Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент осахаривающей амилазы, расщепляющей пуллулан

Реферат

 

Использование: биотехнология, может быть использован в крахмалопаточной отрасли промышленности при гидролизе крахмала с целью получения кристаллической глюкозы, мальтозных паток, глюкозо-фруктовых сиропов, а также в пивоваренной и спиртовой отраслях с целью гидролиза крахмалсодержащего сырья. Сущность изобретения: штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-5166 обладает повышенной способностью гидролизовать -1,6 и a-1,4 гликозидные связи в крахмале. При культивировании штамма в глубинных условиях при аэрации в течение 72 ч проявляет активности: амилолитическая 246,0 ед/мл; пуллуланазная 1,6 ед/мл; b-глюканазная 22,0 ед/мл; протеолитическая 20,0 ед/мл. 1 табл.

Изобретение касается микробиологической отрасли промышленности, в частности производства ферментов, и представляет собой новый штамм Bacillus subtilis T-2 продуцент осахаривающей амилазы.

Полученный препарат на основе заявляемого штамма может быть использован в крахмалопаточной отрасли промышленности при гидролизе крахмала с целью получения кристаллической глюкозы, мальтозных паток, глюкозо-фруктозных сиропов, а также в пивоваренной и спиртовой отрасли с целью гидролиза крахмалсодержащего сырья.

Наиболее близким прототипом к заявленному штамму является способ получения ферментного препарата из Bacillus subtilis c -амилазной активностью, расщепляющего как -1,6-так и -1,4-гликозидные связи.

Полученный фермент с рН оптимумом 5,0-7,5 и температурным оптимумом 60-63оС способен гидролизовать крахмал с получением патоки, содержащей мальтозу и мальтотриозу в количестве (40-50)% каждый к массе крахмала.

Продуцент культивировали на среде следующего состава, соевая мука 5,0; кукурузный экстракт 0,5; мясной экстракт 0,4; K2HPO4 0,3; MgSO47H2O 0,1; крахмал растворимый 2,0; мочевина 0,5; CuSO4 510-5; MnCl2 110-4; CaCl2 110-4; ZnSO4 110-4; FeSO4 110-5, при 30оС, рН 7,0 в течение 3 дней.

В качестве посевного использовали клетки продуцента, культивируемые на агаризованной среде, следующего состава, полипептон 1,0, растворимый крахмал 1,0, K2HPO4 0,3, MgSO47H2O 0,1.

Инокулят культивировали при 30оС в течение 72 ч.

В полученной культуральной жидкости пуллуланазная активность 9,6 ед/мл, амилолитическая активность 45,2 ед/мл.

Существенный недостаток штамма прототипа: низкая амилолитическая активность; отсутствие в комплексе ферментов -глюканазы.

Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus subtilis T-2, обладающего повышенной способностью гидролизовать -1,6 и -1,4 гликозидные связи в крахмале.

Предлагаемый штамм выделен из торфяников Шатуры методом накопительной культуры, в качестве субстрата использовали 0,5% пуллулан.

Полученный штамм депонирован в ВКПМ под номером В-5166.

Культурально-морфологическая характеристика Штамм представляет собой спорообразующую палочку, образующую цепочки из подвижных палочковидных клеток по 3 в парах или одиночных размером (0,5-0,7)х(0,8-1,2) мкм. Палочки подвижны, грамположительные. Споры овальные, при спорообразовании изменения формы спорангия не происходит.

Физиолого-биохимическая характеристика.

На МПА образует колонии, бежевого цвета с ровными краями, на картофельном агаре рост обильный, пленка сухая, морщинистая толстая кремового цвета, при росте на бульоне (МПБ) образует поверхностную пленку, которая впоследствии опускается на дно.

Культура строгий аэроб, с оптимальной температурой роста 34оС-37оС и рН 5,8-6,5.

Утилизирует глюкозу с образованием кислоты без выделения газа, а также цитрат, казеин, глицерин. Утилизирует крахмал, декстрины, гликоген, амилопектин, мальтозу, мальтотриозу, пуллулан, изомальтозу, глюкозу. Ксилозу и арабинозу не утилизирует.

Нитраты не восстанавливает.

Для определения активности ферментов культуральную жидкость центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин и использовали супернатант.

Пуллуланазу определяли по восстанавливающим сахарам, образующимся при гидролизе пуллулана (линейного полисахарида, состоящего из мальтозных единиц, соединенных -1,6-гликозидными связями).

За единицу пуллуланазной активности принимается такое количество фермента, которое при стандартных условиях (температура 60оС, рН 4,7) гидролизует пуллулан со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1 молю глюкозы в минуту, определяемых методом Сомоджи-Нельсона.

Осахаривающую амилазу определяли по способности образовывать восстанавливающие сахара, образующиеся при гидролизе крахмала.

За единицу амилолитической активности принимается такое количество фермента, которое при стандартных условиях (температуре 60оС, рН 4,7) гидролизует крахмал со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1 молю глюкозы в минуту, определяемых методом Cомоджи-Нельсона.

Протеолитическую активность определяли по способности катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот. За единицу протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при рН 5,5 и температуре 30оС превращает в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой состояние казеината натрия, в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг), активность выражается в ед/г (ГОСТ 20264.2-88).

-глюканазную активность определяли по способности образовывать редуцирующие сахара из лихенина или ячменного -глюкана с последующим определением образовавшихся сахаров по методу Сомоджи-Нельсона. Биоорганическая химия, 1980, т.6, с.1225-1242.

За единицу -глюканазной активности принимали количество фермента, способного образовывать в минуту (в стандартных условиях при температуре 30оС и рН 5,5) из глюкана такое количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соответствует 1 мкмолю глюкозы.

Все опыты проводили в 3 повторностях.

П р и м е р 1. Продуцент Bacillus subtilis T-2 выращивали в аэробных условиях в колбах емкостью 0,75 дм3 при коэффициенте заполнения 0,4 в течение 72 ч при 30оС и рНнач. 7,0 на среде прототипа, имеющей состав, г/дм3: Соевая мука 50,0 Мясной экстракт 4,0 Кукурузный экстракт 5,0 K2HPO4 3,0 MgSO47H2O 1,0 Крахмал растворимый 2,0 Мочевина 5,0 CuSO4 5х10-5 MnCl2 2,5х10-6 CaCl2 1х10-4 ZnSO4 1х10-4 FeSO4 1х10-5 В качестве посевного использовали клетки продуцента, культивируемые на агаризованной среде, следующего состава, Полипептон 1,0 Растворимый крахмал 1,0 K2HPO4 0,3 MgSO47H2O 0,1 Инокулят культивировали при 30оС в течение 72 ч.

Пуллуланазная способность 0,9 ед/мл, амилолитическая способность 140 ед/мл, -глюканазная способность 15 ед/мл, протеолитическая способность 10,0 ед/мл.

П р и м е р 2. Продуцент Bacillus subtilis T-2 выращивали в аэробных условиях в колбе емкостью 0,75 дм3 при коэффициенте заполнения 0,4 в течение 72 ч при 34оС.

Посевной выращивали на агаризованной среде следующего состава, г/дм3: (NH4)2SO4 0,4 MgSO47H2O 1,0 CaCl2:2H2O 0,5 KH2PO4 6,0 Триптон 10,0 Крахмал растворимый 5,0 РН (4,5-5,0) Температура 34оС в течение 72 ч.

Состав для культивирования, г/дм3: MgSO4 1,0 KH2PO4 2,0 (NH4)2SO4 1,0 MnCl2 0,0025 CaCl2 0,4 Соевая мука 25,0 Крахмал растворимый 60,0 Кукурузный экстракт 20,0 Начальный рН среды (5,5-5,8).

Пуллуланазная способность 1,6 ед/мл, амилолитическая способность 246,0 ед/мл, -глюканазная способность 22,0 ед/мл, протеолитическая способность 20,0 ед/мл.

П р и м е р 3. Гидролиз 30% крахмала проводили с использованием фильтрата культуральной жидкости, полученной по примеру 2, при рН 4,7, температуре 60оС в течение 24 ч из расчета 0,1 ед пуллуланазы на 1 г крахмала.

Анализ продуктов гидролиза методом ТСХ показан в таблице.

Предлагаемый штамм Bacillus subtilis T-2 имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом: более высокую -амилазную активность; наличие в ферментативном комплексе термостабильной -глюканазы с рН оптимумом в кислой зоне; термостабильную нейтральную протеазу; высокий выход глюкозы (64%) и суммарный выход глюкозы и мальтозы (82%).

Эти указанные преимущества дадут возможность использовать препарат на основе этого штамма в различных областях пищевой промышленности (крахмалопаточной, пивоваренной, спиртовой).

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-5166 продуцент осахаривающей амилазы, расщепляющей пуллулан.

РИСУНКИ

Рисунок 1