Штамм вируса кори для приготовления иммунобиологических препаратов

Штамм вируса кори для приготовления иммунобиологических препаратов

Реферат

 

Использование: вирусология, производство иммунобиологических препаратов. Сущность изобретения: получен штамм вируса кори, обладающий высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностью. Штамм вируса кори выделен из фракции лимфоцитов крови больного корью в активной фазе заболевания. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 2211. Штамм может быть использован при производстве диагностических и вакцинных препаратов. 2 табл.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству иммунобиологических препаратов.

Вируссодержащая жидкость с высоким содержанием вируса является исходным материалом при производстве вакцин и получении диагностических препаратов, а также для изучения биологических свойств штаммов вируса с разной степенью аттенуации, в т.ч. вакцинных. Дальнейшая последовательная обработка вирусной жидкости зависит от требуемого конечного продукта и технологических условий. Вируссодержащая жидкость используется как составная часть диагностического или вакционного препарата; антиген для иммунизации животных при получении гипериммунных диагностических сывороток; исходный материал для получения гемагглютинирующего коревого антигена.

Согласно данным литературы для производства различных иммунобиологических препаратов и изучения биологических свойств вируса кори используют разные штаммы вируса кори штамм Эдмонстон (Enders a Peebles, 1954), штаммы Л-1, Л-2, Л-3, Л-4, Л-5 (Смородинцев А.А. Бойчук Л.М. Шикина Е.С. 1958) штаммы Л-14, Л-16 (Тарос Л.Ю. 1960), штамм вируса кори (Izbicky Alexej, авт. св. ЧССР N 185430, кл. C 12 K 7/00, 1980).

Вместе c тем инфекционная активность вируса кори на разных клеточных культурах не превышала 10^6,0 ТЦД₅₀) (Parfanofich et al, 1966, Dosser et al. 1962, Drevo et al. 1970, Kohn et al. 1962, Toyoshima et al. 1959, Bikens J. 1960, Vnolerwood, 1959, Zhelonov et al. 1959), а гемагглютинирующая активность относительно низка 1:2-1:4 (в единичных случаях 1:16) (Strauss et al. Hyg, Epid, Microb, Immunol, 9, 287, 1965; Дорофеева Н.К. Акта вирологика, 19, 497, 1975; Katz et al в книге "Лабораторные методы исследования вирусных и риккетциональных инфекций"; Zenetle et al, Praha 1974).

Так штамм Эдмонстон, выделенный в 1954 году американским исследователем Эндерсом из крови больного Эдмонстон в первичной культуре почек человека, прошел 40 пассажей в первичной культуре амниона человека, 24 пассажа в первичной культуре клеток почек человека, 14 пассажей в культуре клеток РН и 6 пассажей в перевиваемой линии клеток лейкемии человека L-41. В результате пассирования штамма Эдмонстон на различных перевиваемых культурах клеток были получены образцы вируссодержащей жидкости с гемагглютинирующей активностью 1: 2 1:16, титр инфекционности не более 10^6,0 ТЦД₅₀. В лаборатории штамм Эдмонстон прошел 12-17 пассажей на перевиваемых культурах клеток ПАО, L-41, Hep-2, Vero, при этом гемагглютинирующий титр вируссодержащей жидкости ни в одном из экспериментов не превышал 1:16, а титр инфекционности 10^5,0 ТЦД₅₀. Следует отметить, что гемагглютинирующая активность штамма Эдмонстон часто не коррелировала со значением инфекционного титра. Титр гемагглютинирующего антигена, приготовленного по методу Norrby (1962), составлял 1:32-1: 512 (титр 1:512 был достигнут только в 6 из 53 опытов). Нестандартность полученных результатов и низкий титр гемагглютинирующей активности антигена затрудняют производство коревых иммунобиологических препаратов на основе этого штамма.

Цель изобретения: штамм вируса кори, обладающий высокой гемагглютинирующей и инфекционной активностью.

Штамм вируса кори Бук депонирован в Государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН России г. Москва под N 2211.

Получение штамма. Материалом для выделения штамма вируса кори служит гепаринизированная кровь больного корью: на 5 мл крови добавляют 500 ЕД гепарина, разведенного в 1 мл физиологического раствора. Фракцию лимфоцитов получают из гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколл-верографина. При этом гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером и осторожно наслаивают на смесь, состоящую из 16 частей 9%-ного фиколла и 7 частей 36,2% -ного верографина (плотность смеси 1,077 г/мл). Образовавшийся ступенчатый градиент плотности центрифугируют при 400 g в течение 35 мин. Лимфоциты, скопившиеся в интерфазе, отсасывают и отмывают сначала фосфатным буфером, а затем средой RPM1.

Выделение вируса проводят на перевиваемой культуре клеток Vero в бессывороточной среде RPM1: в ряд пробирок с монослоем клеточной культуры наносят суспензию лимфоцитов и адсорбируют их 6 ч при 37^оС. Затем содержимое пробирок отсасывают, вносят поддерживающую среду RPM1 и инкубируют при 36^оС. Просмотр пробирок осуществляют ежедневно, смену среды в опытных и контрольных пробирках проводят через 5-6 дней.

В опытных пробирках регистрируют появление цитопатических изменений на 14 день культивирования. При их отсутствии проводят 2-3 "слепых" пассажа. Цитопатогенные изменения в культуре ткани в опытных пробирках типичны для вируса кори многоядерные синцитии (симпласты) с нуклеиновыми и протоплазматическими включениями.

Характеристика штамма. Новый штамм Бук соответствует единой структуре вируса кори (сравнение полипептидного спектра в ПААГ со шт. Эдмонстон). Его инфекционная активность легко уничтожается физическими и химическими средствами (рН, тепло, ацетон, формалин). Выделенный штамм Бук агглютинирует эритроциты обезьян и не агглютинирует эритроциты кур, морских свинок, голубей, баранов.

Типичным признаком нового штамма является активное размножение его в культуре клеток гетероплоидной линии Vero, получение вируссодержащей жидкости с титром инфекционности 10^6,5-7,0 ТЦД₅₀ и гемагглютинирующей активности 1: 128-1: 256. Определение титра инфекционности проводят методом титрования в культуре клеток Vero с десятикратным разведением вирусной суспензии на физиологическом растворе. Окончательный учет проводят на 12-14 день методом гемадсорбции с 0,05%-ной взвесью эритроцитов обезьян, что в свою очередь является характерным тестом, подтверждающим размножение вируса кори в культуре клеток. Характерным признаком нового штамма вируса кори Бук является нейтрализация его специфическими противокоревыми антителами. Реакцию нейтрализации проводят на перевиваемой линии культуры клеток Vero. В качестве антительных препаратов используют специфический противокоревой лошадиный гамма-глобулин (национальный стандарт, ГИСК им. Тарасевича), гипериммунную сыворотку к вирусу паротита и гипериммунную сыворотку к вирусу краснухи (табл. 1).

Антигенная характеристика штамма Бук. Кроликов иммунизируют двухкратно с интервалом 7 дней. Первоначально вводят вируссодержащую жидкость с адъювантом Фрейнда внутримышечно в объеме 2,0 мл, затем внутривенно в объеме 1,0 мл без адъюванта. Сыворотку получают на 7 день после 1 иммунизации и на 7, 10, 14, 21, 30 день после второй иммунизации. Содержание противокоревых антител определяют в РТГА по общепринятой методике с 4 ГАЕ коревого антигена (шт. Эдмонстон). Полученные результаты позволяют выявить динамику синтеза противокоревых антигемагглютининов на введение штамма Бук вируса кори (табл. 2).

Специфичность коревых антител подтверждают в реакции "гашения" с коревым антигеном (шт. Эдмонстон).

Культивирование штамма и получение вируссодержащей жидкости. Биологическим субстратом для размножения шт. Бук вируса кори является культура клеток гетероплоидной линии Vero, производная из почек обезьян. Для культивирования клеток используют среду RPM1 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Инкубацию клеточных культур осуществляют при 37^оС. Клеточные культуры (монослой) инфицируют инокуляцией вируса в общий объем среды не менее 0,01 ЦПД₅₀ на клетку. Инкубацию инфицированных культур проводят при 36^оС в бессывороточной среде RPM1.

Вируссодержащую среду можно получить однократно или многократно: при одноразовом получении инфицированные культуры инкубируют до отделения 70-80% клеток от стенок культивационной посуды. Перед сливанием клеточные культуры со средой подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию. Затем вируссодержащую жидкость осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, ампулируют и хранят при -70^оС. Для длительного сохранения инфекционного вируса проводят лиофилизацию с последующим хранением в холодильнике при 4^оС; многократное получение вирусной жидкости проводят заменой среды с инфицированных клеток при появлении 30-40% цитопатического эффекта каждые 24 ч. Последнюю смену осуществляют при 50%-ном поражении инфицированных культур.

Такими способами можно получить вируссодержащую жидкость с титром инфекционности не менее 10^6,5-7,0 ТЦД₅₀ и гемагглютинирующей активностью с титром не ниже 1:128-1:256. Гемагглютинирующий антиген получают по методу Norrby (1962) вируссодержащую жидкость обрабатывают твином и эфиром с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. При такой обработке гемагглютинирующая активность увеличивается по сравнению с исходной в 4-16 раз.

Формула изобретения

Штамм вируса кори ГКВ N 2211 для приготовления иммунобиологических препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1