерное обслуживание, профвредности, обследование групп риска и т.п.). 6 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к методам скрининг-диагностики нарушений порфиринового обмена и может быть использовано в медицине, экологических исследованиях, радиологии, ветеринарии и т.п.

Нарушения порфиринового обмена вызываются воздействием экзогенных факторов, в частности таких, как острые и хронические отравления тяжелыми металлами (свинцом, кадмием, ртутью и другими), химическими веществами (ароматическими углеводородами, соединениями группы диоксина, гербицидами и т. п.), воздействие малых доз радиации. Нарушения проявляются также при ряде заболеваний: при мышечной анемии, дефиците железа, онкологических заболеваниях и ряде других. В большинстве случаев имеет место продолжительное воздействие факторов риска в малых дозах на большие группы населения как, например, проживание на экологически неблагоприятной территории обстановкой (зона Чернобыльской аварии и экологических катастроф), работа на производстве с вредными технологическими циклами (свинцовые, гальванические, металлургические, электротехнические, химические и другие). Данные воздействия носят кумулятивный характер и со временем приводят к характерным клиническим проявлениям и необходимости терапевтического лечения.

Характерным биохимическим проявлением для этой группы нарушений и особенно для острых и хронических свинцовых отравлений является, в частности, повышение уровней цинкпротопорфирина (ЦПП) в крови. В настоящее время доказана большая клиническая значимость этого показателя для диагностики свинцовых отравлений и других нарушений порфиринового обмена.

Известно, что ЦПП является преимущественно эритроцитарным компонентом крови. Его уровни составляют порядка 0,5 мкмоль/л в норме. При нарушениях порфиринового обмена уровни ЦПП значительно возрастают до 5 мкмоль/л и выше. При определения ЦПП обычно используют цельную кровь или эритроцитарную массу. В то же время сам по себе показатель содержания ЦПП в крови является недостаточно надежным. Более надежным и информативным, как было показано во многих исследованиях и на статистическом материале, является производный показатель отношение ЦПП/гем. Этот показатель в основном устраняет влияние ошибок, связанных с невоспроизводимостью процедуры отбора крови, вариациями в содержании эритроцитов и их целостности. Нормальные величины для этого параметра составляют порядка 30 мкмоль/моль гема.

В настоящее время описан ряд методов определения ЦПП в биологических жидкостях (крови, эритроцитарной массе, тканевых экстрактах и т.п.). Большинство методов, используемых в клинической практике, являются узкоспециальными и позволяют определять в крови либо только ЦПП, либо гем. Определение ЦПП основано обычно на измерении его флуоресценции, а гем определяют по его поглощению, используя соответствующие приборы. Для определения ЦПП наиболее надежным и точным методом является высокоэффективная жидкостная хроматография с флуориметрической детекцией. Определению обычно предшествует стадия предобработки: разведение аналитическим лизирующим буфером или предварительное разделение образца крови (экстракцией, или хроматографией). Способы, как правило, дорогостоящие, трудоемки и имеют относительно низкую производительность (порядка 5 анализов в час) и мало подходят для использования в качестве массового скрининг-теста. Определение отношения ЦПП/гем при этом возможно лишь комбинированием двух различных методик.

Прототипом предлагаемого способа определения нарушений порфиринового обмена, который также основан на определении уровней ЦПП или отношения ЦПП/гем в биологических пробах, является гематофлуориметрия. Способ имеет соответствующее приборное оформление (гематофлуориметр, например, Protofluor Z (США) и используется в клинической практике для диагностики свинцовых отравлений и ряда других нарушений порфиринового обмена, (см. выше). Он включает в себя разведения образца крови специальным раствором, который обеспечивает лизис эритроцитов и переводит гем в одну спектральную форму, после чего образец помещают на предметном стекле в гематофлуориметр, который сразу измеряет люминесценцию ЦПП (флуоресценцию) и поглощение гема в тонком слое раствора образца.

Однако этот метод имеет невысокую производительность (не более 10 образцов в час), сложно автоматизируется и не пригоден для анализа больших массивов образцов. Он также подвержен влиянию ряда факторов (оптических свойств крови и флуоресцирующих пигментов, входящих в состав крови рибофлавин и билирубин), которые невоспроизводимы и могут влиять на результаты анализа.

Целью изобретения является разработка простого, высокопроизводительного инструментального микрометода для определения нарушений порфиринового обмена, основанного на определении уровней цинкпротопорфирина, а также соотношения ЦПП/гем в биологических объектах, в частности, в крови, эритроцитарной массе, тканевых экстрактах. Метод предназначен для широкого использования в качестве первичного скрининга на нарушения порфиринового обмена среди больших групп пациентов (диспансерное обслуживание профвредности и обследование групп риска и т.п.).

Кроме того, целью изобретения является разработка специальной композиции, необходимой для осуществления данного способа и являющейся его ключевым звеном.

Сущность нового подхода в определении цинкпротопорфирина в биологических жидкостях заключается в использовании свойства цинковых комплексов порфиринов проявлять в определенных условиях длительную люминесценцию (фосфоресценцию и замедленную люминесценцию) в растворах при комнатной температуре. Это свойство положено в основу селективной детекции и количественной оценки цинкпорфиринов в образцах крови на основании измерения интенсивности длительной люминесценции. Хотя интенсивность длительной люминесценции ЦПП в несколько раз ниже, чем интенсивность его флуоресценции, чувствительность его детекции при использования импульсного режима измерения с миллисекундным временным разрешением оказывается выше за счет радикального снижения фоновых сигналов и влияния различных факторов на результаты измерений.

Преимущества такого подхода обусловлены тем фактом, что биологические образцы не содержат пигментов и других компонентов, которые также обладали бы длительной люминесценцией в тех же условиях, что и цинкпорфирины, и в том же спектральном и временном диапазоне. Этот факт дает возможность, используя режим измерения люминесценции с миллисекундным временным разрешением, исключить влияние фонового свечения (рассеяный свет, свечение флуоресцирующих примесей и т.п.) и селективно и с очень высокой чувствительностью регистрировать только цинкпорфирины. Учитывая тот факт, что в биологических образцах из цинкпорфиринов доминирует ЦПП, который является побочным пpодуктом в процессе биосинтеза гема из протопорфирина IX, данный подход позволяет определять в цельной крови только ЦПП.

Явление длительной люминесценции органических соединений (меток) в настоящее время получило распространение в иммунодиагностике. Такие метки, главным образом флуоресцирующие комплексы европия, используются для маркирования антител и обеспечивают высокую чувствительность и производительность в твердофазном иммуноанализе (например, метод DELFIA). Серийный выпуск высокопроизводительных приборов под данный метод, которые регистрируют длительную люминесценцию европиевых комплексов осуществляет, в частности, фирма Wallac (Финляндия). Известно также использование порфириновых красителей, обладающих длительной люминесценцией (водорастворимых Pd-, Pt-, Zn-порфиринов) в качестве высокочувствительных меток. Однако в изобретении явление длительной люминесценции металлокомплексов порфиринов (в частности, цинкпротопорфирина) используется по принципиально иному назначению для количественной оценки самого вещества, являющегося биологически активной компонентой живых организмов.

Основным фактором крови, который может существенно влиять на результаты анализа, является высокое содержание гемоглобина. Гемоглобин имеет интенсивные полосы поглощения в области возбуждения ЦПП и может создавать "эффект внутреннего фильтра" при больших концентрациях, т.е. искажать результаты определения ЦПП. Для устранения влияния этого фактора могут использоваться два пути: многократное разведение образца (крови) в ходе анализа, либо проведение предварительной стадии селективной экстракции ЦПП из образца подходящим органическим растворителем с последующим определением ЦПП в экстракте предлагаемым методом.

Измерения длительной люминесценции цинкпротопорфирина проводятся в специальном буферном растворе, который обеспечивает возгорание длительной люминесценции ЦПП в растворе и ее высокую интенсивность. Этот буферный раствор (композиция) разработан специально для реализации описанного способа определения ЦПП в крови. В его состав входят сульфит или бисульфит (натрия) и неионогенный ПАВ. Сульфит необходим для химической дезоксигенации раствора (удаление растворенного кислорода), который тушит длительную люминесценцию. Добавка Тритона Х-100 используется в качестве литической компоненты для разрушения эритроцитов и получения истинного раствора разбавленной крови, а также для усиления длительной люминесценции металлокомплексов порфиринов в водных растворах. Известно, что добавки поверхностно-активных веществ, преимущественно неионогенных ПАВ типа Тритона, Твинов и т.п. в концентрациях, обеспечивающих солюбилизацию молекул красителя, позволяют в несколько раз повысить интенсивность длительной люминесценции. Буфер стандартизирует также условия измерений по рН.

Было также обнаружено, что условия, в которых проводится измерение длительной люминесценции ЦПП, оптимально подходят также и для определения гема. При определении ЦПП в биологических объектах типа крови или эритроцитарной массы компоненты буферного раствора выполняют ряд дополнительных функций. ПАВ, в частности, обеспечивает также лизис клеточных компонентов крови, и получение истинного разбавленного раствора крови (действие), а сульфит переводит гемоглобин в одну спектральную форму (восстановленную). В этих условиях (т. е. истинный раствор, содержащий только одну форму гема) возможно вести определение содержание гема прямым фотометрированием разбавленного образца в области поглощения гема. При соответствующем подборе величины разведения возможно определить и ЦПП (по его длительной люминесценции), и гем (по его поглощению) в одном и том же разбавленном образце крови и в результате рассчитать величину отношения ЦПП/гем.

Таким образом, второй целью изобретения является разработка и оптимизация специальной композиции буферного раствора, в котором ведется определение ЦПП, а также гема. В состав этой композиции входят следующие основные компоненты: химический дезоксигенатор водных растворов сульфит или бисульфит (натрия), а также неионогенное поверхностно-активное вещество (типа Тритона, Твина и т.п.).

Таким образом, предложенные способ и композиция дают возможность измерить в образце крови содержание ЦПП (по длительной люминесценции), а также гема (по поглощению), и определить отношение ЦПП/гем. Они обеспечивают высокую чувствительность и надежность измерений. Особенность нового подхода заключается в том, что он отличается исключительной методической простотой, высокой производительностью. Метод легко адаптируется под уже имеющуюся приборную базу и не требует какого-либо специального оборудования, помимо расходной посуды, автоматических пипеток и простых растворов.

Изобретение осуществляют следующим образом.

П р и м е р 1. Исследование длительной люминесценции цинкпротопорфирина IX в растворах.

Стандартный препарат цинкпротопорфирина IX получен химическим синтезом, исходя из протопорфирина IX и ZnCl₂ по стандартной методике. Чистота препарата ЦПП составляла 96% по данным ВЭЖХ.

Состав буферного раствора для измерения длительной люминесценции ЦПП был следующим: 10 мг/мл Na₂SO₃, 1% Тритона Х-100, 5 мг/мл KH₂PO₄, рН 7,4.

Спектр длительной люминесценции ЦПП (некорректированный) приведен на фиг. 1. Он снят на люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkin Elmer, Англия) в режиме "фосфоресценция" при следующих параметрах измерения: время задержки после вспышки лампы 0,4 мс; время счета 15,0 мс; время интегрирования 5 с. В спектре эмиссии присутствуют три полосы с максимумом при 595 нм, 650 нм и 700 нм. Первые две полосы совпадают со спектром флуоресценции ЦПП. Они соответствуют спектру замедленной флуоресценции ЦПП (неисправленному). Третья полоса соответствует спектру фосфоресценции ЦПП.

Для количественных измерений оптимально проводить регистрацию в коротковолновой области длительной люминес- ценции ЦПП. Первая полоса с максимумом в районе 595 нм наиболее интенсивная и хорошо детектируется большинством фотоприемников (ФЭУ). Возбуждение люминесценции наиболее эффективно проводить в области полосы Сорэ поглощения (400-420 нм).

Кинетика затухания длительной люминесценции ЦПП описывается простым одноэкспоненциальным законом затухания, по которому было рассчитано время жизни длительной люминесценции ЦПП. Оно равно 12,5 мс в вышеописанном аналитическом буфере.

На фиг. 2 приведены кривые разведения (калибровочные кривые) для определения ЦПП. Для кривой А измерения проведены на приборе LS-50 в пластиковых пробирках в объеме 0,5 мл, условия счета аналогичны описанным для фиг. 1. В случае кривой Б измерения ЦПП проведены на высокочувствительном приборе Arcus-1231 (Wallac, Финляндия) для флуоресцентного иммуноанализа DELFIA в 12-луночных пластиковых полосках разборных микропланшетов в пробах объемом 0,3 мл. Условия измерения: возбуждение при 340 нм, регистрация при 613 нм; время задержки 0,4 мс; ворота счета 2,4 мс; время интегрирования 3 с.

Несмотря на неоптимальные условия измерения люминесценции ЦПП (как длины волн возбуждения и регистрации, так и временные параметры счета), которые связаны с конструкционными особенностями прибора Arcus-1231, график демонстрирует высокую чувствительность детекции ЦПП данным методом и хорошую линейность в широком концентрационном диапазоне. Чувствительность метода составляет порядка 0,1 нМ ЦПП, что примерно на 3 порядка ниже аналитического диапазона концентрацией ЦПП в крови.

При вариации состава буферного раствора в пределах 2-15 мг/мл по сульфиту или бисульфиту, 0,1-5% по Тритону-Х-100, по рН в диапазоне 6,5-8,5 не наблюдалось заметного изменения люминесценции ЦПП. Замена Тритона Х-100 на Твин-20, Твин-40 или Бридж также не влияла заметно на результаты определения.

На фиг. 3 показано влияние величины разведения крови на результаты определения ЦПП. Как видно, при разведении 1:500 и выше кровь перестает влиять на результаты определения ЦПП по длительной люминесценции.

П р и м е р 2. Прямой метод определения ЦПП в крови.

Измерения длительной люминесценции проводят в буфере, описанном в примере 1. Пробу крови из пальца (0,02-0,05 мл) разбавляют в пластиковых пробирках в 30 раз рабочим буфером (0,01 мл крови на 0,3 мл буфера). В лунки разборного микропланшета (12 8-луночных полосок, Nunc, Англия) заливают по 0,3 мл рабочего буфера и в каждую добавляют по 0,01 мл разбавленного образца крови (см. выше, конечное разведение крови 900 раз). Часть лунок использована под стандартные растворы ЦПП (например, 0,1; 0,03; 0,01; 0,005 микромоль/л ЦПП) для построения калибровочной кривой.

После этого измеряют интенсивность длительной люминесценции в лунках на приборе Arcus-1231 в условиях, описанных в примере 1. На основании измерений по стандартам ЦПП строят калибровочную кривую и по ней определяют содержание ЦПП в образцах крови (с учетом их разведения).

Образцы крови могут отбираться предварительно в пластиковые пробирки (смоченные раствором гепарина) и храниться в замороженном виде длительное время. Определение ЦПП после размораживания образцов проводят аналогично.

На результаты измерения ЦПП практически не оказывает влияние наличие в исходном образце других пигментов, например свободных порфиринов, в концентрациях до 0,1 ммоль/л.

П р и м е р 3. Экстракционный метод определения ЦПП в крови.

Образец крови (0,02-0,05 мл) экстрагируют 10-кратным количеством смеси диметилформамид/метанол (3:7 v/v), встряхивая 5 мин с последующим центрифугированием. 0,03 мл супернатанта добавляют в лунку микропланшета к 0,3 мл рабочего буфера (конечное разведение образца в 100 раз), измеряют длительную люминесценцию и рассчитывают концентрацию ЦПП аналогично вышеописанной процедуре для цельной крови.

Экстракционный метод, несмотря на большее число операций, позволяет работать с менее разбавленными образцами крови и получать при измерении люминесценции более высокие сигналы, тем самым повышается надежность получаемых результатов.

П р и м е р 4. Оптические свойства крови, разбавленной композицией буферного раствора и определение гема.

Спектр поглощения цельной крови, разбавленной в 500 раз рабочим буфером, приведен на фиг. 4 вместе со спектром поглощения ЦПП. Вид спектра свидетельствует о наличие одной, восстановленной формы гема. Это легко объяснимо восстановительным действием сульфита. Наличие одной формы гемоглобина в рабочем буфере делает исключительно простым его количественное определение методом фотометрирования с использованием стандартного раствора гема. Это может быть осуществлено непосредственно фотометрированием растворов в области поглощения гема (350-600 нм), например, с использованием иммуноферментного ридера с фильтром 405 или 420 нм. Определение гема данным методом было проведено в полистиролиных многолуночных микропланшетах (Nunc, Финляндия) в объеме 0,2 мл на фотометрическом ридере для иммуноферментного анализа фирмы Labsystems (Финляндия) при длине волны 410 нм. Рабочее разведение образца крови в буферной композиции составляло 100-1000 раз.

П р и м е р 5. Определение отношения ЦПП/гем в крови.

Измерение содержания ЦПП в крови проводят аналогично примеру 2. Затем те же лунки микропланшета фотометрируют на ридере при 410 нм. По результатам измерений поглощения, используя стандарт гемоглобина или значение молярной экстинкции (см. пример 4), определяют содержание гема. По результатам двух измерений рассчитывают отношение ЦПП/гем.

Метод был апробирован на образцах крови пациентов, связанных с работой на свинцовом производстве. Для него показана адекватность получаемых результатов и способность выявлять лиц с отклонениями показателя ЦПП и отношения ЦПП/гем от нормы (завышенные уровни).

Таким образом, новый скрининг-метод определения нарушений порфиринового обмена отличается методической простотой (только стадии разбавления образца), дешевизной (все реактивы и расходные материалы легко доступны и недороги), высокой надежностью и чувствительностью, имеет исключительно высокую производительность (сотни анализов в час) и может быть реализован на уже выпускаемом оборудовании без существенных его модификаций.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЙ ПОРФИРИНОВОГО ОБМЕНА, включающий отбор пробы биологической жидкости, ее обработку буферным раствором, содержащим лизирующий агент и восстановитель, измерение уровня люминесценции цинкпротопорфирина с последующим расчетом его содержания и сравнением со значениями нормы, отличающийся тем, что измеряют уровень длительной люминесценции цинкпротопорфирина, причем измерение проводят в условиях оптимума в импульсном режиме с миллисекундным временным разрешением, в качестве лизирующего агента используют неионогенные поверхностно-активные вещества, а в качестве восстановителя сульфит или бисульфит натрия в концентрациях, обеспечивающих соответственно дезоксигенацию раствора и образование восстановленной формы гемоглобина, а также лизис клеточных и субклеточных компонентов пробы и солюбилизацию цинкпротопорфирина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно измеряют содержание гема, регистрируя уровень поглощения, рассчитывают величину отношения цинкпротопорфирин/гем, по которой определяют наличие нарушений порфиринового обмена.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что люминесценцию измеряют при возбуждения 380 450 нм и l регистрации 550 700 нм.

4. Способ по пп.1, 2 и 3, отличающийся тем, что содержание гема и цинкпротопорфирина проводят в одной пробе.

5. Способ по пп.2 4, отличающийся тем, что поглощение гема измеряют при 380 650 нм.

6. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что перед обработкой пробы крови буферным раствором ее подвергают экстракции органическим растворителем и цинкпротопорфирин определяют в экстракте.

7. Способ по пп. 1 6, отличающийся тем, что буферный раствор содержит сульфита (или бисульфита) натрия 2 мг/мл, тритона Х-100 0,1 5,0% фосфата натрия 10 100 мн, pH 7,4.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4