Производные пептидов или их фармацевтически приемлемые соли

Производные пептидов или их фармацевтически приемлемые соли

Реферат

 

Использование: в биохимии и медицине в качестве ингибиторов реакции нейроксинина А. Сущность изобретения: производные пептидов ф-лы I (см.ниже), где R₁ - H, фенил (низший) алкоксикарбонил, низший алканоил, C₁₅-C₂₀- алканоил, бензоил, тиенил (низший) алканоил, фенил (низший) алкеноил, замещенный низшей алкенильной группой, фенил (низший) аланоил, замещенный низшей алкильной группой; R₂ -гидроксигруппа; R₃ - карбокси или низший алкоксикарбонил; или R₂ и R₃ соединены вместе, образуя группу ф-лы -О-С(О)-; R₄ -гидрокси, низший алканоилокси, бензилокси; R₅ гидрокси, низший алканоилокси или бензилокси; R₆ -гидрокси, низший алканоилокси или бензоилокси или низший алкокси, и одинарная или двойная связь. 4 ил. 8 табл.

Изобретение касается новых пептидных производных и их фармацевтически приемлемых солей, которые обладают фармакологической активностью.

Более конкретно оно касается новых пептидных производных и их фармацевтически приемлемых солей, которые обладают фармакологическими активностями, такими как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (вещество К) или аналогичным.

Таким образом, изобретение предусматривает пептидные производные и их фармацевтически приемлемые соли, полезные для профилактики и лечения астмы и т.д.

Пептидные производные согласно изобретению могут быть представлены следующей формулой I: CH где R₁ водород, фенил (низший)алкоксикарбонил, низший алканоил, С₁₅-С₂₀-алканоил, бензоил, тиенил (низший)алканоил, фенил(низший)алкеноил, замещенный низшей алкенильной группой, или фенил (низший)алканоил, замещенный низшей алкильной группой; R₂ гидроксигруппа; R₃ карбокси или низший алкоксикарбонил, или R₂ и R₃ соединены вместе, образуя группу формулы -O--, R₄ гидрокси-, низший алканоилокси или бензилокси; R₅ гидрокси-, низший алканоилокси или бензилокси; R₆ гидрокси-, низший алканоилокси, бензилокси или низший алкокси, и представляет одинарную или двойную связь.

где R₁ низшая алкоксигруппа.

Исходные соединения II и III являются новыми и могут быть получены следующими способами.

Способы получения целевых и исходных соединений согласно изобретению поясняются следующим образом.

Процесс 1 (способ 1). Соединение Ia или его соль можно получить, если подвергнуть соединение II или его соль реакции циклизации. Эту реакцию проводят традиционным методом синтеза циклических пептидов, таким как метод с использованием смешанных ангидридов кислот, активированных сложных эфиров, карбодиимидный метод или тому подобные. Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как спирт, тетрагидрофуран, этилацетат, N,N-диметилформамид, дихлорметан, хлороформ или любой другой растворитель, который не оказывает отрицательного влияния на течение реакции. Температура реакции не является критической, и реакцию обычно проводят при охлаждении и до нагревания.

Способ 2. Соединение Ia или его соль можно получить, подвергая соединение III или его соль реакции циклизации. Эту реакцию проводят традиционным методом синтеза циклических пептидов, таким как метод с использованием смешанных ангидридов кислот, активированных сложных эфиров, карбодиимидный метод и тому подобные. Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как спирт, тетрагидрофуран, этилацетат, N,N-диметилформамид, дихлорметан, хлороформ или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию. Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до нагревания.

Способ 3. Соединение Ic или его соль можно получить, подвергая соединение Ib или его соль реакции деацилирования. Подходящий метод такой реакции может включать обычный метод, такой как гидролиз, восстановление и тому подобные.

i) Гидролиз.

Гидролиз предпочтительно проводят в присутствии основания или кислоты, включая кислоту Льюиса. Подходящее основание может включать неорганическое основание и органическое основание, такое как гидроокись, или карбонат, или бикарбонат щелочного металла (натрия, калия и так далее), щелочноземельного металла (т. е. магния, кальция, и так далее), триалкиламин (т,е, триметиламин, триэтиламин и так далее), пиколин, 1,5-диазабицикло(4.3.0)-оно- 5-ен, 1,4-диазабицикло(2,2,2)-октан, 1,8-диазабицикло-(5.4.0)-ундец-7-ен или тому подобные.

Подходящая кислота может включать органическую кислоту (т.е. муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, трихлоруксусную кислоту, трифторуксусную кислоту и так далее) и неорганическую кислоту (т.е. хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, хлористый водород, бромистый водород и так далее). Отщепление с использованием кислоты Льюиса, такой как тригалоидуксусная кислота (т.е. трихлоуксусная кислота, трифторуксусная кислота и так далее) или тому подобной предпочтительно проводят в присутствии улавливающих катионы агентов (т.е. анизол, фенол и так далее).

Реакцию обычно проводят в растворителе, таком как вода, спирт (т.е. метанол, этанол и так далее), хлористый метилен, тетрагидрофуран, их смесь или любой другой растворитель, который не оказывает вредного воздействия на реакцию. Жидкое основание или кислота может быть также использовано в качестве растворителя. Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до нагревания.

i) Восстановление.

Восстановление проводят традиционным методом, включающим химическое восстановление и каталитическое восстановление. Подходящими катализаторами для использования при химическом восстановлении являются сочетание металла (т.е. цинка, железа и так далее) или металлического соединения (т.е. хлорида хрома, ацетата хрома и так далее) и органической или неорганической кислоты (т. е. муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, трифторуксусной кислоты, пара-толуолсульфокислоты, хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты и так далее).

Подходящими катализаторами, используемыми при каталитическом восстановлении, являются традиционные катализаторы, такие как платиновые катализаторы (т. е. платиновая пластинка, губчатая платина, платиновая чернь, коллоидная платина, окись платины, платиновая проволока и так далее), палладиевые катализаторы (т.е. губчатый палладий, палладиевая чернь, окись палладия, палладий на угле, коллоидный палладий, палладий на сульфате бария, палладий на карбонате бария и так далее), никелевые катализаторы (т.е. измельченный никель, окись никеля, никель Ренея и так далее), кобальтовые катализаторы (т.е. измельченный кобальт, кобальт Ренея и так далее), железные катализаторы (т. е. измельченное железо, железо Ренея и так далее), медные катализаторы (т.е. измельченная медь, медь Ренея, медь Ульмана и так далее) и тому подобные. Восстановление обычно проводят в традиционном растворителе, который не влияет отрицательно на реакцию, таком как вода, метанол, этанол, пропанол, N, N-диметилформамид, тетрагидрофуран или их смесь. В дополнение в случае использования упомянутой выше кислоты в жидком виде, применяемой при химическом восстановлении, она может быть также использована в качестве растворителя.

Температура реакции этого метода восстановления не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до нагревания.

Способ 4. Соединение Ib или его соль можно получить, подвергая реакции ацилирования соединение Ic или его реакционноспособное производное при аминогруппе или его соль. Подходящее реакционноспособное производное при аминогруппе соединения Ic может включать основание Шиффа иминного типа или его таутомерный изомер енаминового типа, полученное при реакции соединения Ic с карбонильным соединением, таким как альдегид, кетон и тому подобное; силильное производное, полученное взаимодействием соединения Ic с силильным соединением, таким как бис-(триметилсилил)-ацетамид, моно-(триметилсилил)-ацетамид, бис-(триметилсилил)-мочевина или тому подобными; производное, образованное при взаимодействии соединения Ic с треххлористым фосфором или фосгеном и тому подобными.

Подходящее ацилирующее средство, используемое в настоящей реакции ацилирования, может включать традиционное ацилирующее средство и может быть выражено формулой R_a¹-OH (XIV) (где R_a¹ имеет значение, определенное ранее) или его реакционноспособным производным или его солью.

Подходящее реакционноспособное производное соединения формулы XIV может включать галоидангидрид, ангидрид кислоты, активированный амид, активированный сложный эфир и тому подобное. Подходящим примером может быть хлорангидрид; азид кислоты, смешанный ангидрид кислоты с кислотой, такой как замещенная фосфорная кислота (т.е. диалкилфосфорная кислота, фенилфосфорная кислота, дифенилфосфорная кислота, дибензилфосфорная кислота, галогенизированная фосфорная кислота и так далее), диалкилфосфористая кислота, сернистая кислота, тиосерная кислота, сульфокислота (т.е. метансульфокислота, и так далее), алкилуглекислота, алифатическая карбоновая кислота (т.е. пивалиновая кислота, валериановая кислота, изовалериановая кислота, 2-этилмасляная кислота или трихлоруксусная кислота и так далее) или ароматическая карбоновая кислота (т.е. бензойная кислота и так далее); симметрический ангидрид кислоты, активированный амид с имидазолом, 4-замещенный имидазол, диметилпиразол, триазол или тетразол; или активированный сложный эфир (т.е. цианометиловый сложный эфир, метоксиметиловый эфир, диметилиминометиловый эфир ((CH₃)₂N⁺= CH^-), виниловый эфир, пропаргиловый эфир, паранитрофениловый эфир, 2,4-динитрофениловый эфир, трихлорфениловый эфир, пентахлорфениловый эфир, метилсульфонилфениловый эфир, фенилазофениловый эфир, фениловый тиоэфир, паранитрофениловый тиоэфир, паракрезиловый тиоэфир, карбоксиметиловый тиоэфир, пираниловый эфир, пиридиловый эфир, пиперидиловый эфир, 8-хинолиловый тиоэфир, и так далее) или сложный эфир с N-гидроксисоединением (т.е. N,N-диметилгидроксиламин, 1-гидрокси-2-(1Н)-пиридон, N-гидроксисукцини- мид, N-гидроксифталимид, 1-гидрокси-6-хлор-1Н-бензотиазол и так далее) и тому подобные. Эти реакционноспособные произ- водные могут быть необязательно выбраны из них в соответствии с видом используемого соединения формулы XIV.

Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как спирт (т. е. метанол, этанол и так далее), ацетон, диоксан, ацетонитрил, хлористый метилен, тетрагидрофуран, N,N-диметилформамид, пиридин или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию. Этот традиционный растворитель может быть также использован в смеси с водой.

Если соединение XIV используют в форме свободной кислоты или в форме ее соли в этой реакции, то реакцию предпочтительно проводят в присутствии традиционного конденсирующего средства, такого как N,N'-дициклогексилкарбодиимид, N-циклогексил- N'-морфолиноэтилкарбодиимид, N-циклогексил-N'-(4- диэтиламиноциклогексил)-карбодиимид, N,N'-диэтилкарбодиимид, N,N'-диизо- пропилкарбодиимид, N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)- карбодиимид, N,N-карбонилбис-(2-метилимидазол), пентаметилен- кетен-N-циклогексиламин, дифенилкетен-N- циклогексилимин, этоксиацетилен, 1-алкокси-1-хлорэтилен, триалкилфосфит, этил- полифосфат, изопропиловый эфир полифосфорной кислоты, оксихлорид фосфора (хлористый фосфорил), треххлористый фосфор, хлористый оксалил, трифенилфосфин, хлористый тионил, соль 2-этил-7-оксибензизоксазолия, гидроокись 2-этил-5-(мета-сульфофенил)- изоксазолия, внутримолекулярная соль, 1-(парахлорбензолсульфонилокси)-6-лхлор-1Н-бен- зотриазол, так называемый реактив Вильсмайера, полученный взаимодействием N,N-диметилформамида с хлористым тионилом, фосгеном, трихлорметиловым эфиром хлормуравьиной кислоты, оксихлоридом фосфора и так далее.

Реакция может быть также проведена в присутствии неорганического или органического основания, такого как бикарбонат щелочного металла, три(низший)алкиламин, пиридин, N-(низший) алкилморфолин, N,N-ди(низший)алкилбензиламин или тому подобного. Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до комнатной температуры.

Способ 5. Соединение Ie или его соль можно получить, подвергая соединение Id или его соль реакции ацилирования. На эту реакцию имеется ссылка в примерах 2, 4, 5, 7, 8, 17 и 18, описанных ниже.

Способ 6. Соединение If или его соль можно получить, подвергая гидролизу соединение Ia или его соль. Эту реакцию гидролиза можно провести со ссылкой на указанный выше способ 3.

Способ 7. Соединение Ig или его соль можно получить, подвергая соединение If или его соль реакции этерификации. Этерифицирующее средство, используемое в этой реакции, может включать одно из традиционных средств, такое как спирт или его реакционноспособный эквивалент (т.е. галогенид, сульфонат, сульфат, диазосоединение и так далее) или тому подобное.

Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как ацетон, диоксан, спирт, хлористый метилен, хлористый этилен, н-гексан, тетрагидрофуран, этилацетат, N,N-диметилформамид или любой другой растворитель, который не оказывает отрицательного воздействия на реакцию. Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до нагревания.

Способ 8. Соединение Ii или его соль можно получить, подвергая восстановлению соединение Ih или его соль. Подходящими катализаторами, используемыми при каталитическом восстановлении, являются традиционные восстановители, такие как платиновые катализаторы (т.е. платиновая пластинка, губчатая платина, платиновая чернь, коллоидная платина, окись платины, платиновая проволока и так далее), палладиевые катализаторы (т.е. губчатый палладий, палладиевая чернь, окись палладия, палладий на угле, коллоидный палладий, палладий на сульфате бария, палладий на карбонате бария и так далее), никелевые катализаторы (т. е. измельченный никель, окись никеля, никель Ренея и так далее), кобальтовые катализаторы (т.е. измельченный кобальт, кобальт Ренея и так далее), железные катализаторы (т.е. измельченное железо, железо Ренея и так далее), медные катализаторы (т.е. измельченная медь, медь Ренея, медь Ульмана, и так далее) и тому подобные.

Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как ацетон, диоксан, спирт, тетрагидрофуран, этилацетат, диметилформамид, диметилсульфоксид или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию. Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до нагревания.

Способ 9. Соединение Ij или его соль можно получить, подвергая реакции алкилирования соединение Id или его соль. Эта реакция описана ниже со ссылкой на пример 19.

Способ А. Соединение II или его соль можно получить взаимодействием соединения IV или его соли согласно схеме реакции, показанной в способе А. Каждая реакция в этой схеме может быть проведена традиционным методом, принятым в синтезе пептидов. Исходное соединение IV или его соль можно получить методами, описанными ниже.

Способ В. Соединение III или его соль можно получить реакцией соединения IX или его соли по схеме реакции, показанной в способе В. Каждая реакция в этой схеме может быть проведена традиционным методом для пептидного синтеза. Исходное соединение IX или его соль можно получить методами, описанными ниже.

Получение ферментацией.

WS-9326В и WS-9326А согласно изобретению можно получить ферментацией WS-9326А и/или WS-9326В продуцирующих штаммов, принадлежащих к роду Streptomyces, такому как Streptomyces Violaceoniger N 9326 в питательной среде. Специфические микроорганизмы, использованные для получения WS-9326А и WS-9326В, будут описаны ниже.

Микроорганизмы.

Микроорганизм, который может быть использован для продуцирования WS-9326А и WS-9326В, является штаммом-продуцентом WS-9326А и/или WS-9326В, принадлежащим к роду Streptomyces, из которого Streptomyces violaceoniger N 9326 недавно был выделен из образца почвы, взятого в городе Суа префектура Нагано, Япония.

Лиофилизированный образец вновь выделенного Streptomyces violaceoniger N 9326 депонирован в научно-исследовательском институте агентства промышленных знаний и технологии (1-3, Higashi-1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan) под номером FEPM BP-1667 (дата депонирования 20 января 1988 года).

Понятно, что продуцирование новых WS-9326А и WS-9326В не ограничивается описываемым здесь конкретным организмом, который приведен лишь в целях иллюстрации. Это изобретение включает также использование любых мутантов, которые способны продуцировать WS-9326А и WS-9326В, включая природные мутанты, а также искусственные мутанты, которые могут быть получены от описанного здесь организма традиционными средствами, такими как облучение рентгеновскими лучами, ультрафиолетовым излучением, обработка N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином, 2-аминопурином и тому подобными. Streptomyces violaceoniger N 9326 имеет следующие морфологические, культуральные, биологические и физиологические характеристики.

Морфологические характеристики.

Были использованы методы, описанные Ширлингом и Готлибом (Shirling, E.B. and D.Sottlieb, Методы для характеристики видов Streptomyces, International Journal of Systematic Bacteriology, 16, 313-340, 1966) для этого таксономического исследования. Морфологические наблюдения были выполнены на оптическом и электронном микроскопах на культуре, выращенной при 30^оС в течение 14 дней на агаре с дрожжево-солодовым экстрактом, на агаре из овсяной муки на агаре из крахмала и неорганических солей.

Вегетативный мицелий развит хорошо без фрагментации. Воздушный мицелий разветвлен монополиально и образует спиральные цепи спор с 10-30 спорами на цепь. Споры имеют гладкую поверхность и овальную форму с размерами 0,6-0,8 х 0,8-1,3 мкм. Отвердевших гранул, спорангия и зооспор не наблюдали.

Культуральные характеристики.

Культуральные характеристики наблюдали на десяти видах сред, описанных Ширлингом и Готлибом в указанном выше источнике и Ваксманом (Waksman, S.A. Actinomycetes, vol.2; Classification, identification and description of genera and species. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, 1961). Выращивание проводили при 30^оС в течение 21 дня. Название цвета, использованные в этом исследовании, взяты из колориметрического руководства Метуэна (kornerup, A. and J.H.Wanscher: Handbook of Colour, Methuen, London, 1978).

Культуральные характеристики штамма 9326 приведены ниже.

Даны следующие сокращения: G рост, А воздушный мицелий, R цвет обратной стороны, S растворимый пигмент.

Среда Культуральные характеристики л Агар из овсяной муки - зиновый тельный Агар Беннета Воздушный мицелий имел окраску от серого до коричневато-серого цвета. Часть колонии становилась черной и влажной и показывала гигроскопические свойства на большинстве агаровых сред. Обратная сторона культуры была желтовато-коричневая, коричневая и темно-коричневая. Пигмент мицелия обратной стороны не чувствителен к рН среды. Меланоидные пигменты и другие растворимые пигменты не продуцирует.

Анализ клеточных стенок был выполнен по методам Беккера и соавторов (Becker B. M.P.Lechevalier, R.E.Jordon and H.A.Lechevalier "Быстрая дифференциация между Nocardia и Streptomyces хроматографией на бумаге цельного клеточного гидролизата". Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964) и Ямагуши (Jamagushi, T. "Сравнение состава клеточных мембран морфологически различных актиномицетов. J. Bacteriol. 89, 444-453, 1965). Анализ цельных клеточных гидролизатов штамма N 9326 показал присутствие LL-диаминопимелиновой кислоты. Следовательно, клеточная стенка этого штамма, по-видимому, типа I.

Биологические и физиологические свойства.

Физиологические свойства и усвоение источников углерода показаны ниже.

Использование источников углерода определяли методами Придхема и Готлиба (Pridham T.J. and D.Gottlieb "Использование углеродных соединений некоторыми актиномицетами, как вспомогательное средство определения видов". J.Bacteroil. 56, 107-114, 1948).

Физиологические свойства штамма N 9326 Условия Характеристики Температурный интервал для роста 11 47^оС Оптимальный интервал температур для роста 29 31^оС Разжижение желатина Положительно Свертывание молока Отрицательно Пептонизация молока Положительно Гидролиз крахмала Положительно Продуцирование меланоидного пигмента Отрицательно Разложение целлюлозы Отрицательно Усвоение углерода штаммом N 9326 (+ означает усвоение).

Соединение Рост D-глюкоза + Сахароза + D-ксилоза + D-фруктоза + L-рамноза + Рафиноза + L-арбиноза + Инозит + Маннит + Морфология и химические характеристики штамма N 9326 позволяют четкое отнесение организма к роду Streptomyces.

Было установлено, что штамм N 9326 имеет близкое сходство со Streptomyces violaceoniger. Поэтому штамм N 9326 был идентифицирован как Streptomyces violaceoniger и назван Streptomyces violaceoniger N 9326.

Получение WS-9326А и WS-9326В.

Новые WS-9326А и WS-9326В согласно изобретению могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS-9326А и/или WS-9326В, принадлежащего к роду Streptomyces (т.е. Streptomyces violaceoniger N 9326, FEPM ВР-1667) в питательной среде. В общем WS-9326А и WS-9326В могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS-9326А и/или WS-9326В в водной питательной среде, содержащей источник усваиваемого углерода и азота, предпочтительно в аэробных условиях (т.е. встряхиваемая культура, погруженная культура и так далее).

Предпочтительными источниками углерода в питательной среде являются углеводы, такие как глюкоза, ксилоза, галактоза, глицерин, крахмал, декстрин и тому подобные. Другими источниками, которые могут быть использованы, являются мальтоза, рамноза, рафиноза, арабиноза, манноза, салицин, сукцинат натрия и тому подобные. Предпочтительными источниками азота являются дрожжевой экстракт, пептон, клейковина, хлопковая мука, соевая мука, экстракт от замачивания кукурузы, пшеничные проростки, высушенные дрожжи, молотое перо, порошок земляного ореха и так далее, а также неорганические и органические соединения азота, такие как соли аммония (т.е. нитрат аммония, сульфат аммония, фосфат аммония и так далее), мочевина, аминокислоты и тому подобные.

Источники углерода и азота, хотя и преимущественно используемые в сочетании, не обязательно используются в чистой форме, поскольку менее чистые материалы, которые содержат следы ростовых факторов и значительные количества минеральных питательных веществ, также пригодны для использования. Если желают, то они могут быть добавлены к минеральным солям среды, таким как карбонат натрия или кальция, фосфат натрия или калия, хлористый натрий или калий, иодистый натрий или калий, соли магния, соли меди, соли кобальта и тому подобные. Если необходимо, особенно когда культуральная среда сильно вспенивается, то могут быть добавлены антивспениватели, такие как жидкий парафин, жировое масло, растительное масло, минеральное масло или силикон.

Как условия для получения WS-9326А и WS-9326В в больших количествах предпочтительны аэробные условия погруженной культуры. Для получения небольших количеств используют встряхиваемые или поверхностные культуры в колбах или бутылях. Кроме того, если выращивание проводят в больших резервуарах, то предпочтительно использование вегетативной формы организма для инокулирования в ферментационные емкости, чтобы избежать латентный период развития культуры в процессе получения WS-9326А и WS-9326В. Таким образом, желательно сначала получить посевную культуру организма инокулированием относительно малого количества культуральной среды спорами или мицеллами микроорганизма и выращиванием этой инокулированной среды и затем перенести выращенный вегетативный инокулят в асептических условиях в большие резервуары. Среда, в которой получен вегетативный инокулят, является аналогичной или отличается от среды, используемой для получения WS-9326А и WS-9326В.

Перемешивание и аэрация культуральной смеси могут быть осуществлены различными путями. Перемешивание может быть проведено лопастями винта или аналогичными механическими мешалками, вращением или встряхиванием бродильного чана, различными нагнетающими устройствами или пропусканием стерильного воздуха через среду. Аэрация может быть осуществлена путем пропускания стерильного воздуха через ферментационную среду.

Брожение обычно проводят при температуре 20-40^оС, предпочтительно при 25-35^оС, в течение примерно 50-150 ч, которые могут варьировать в соответствии с условиями брожения и масштабами производства. Полученные WS-9326А и WS-9326В могут быть затем выделены из культуральной среды традиционными средствами, которые обычно используются для выделения других известных биологически активных веществ. Полученные WS-9326А и WS-9326В были найдены в культуральном фильтрате и мицелии, и таким образом WS-9326А и WS-9326В могут быть выделены и очищены из фильтрата и мицелия, которые получены при фильтрации или центрифугировании культуральной жидкости традиционным методом, таким как концентрирование при пониженном давлении, лиофилизация, экстракция традиционным растворителем, регулирование рН, обработка обычной смолой (т.е. анионо- или катионообменная смола, неионогенная абсорбирующая смола и так далее), обработка традиционным абсорбентом (т.е. активированным углем, кремневой кислотой, силикагельцеллюлозой, глиноземом и тому подобными), кристаллизация, перекристаллизация и тому подобные.

WS-9326А, полученный описанным выше способом, обладает следующими физическими и химическими свойствами.

Форма и цвет: бесцветный порошок.

Цветная реакция: положительная на сульфат церия, реакция на пары иода, реакция на хлористое железо (3) железо (3) цианистый калий; отрицательная реакция на нингидрин, реакция Молиша, реакция на хлористое железо (3), реакция Эрлиха, реакция Паули.

Растворимость: растворим метанол, этанол; слабо растворим ацетон, этилацетат; нерастворим вода, хлороформ.

Точка плавления 187-190^оС.

Удельное вращение: ()_D²³ -84^o (С 1,0, метанол).

Спектр ультрафиолетового поглощения (метанол): _макс= 280 нм (= 34,700).

Спектр поглощения инфракрасного излучения: (KBr) _макс= 3300, 3050, 2950, 2920, 2860, 1730, 1650, 1610, 1560, 1540, 1530, 1510, 1440, 1380, 1340, 1280, 1240, 1170, 1110, 1080, 1060, 1040, 970, 880, 860, 830 см^-1.

Вычислено, C 60,43; H 6,76; N 10,44 C₅₄H₆₈N₈O₁₃ 2H₂O Найдено, C 60,18; H 6,61; N 10,32 Данные тонкослойной хроматографии приведены в табл.1.

Молекулярная формула C₅₄H₆₈N₈O₁₃.

Молекулярная масса (FAB-масс-спектр) m/z 1037 (М+Н)⁺.

Свойства вещества: кислое вещество.

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С: (100 МГц, СD₃ОD), : 175,69 (с), 174,70 (с), 173,73 (с), 173,38 (с), 172,89 (с), 171,04 (с), 170,45 (с), 167,79 (с), 167,15 (с), 159,20 (с), 140,05 (д), 139,12 (с), 138,71 (с), 135,27 (д), 135,85 (с), 132,11 (д), 132,03 (с), 131,69 (д)х2, 130,70 (д), 129,90 (д), 130,70 (д), 129,90 (д), 129,61 (д)х2, 128,55 (д), 128,04 (д), 129,99 (д), 127,38 (д), 126,09 (с), 123,70 (д), 115,63 (д), 73,46 (д), 71,34 (д), 62,80 (т), 59,53 (д), 56,91 (д), 56,76 (д), 55,55 (д), 53,64 (д), 52,10 (д), 39,85 (т), 37,18 (т), 37,09 (т), 34,58 (кв), 31,37 (т), 24,56 (д), 23,63 (т), 22,71 (кв), 22,52 (кв), 21,17 (кв), 17,19 (кв), 14,13 (кв).

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н, (400 МГц, СД₃ОД) : 7,80 (1Н, д, I 8 Гц), 7,67 (1Н, д, I 16 Гц), 7,45-7,14 (9Н, м), 7,06 (2Н, д, I 8 Гц), 6,83 (1Н, с), 6,65 (2Н, д, I 8 Гц), 6,59 (1Н, д, I 12 Гц), 5,88 (1Н, дт, I 12 и 7 Гц), 5,55 (1Н, м), 5,35 (1Н, широкий сигнал), 5,10 (1Н, дд, I 3 и 9,5 Гц), 4,68 (1Н, д, I 10 Гц), 4,55 (1Н, т, I 6 Гц), 4,48 (1Н, дд, I 3 и 12 Гц), 3,92 (2Н, д, I 6 Гц), 3,70 (1Н, т, I 7,5 Гц), 3,62 (1Н, м), 3,46 (1Н, дд, I 3 и 14 Гц), 2,94 (1Н, дд, I 3 и 16 Гц), 2,89 (3Н, с), 2,74 (1Н, дд, I 9,5 и 16 Гц), 2,69 (1Н, дд, I 12 и 14 Гц), 2,14 (2Н, м), 1,5-1,4 (2Н, м), 1,20 (3Н, д, I 6 Гц), 1,08 (3Н, д, I 6 Гц), 1,0-0,8 (2Н, м), 0,91 (3Н, т, I 7 Гц), 0,6 (1Н, м), 0,53 (3Н, д, I 6 Гц), 0,51 (3Н, д, I 6 Гц).

Аминокислотный анализ.

WS-9326 (5 мг) гидролизовали при 110^оС в течение 20 ч с хлористоводородной кислотой (2 мл) в запаянной пробирке. Смесь выпаривали досуха и получали продукты гидролиза, которые затем анализировали на автоматическом анализаторе аминокислот Хиташи 835.

Результаты аминокислотного анализа. Треонин (2), лейцин (1), фенилаланин (1), аспарагиновая кислота (1), серин (1), метиламин (1) и аммиак (1).

Что касается WS-9326А, то следует заметить, что спектры ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С и ¹Н, показали, что WS-9326А существует по меньшей мере в двух стабильных конформациях в растворе СД3ОД, и химические сдвиги являются сдвигами основного конформера WS-9326А. WS-9326В, полученный в соответствии с описанным выше способом, обладает следующими физическими и химическими свойствами.

Форма и цвет: бесцветный аморфный порошок Цветная реакция: положительная реакция на сульфат церия, реакция на пары иода; отрицательная реакция на нингидрин.

Растворимость: растворим в метаноле, слабо растворим в этаноле и не растворим в воде, ацетоне, этилацетате и хлороформе.

Точка плавления 165-170^оС (разлагается).

Удельное вращение: ()_D²³ -64^о (С 1,0, метанол) Спектр ультрафиолетового поглощения (метанол): _макс= 283 нм (= 27000).

Молекулярная формула C₅₄H₇₀N₈O₁₃ Вычислено, C 60,32; H 6,94; N 10,42 C₅₄H₇₀N₈O₁₃ 2H₂O Найдено, C 59,97; H 6,87; N 10,29 Молекулярная масса (FAB-масс-спектр) m/z 1061,6 (М + а)⁺.

Данные тонкослойной хроматографии приведены в табл.2.

Спектр инфракрасного поглощения (KBr): _макс 3300, 3050, 2950, 1735, 1660, 1530, 1510, 1450, 1400, 1380, 1340, 1260, 1220, 1080, 980, 920 см^-1.

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С (100 МГц, СD₃ОD) : 174,99 (с), 174,54 (с), 173,60 (с), 173,41 (с), 173,30 (с), 171,27 (с), 170,74 (с), 168,69 (с), 157,59 (с), 140,53 (д), 139,35 (с), 139,18 (с), 135,76 (д), 134,17 (с), 131,15 (д)х2, 130,93 (д), 130,35 (д), 130,93 (л), 130,35 (д), 129,88 (д)х2, 129,39 (д)х2, 128,70 (д), 129,58 (с), 128,13 (д), 127,64 (д), 127,53 (д), 121,99 (д), 116,45 (д)х2, 72,76 (д), 70,82 (д), 62,73 (т), 62,67 (д), 56,33 (д)х2, 56,19 (д), 53,36 (д), 52,24 (д), 40,24 (т), 37,55 (т), 37,08 (т), 33,69 (т), 31,57 (т), 29,93 (кв), 24,61 (д), 23,70 (кв), 23,59 (т), 22,16 (кв), 21,36 (кв), 17,12 (кв), 14,23 (кв).

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н (400 МГц, СD₃ОD) : 7,86 (1Н, д, I 16 Гц), 7,80 (1Н, широкий, д, I 8 Гц), 7,12-7,42 (11Н, м), 6,77 (2Н, д, I 8,5 Гц), 6,61 (1Н, д, I 11,5 Гц), 5,88 (1Н, дт, I 7,5 и 11,5 Гц), 5,08 (1Н, дд, I 3,5 и 10 Гц), 5,04 (1Н, кв, I 6,5 Гц), 4,66 (1Н, дд, I 3,5 и 13 Гц), 4,65 (1Н, д, I 11 Гц), 4,56 (1Н, дд, I 2,5 и 7 Гц), 4,48 (1Н, дд, I 4,5 и 11 Гц), 4,46 (1Н, с), 3,88 (2Н, м), 3,64 (2Н, м), 3,51 (1Н, дд, I 3,5 и 14 Гц), 3,17 (1Н, дд, I 4,5 и 14 Гц), 3,01 (1Н, дд, I 11 и 14 Гц), 2,94 (1Н, дд, I 3,5 и 16 Гц), 2,71 (3Н, с), 2,71 (1Н, дд, I 10 и 16 Гц), 2,64 (1Н, дд, I 13 и 14 Гц), 2,04 (2Н, м), 1,43 (2Н, м), 1,28 (2Н, м), 1,20 (3Н, д, I 6 Гц), 0,95 (3Н, д, I 6,5 Гц), 0,87 (3Н, т, I 7,5 Гц), 0,53 (1Н, м), 0,52 (6Н, д, I 10,5 Гц).

Что касается WS-9326В, то следует заметить, что спектры ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С и ¹Н, показывают, что WS-9326В существует по меньшей мере в двух стабильных конформациях в растворе СD₃ОD и химические сдвиги являются сдвигами основного конформера WS-9326В.

Из анализа представленных выше физических и химических свойств и по результатам дальнейших исследований по идентификации химической структуры химическое строение WS-9326А и WS-9326В идентифицировано и интерпретировано следующим образом: WS-9326A R- где R /(E)-3-/2-((Z)-1-пентенил)-фенил/- пропеноил/ WS-9326B R- R (E)-3-/2-((Z)-1-пентенил)-фенил/-пропеноил Подходящие фармацевтически приемлемые соли целевого соединения I являются традиционными нетоксичными солями и могут включать соль с основанием или кислотно-аддитивную соль, такую как соль с неорганичвеским основанием, например соль щелочного металла (т.е. соль лития, соль натрия, соль калия и так далее), соль щелочноземельного металла (т.е. соль кальция, соль магния и так далее), соль аммония; соль с органическим основанием, например, соль органического амина (т.е. соль триэтиламина, соль пиридина, соль николина, соль этаноламина, соль триэтаноламина, соль дициклогексиламина соль N,N'-дибензилэтилендиамина и так далее) и тому подобные; аддитивная соль неорганической кислоты (т. е. гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат, и так далее); аддитивная соль органической карбоновой или сульфокислоты (т.е. формиат, ацетат, трифторацетат, малеат, тартрат, метансульфонат, бензолсульфонат, паратолуолсульфонат и так далее); соль с основной или кислой аминокислотой (т.е. аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и так далее) и тому подобные. Подходящие соли соединений (Ia-Ij), II и III могут быть названы соли, приведенные в качестве примера для соединения I.

Термин "низший" означает от 1 до 6 углеродных атомов, если не оговорено особо. Термин "высший" означает от 7 до 20 углеродных атомов, если не указано специально. Подходящий "ацил" или ацильная часть молекулы в термине "ацилокси"может включать карбамоил, алифатическую ацильную группу и ацильную группу, соедржащую ароматическое кольцо, которое относится к ароматическому ацилу, или гетероциклическое кольцо, которое относится к гетероциклическому ацилу. Подходящий пример упомянутого ацила может быть проиллюстрирован следующим образом.

Алифатический ацил, такой как низший или высший алканоил (т.е. формил, ацетил, пропаноил, бутаноил, 2-метилпропаноил, пентаноил, 2,2-диметилпропаноил, гексаноил, гептаноил, октаноил, наноил, деканоил, ундеканоил, додеканоил, тридеканоил, тетрадеканоил, пентадеканоил, гексадеканоил, гептадеканоил, октадеканоил, нонадеканоил, икозаноил и так далее); низший или высший алкоксисульфонил (т. е. метоксисульфонил, этоксисульфонил и так далее) или тому подобные.

Ароматический ацил, такой как ароил (т.е. бензоил, толуоил, нафтоил и так далее); ар (низший)алканоил, т.е. фенил (низший) алканоил (т.е. фенилацетил, фенилпропаноил, фенилбутаноил, фенилизобутаноил, фенилпентаноил, фенилгексаноил и так далее), нафтил (низший) алканоил (т.е. нафтилацетил, нафтилпропаноил, нафтилбутаноил и так далее) и тому подобные; ар(низший)алкеноил, т. е. фенил(низший)алкеноил, (т.е. фенилпропеноил, фенилбутеноил, фенилметакрилоил, фенилпентеноил, фенилгексеноил и так далее), нафтил(низший) алкеноил (т.е. нафтилпропеноил, нафтилбутеноил, нафтилпентеноил и так далее) и тому подобные; ар(низший) алкоксикарбонил, т.е. фенил(низший)алкоксикарбонил (т. е. бензилоксикарбонил, и так далее) и тому подобные арилоксикарбонил (т. е. феноксикарбонил, нафтилоксикарбонил и так далее); арил окси(низший)алканоил (т. е. феноксиацетил, феноксипропионил, и так далее); арилглиоксилои