Способ получения активатора плазминогена тканевого типа, штамм культивируемых клеток животных сно-продуцент активатора плазминогена тканевого типа

Способ получения активатора плазминогена тканевого типа, штамм культивируемых клеток животных сно-продуцент активатора плазминогена тканевого типа

Реферат

 

Использование: изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу получения активатора плазминогена тканевого типа с использованием штаммов культивируемых клеток животных. Сущность изобретения: способ получения активатора плазминогена тканевого типа предусматривает культивирование штамма CHO KI АТСС NCCL61, трансформированного рекомбинантной плазмидой ДНК PETPER, выращивание трансформантов в присутствии конкурентного ингибитора активности DHFR в концентрации 20-500 000 нм, выделение и очистку целевого продукта. 2 с. п. ф-лы, 4 ил. 3 табл.

Изобретение относится к способу получения человеческого активатора плазминогена тканевого типа, соответствующему тому, что находят в человеческой сыворотке и/или тканях, в терапевтически достаточных количествах.

Предпосылками изобретения являлось то, что были определены последовательность ДНК и укороченная аминокислотная последовательность человеческого активатора плазминогена. Это позволило получить человеческий активатор плазминогена с применением технологии рекомбинантной ДНК, что в свою очередь обеспечило возможность получения качественного материала в достаточном количестве и дало начало проведению испытаний на животных и клинических испытаний как предпосылку выпуска в продажу данного препарата.

Фибринолитическая система находится в динамическом равновесии с системой коагуляции, поддерживая интактный, открытый вазикулярный слой. Система коагуляции откладывает фибрин как матрицу, служащую для восстановления гемостатического условия. Фибринолитическая система удаляет фибриновую сетку после достижения гемостатического условия. Фибринолитический процесс вызывается протеолитическим ферментом плазмином, который генерирует из плазмы протеиновый предшественник плазминогена. Плазминоген превращается в плазмин при активации активатором.

В настоящее время коммерчески доступны два активатора: стрептокиназа и урокиназа. Оба используются для лечения острых сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда, паралич, легочная эмболия, глубокий тромбоз вен, периферическая артериальная окклюзия и другие тромбозы вен.

Этиологической основой этих заболеваний, как отмечено в частных или тяжелых случаях, является полная закупорка кровеносного сосуда сгустком крови тромбоз или тромбоэмболия. Традиционная антикоагулянтная терапия, например гепарином или кумарином, не приводит к увеличению растворимости тромба или тромбоэмболии. Тромболитические агенты, упоминавшиеся ранее, стрептокиназа и урокиназа, могут эффективно использоваться на практике. Однако имеются жесткие ограничения. Так как у них отсутствует высокое сродство к фибрину, то и активированный циркулирующий и связанный с фибрином плазминоген относительно неразличимы. Плазмин, образовавшийся в токе крови, довольно быстро нейтрализуется и не используется в тромболизе. Остаточный плазмин будет разлагать некоторые факторы свертывания протеинов, например фибриноген, фактор V и фактор VII, вызывая геморрагический потенциал. В дополнение к этому стрептокиназа является в значительной степени антигенной и пациенты с высоким содержанием антител плохо поддаются лечению и не могут подвергаться ему длительное время. Лечение урокиназой является дорогостоящим, потому что ее выделяют из человеческой мочи или культур ткани, поэтому ее обычно не применяют в клинической практике.

Так называемые активаторы плазминогена были выделены из различных тканей человека, например из маточной ткани, крови, сыворотки и из клеточной культуры. Активаторы плазминогена, происходящие из этих источников, были классифицированы на две основные группы: активаторы плазминогена типа урокиназы (у-АП) и активаторы плазминогена тканевого типа (т-АП), основываясь на различиях в их иммунологических свойствах. (Сокращение т-АП и у-АП были предложены на XXXIII Съезде Международного Комитета по тромбозу и гемостазу, Бергамо, Италия, 27 июля 1982 г.).

Недавно было установлено, что линия человеческой меланомы секретирует т-АП. Исследование этого меланомного активатора плазминогена показало, что он не отличим как иммунологически, так и по аминокислотному составу от активатора плазминогена, выделенного из обычной человеческой ткани.

Продукт был выделен в относительно чистом виде и охарактеризован. Было найдено, что он является высоко активным фибринолинотическим агентом. Несколько исследований, в которых был использован т-АП, выделенный от линии клеток меланомы, показали его высокое сродство к фибрину по сравнению с активаторами плазминогена урокиназного типа. Однако более интенсивное исследование человеческого т-АП в качестве потенциального тромболитического агента было затруднено его очень низким уровнем концентрации в крови, экстрактах тканей, перфузоре и в культурах клеток.

Понятно, что применение технологии рекомбинантной ДНК и связанных с ней технологий позволит получить большие количества высококачественного человеческого активатора плазминогена тканевого типа (ранее упоминавшегося как активатор человеческого плазминогена), свободного от других человеческих протеинов.

Молекулярные биологи способны с достаточной легкостью проводить рекомбинацию различных последовательностей ДНК, создавая по существу новые ДНК, способные продуцировать большие количества экзогенного протеинового продукта в трансформированных микробах и культурах клеток. Основные средства и методы работы заключаются в связывании in vitro различных тупоконечных или липких концевых фрагментов ДНК, получая мощные векторы экспрессии, используемые для трансформации конкретных организмов, чем обеспечивается эффективный синтез желаемого экзогенного продукта.

Для создания векторов экспрессии осуществляют рекомбинацию ДНК, а именно объединяют репликации, фрагмент, кодирующий генетический маркер, промотор экспрессии, гетерологический ген и вектор вне клетки-хозяина. Полученный рекомбинантный реплицирующийся вектор экспрессии или плазмиду вводят в клетки трансформацией и получают большие количества рекомбинантного вектора при росте трансформанта. Когда ген правильно вставлен относительно участков, которые управляют транскрипцией и трансляцией данного гена, полученный в результате вектор экспрессии полезен для нарабатывания полипептидной последовательности, которую кодирует встроенный ген. Целевой продукт можно получать лизированием, если необходимо, клеток реципиента в микробной системе и извлечением продукта при соответствующей очистке от других протеинов.

На практике при использовании технологии рекомбинантной ДНК можно экспрессировать гетерологичные полипептиды, так называемая прямая экспрессия, или можно экспрессировать гетерологичный полипептид, сплавленный с частью аминокислотной последовательности гомологичного полипептида.

Хорошо изучено культивирование клеток и тканей для изучения генетики и физиологии клеток с помощью средств и методов. Для этого сохраняют постоянные клеточные линии. Для использования в исследовании такую линию клеток выдерживают на твердом носителе в жидкой среде или выращивают в суспензии, содержащей источник питательных веществ.

Клетки, продуцирующие целевой протеин, также продуцируют сотни других протеинов, эндогенных продуктов клеточного метаболизма. Эти загрязняющие протеины, также как и другие соединения, если их не удалить из целевого протеина, могут оказаться токсичными при введении животным или людям во время терапевтического лечения. Следовательно, разрабатываются способы выделения и очистки целевого продукта, чем обеспечивается гомогенный продукт. Доказывается идентичность целевого продукта.

Ближайшим аналогом предлагаемых способа и штамма является способ получения активатора плазминогена тканевого типа, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей активатор плазминогена тканевого типа, трансформацию полученными ДНК штаммов, реципиентов, выращивание трансформантов, выделение и очистку целевого продукта [1] Успешно использована технология рекомбинантной ДНК для получения активатора плазминогена человеческой ткани (т-АП) в количествах, достаточных для начала и проведения испытаний на животных и клинических испытаний как предпосылки для выпуска его в продажу. Продукт человеческой т-АП пригоден для использования во всех его формах для профилактического или терапевтического лечения людей с различными сердечно-сосудистыми расстройствами и заболеваниями.

Изобретение также относится к векторам экспрессии, содержащим фрагменты ДНК, кодирующие человеческий активатор плазминогена ткани и штаммам микроорганизмов или клеточных культур, трансформированных ими, способным продуцировать активатор плазминогена человеческой ткани.

Описание признаков штамма. АТСС GCL 60STRC (Роговица, кролик, Prycytolagus Cuniculus).

Общепринятая среда для размножения: минимальная поддерживающая среда Игла (МЕМ) с несущественными аминокислотами и сбалансированный солевой раствор Эрла (BSS) 90% плодовая коровья сыворотка 10% Клеточная линия SIRC была получена М. Фолькертом (Государственный институт сыворотки, Дания, Копенгаген) из роговицы нормального кролика в 1957 г. Восприимчива к вирусу рубеллы. Пригодна для первичной изоляции вируса рубеллы. Ранее появление отчетливых цитопатических изменений делает эту клеточную линию особенно пригодной как для размножения, так и квантизации вируса рубеллы. Справочный семенной запас был заморожен в феврале 1966 г.

Описание депонированного справочного семенного запаса Количество последовательных субкультур из исходной ткани: приблизительно 400 в лаборатории создателя, 19 в лаборатории представляющей организации, 11 в лаборатории, дающей отзыв.

Среда замораживания: культурная среда 90% диметилсульфоксид (DMSO) 10% без антибиотиков.

Жизнеспособность: приблизительно 85% (исключение красителя).

Культурная среда: сбалансированный солевой раствор Эрла (BSS) с уменьшенным количеством бикарбоната (0,84 г/л) плюс 10% инактивированной телячьей сыворотки; гидролизированный лактаальбумин 1,7 г/л; и дрожжевой экстракт, Дифко, 0,57 г/л; без антибиотиков.

Ростовая характеристика размороженных клеток: инокулят 4,0 10⁵жизнеспособных клеток на трехунцевый аптечный пузырек дает 2,5 10⁴клеток за 7 дней, когда среду меняют на 3-й день и рН поддерживают при 7,3.

Эффективность посева: менее чем 1% в вышеуказанной культуральной среде.

Морфология: фибробластоподобная.

Кариология: Хромосомное частотное распределение 50 клеток: 2 n 44 Модальное число (66) не позволяет определить пол донора цитологически. Большинство клеток содержит одну длинную неспаренную, субметацентрическую хромосому и 2-3 малых телоцентрических хромосомы с сателлитами. Полиплоидность в 5/200 метафазных клетках.

Стерильность: тесты на микоплазму, бактерии и грибки были отрицательны.

Вид: кролик.

Восприимчивость к вирусу: невосприимчив к полиовирусу 2, к вирусу Коксаки А-9 и В-5. Репликация вируса рубеллы с сопровождающими цитопатическими изменениями подтверждена Д.Джей. Мельником, Бейлорский университет, Хьюстон, Техас и Др.Джей. Биттлом, Питмэн-Мур Ко. Индианополис, Индиана.

Обратная траскриптаза: не обнаружены.

Представлена: Джей. Лирхой, Энтеровирусный факультет, Государственный институт сыворотки, Копенгаген, Дания.

Подготовлена и охарактеризована: Калифорнийский университет, Лаборатория морской биологии, Беркли, Калифорния и Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд.

АТСС CCL 61 CHO-KI (яичник, китайский хомячок), Cricetulus griseus) требующий пролина.

Общепринятая среда для размножения: среда F-12 Гэма 90% плодовая коровья сыворотка 10% Клетки СНО-KI были получены в качестве субклона из родительской СНО-клеточной линии, начало было положено биопсией яичника взрослого китайского хомячка.

Оригинальная культуральная среда состояла из среды N 16 с физиологическим раствором 81% NCTC 109,4% плодовая коровья сыворотка 15% Из-за субклонов культуральную среду заменили на среду F-12 Гэма плюс плодовая коровья сыворотка. Клетки СНО-KI требуют пролина и имеют модальное хромосомное число 20. Очевидно, в клетках отсутствует активная форма гена, необходимая для синтеза пролина, и блок биосинтетической цепи лежит в стадии, превращающей глутаминовую кислоту в глутаминовый гамма-полуальдегид. Частота реверсии независимо от пролина равна приблизительно 10^-6.

Используются для индукции и изоляции мутантов пищевой недостаточности и в исследованиях, относящихся к экспрессии гена посредством гибридизации. Клеточная линия была предоставлена в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) в июне 1970 г. после проведения субкультиваций от исходной ткани.

Описание депонированного справочного семенного запаса Количество последовательных субкультур их исходной ткани: приблизительно 400; 7 в АТСС.

Среда замораживания: культуральная среда 92% глицерин 8% без антибиотиков.

Жизнеспособность: приблизительно 90% (исключение красителя).

Культуральная среда: среда F-12 Гэма 90% плодовая коровья сыворотка 10% без антибиотиков.

Ростовая характеристика размноженных клеток: инокулят 10⁵жизнеспособных клеток/мл в вышеуказанной культуральной среде при 37^оС увеличивался за 7 дней.

Эффективность посева: приблизительно 90% в вышеуказанной культуральной среде.

Морфология: эпителиальноподобная.

Кариология: Хромосомное частотное распределение 50 клеток: 2 n 22 количество является гиподиплоидным.

Стерильность: тесты на микроплазмы, бактерии и грибки отрицательны.

Вид: китайский хомячок, подтвержден путем антителоцитотоксичной пробы с исключением красителя и изоэнзиматического анализа.

Восприимчивость к вирусу: восприимчив к везикулярному стоматиту (индийский штамм) и арбовирусам Гетана. Не восприимчив к полиовирусу, к арбовирусам Модок и Баттон Уиллоу.

Обратная транскриптаза: не обнаружена.

Характеристики: Справочные клетки требуют для своего роста пролин.

Представлен: Т. Т. Паком, Институт исследований рака им. Элеоноры Рузвельт, Медицинский центр Университета Колорадо, Денвер, Колорадо.

Подготовлена и охарактеризована: Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд.

АТСС CCL 62 FL (Амнион, человеческий, маркеры He/La) Общепринятая среда для размножения: АТСС CRCM 30 90% телячья сыворотка 10% Клеточная линия FL была получена из нормальной человеческой анионовой ткани в марке 1956 г Джей. Фогом и Р.Лундом. С помощью трипсинизации ткани суспендировали клетки в среде, содержащей 20% воловьей сыворотки и сбалансированный солевой раствор Эрла, содержащий 0,5% гидролизованного лактаальбумина, и затем высевали в чашки Петри. При первой пересадке использовали среду, содержащую 20% человечьей сыворотки, и пересадку осуществляли в пробирки. Рост улучшался на шестой пересадке, и линия затем выращивалась непрерывно в среде LY 80% сыворотка человека 20% Среда LY это обозначение, данное смеси, состоящей из 0,5% гидролизованного лактаальбумина, 0,1% дрожжевого экстракта и 0,4% декстрозы в балансированном солевом растворе Эрла. Клетки также способны к росту в различных средах, дополненных сывороткой из различных видов. Во время ранних пересадок клетки несколько увеличивались, но фибробластоподобная стадия не наблюдалась никогда. Клетки FL использовались и широко изучались в отношении различных свойств, включая вирусную восприимчивость, туморогенность, морфологию и кариологию.

Описание депонированного справочного семенного запаса Количество последовательных субкультур из исходных ткани: неизвестно; по оценке 480.

Среда замораживания: базальная среда (Игл) 80% человечья сыворотка 15% глицерин 5% без антибиотиков.

Жизнеспособность: приблизительно 92% (исключение красителя).

Культуральная среда: среда LY 80% человечья сыворотка 20% без антибиотиков.

Ростовая характеристика размороженных клеток: инокулят 10⁵жизнеспособных клеток/мл в вышеуказанной среде увеличивается приблизительно в 5-8 раз за 8-10 ней. Прикрепление клеток не максимально в первом пересеве. В последующих пересевах (0,5-0,5) 10⁵ жизнеспособных клеток будут увеличиваться приблизительно в 15-20 раз за 7 дней.

Эффективность посева: приблизительно 20% в вышеназванной среде.

Морфология: эпителиальноподобная.

Кариология: Хpомосомное частотное распределение 100 клеток: 2 n 46 (как определено на справочных клетках Джей. Фогом) В 100% клеток присутствует крупная субметацентриковая маркерная хромосома.

He/La маркерные хромосомы: одна копия N 1, одна копия N 2, три копии N 3 и две копии N 4 как показывает G-характер исчерченности. Эта клеточная линия, возможно, была загрязнена клетками He/La.

Стерильность: тесты на микоплазму, бактерии и грибки были отрицательны.

На фиг. 1 изображена рестрикционная карта полной длины к-ДНК человеческого т-ПА; на фиг. 2 след пептида, переваренного трипсином человеческого т-АП при высокоэффективной жидкостной хроматографии; на фиг. 3 конструкция ДГФР (мутанта или дикого типа) плазмид, кодирующих т-АП, пригодных для трансформации культур клеток ткани млекопитающего; на фиг. 4 схематическая диаграмма человеческого активатора плазминогена ткани, полученного по способу, описанному в примере 1.

Нуклеотидная последовательность и уменьшенная аминокислотная последовательность полной длины к-ДНК человеческого т-АП дана в конце описания.

А. Определения "Активатор плазминогена человеческой ткани", или "человеческий т-АП", или "т-АП" означает активатор плазминогена, присущего человеку (тканевого типа), полученный в микробной системе или в системе культуры клеток, активных формах, включающих протеазный участок. Предлагаемый активатор плазминогена человеческой ткани был выделен с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Понятно, что существуют природные аллельные вариации генов и они встречаются от индивидуума к индивидууму. Эти вариации могут быть вызваны аминокислотными различиями в общей последовательности или делециями, замещениями, вставками, инверсиями или дополнениями аминокислоты (кислот) в указанную последовательность. Кроме того, местоположение и степень гликозилирования будут зависеть от клетки-реципиента.

При использовании технологии рекомбинантной ДНК для получения различных производных активатора плазминогена человеческой ткани осуществляют модификацию последовательности в результате единичных или множественных аминокислотных замещений, делеций, дополнений или замен аминокислот, например, с помощью сайт-специфического мутагенеза основной ДНК. Все такие аллельные вариации и модификации, приводящие в результате к производным активатора плазминогена человеческой ткани, включены в область предлагаемого изобретения, так же как и другие родственные активаторы плазминогена, присущие человеку (тканевого типа). Если основная биологическая активность активатора плазминогена человеческой ткани при этом сохраняется без изменения, активатор плазминогена человеческой ткани получают: имеющим метионин в качестве первой аминокислоты (присутствует посредством вставки начального сигнального кодона АТГ перед структурным геном); где метионин внутри- или внеклеточно отщеплен; вместе или с его сигнальным полипептидом или с сопряженным протеином, иным по сравнению с традиционным сигнальным полипептидом, при этом сигнальный полипептид или конъюгат специфически отщепим во внутри- или внеклеточном окружении; прямой экспрессией зрелой формы без необходимости отщепления любого периферического, излишнего полипептида.

Последнее особенно важно, когда данный хозяин не удаляет или удаляет неэффективно сигнальный полипептид. Вектор экспрессии предназначен для экспрессии активатора тканевого плазминогена вместе с его сигнальным полипептидом. В любом случае полученный таким образом человеческий т-АП в его различных формах извлекают и очищают до уровня, соответствующего его использованию при лечении различных сосудистых расстройств или заболеваний.

Кроме того, т-АП имеет формы, которые включают как одноцепочный (1-цепь) протеин, так 2-цепочечный протеин. Последний протеолитически происходит из 1-цепочечного протеина. Теоретически считается, что 2-цепочечный протеин ассоциирован с продуцированным фибрином и что протеолитическое превращение из 1-цепочечного в 2-цепочечный протеиновый материал происходит в месте превращения плазминогена в плазмин. Предлагаемое изобретение обеспечивает введение 1-цепочечного протеина для конверсии in vivo. Описано введение 2-цепочечного протеина, который также проявляет активность, 2-цепочечный протеин может быть получен in vitro протеолитическим превращением 1-цепочечного материала. Так называемый "крингл" участок расположен выше участка сериновой протеазы и, как полагают, играет важную роль при связывании активатора тканевого плазминогена с фибриновой матрицей. Активатор тканевого плазминогена получают с ферментативно активным участком.

Для краткости в предлагаемом изобретении человеческий т-АП способен катализировать превращение плазминогена в плазмин, связывать фибрин, и классифицируется как т-АП, исходя из иммунологических свойств.

"По существу чистая форма" используется для описании состояния человеческого т-АП, свободного от протеина или других материалов, обычно ассоциированных с человеческим т-АП, когда его продуцируют нерекомбинантные клетки.

"ДГФР-протеин" относится к протеину, который обладает дигидрофолат редуктазы (ДДГФР) активностью и для его продуцирования требуются клетки, которые способны выживать в среде, лишенной гипоксантина, глицина и тимидина (ГГТ-среда). Обычно клетки, дефектные по ДГФР, не способны к росту в этой среде. Клетки, которые содержат ДГФР-протеин, успешно растут на ней.

"Клетки, чувствительные к МТТ" относятся к клеткам, которые не способны расти на среде, которая содержит ингибитор-метотрексат (МТТ) ДГФР. Следовательно, "клетки, чувствительные к МТТ" являются клетками, которые не способны расти в обычных условиях и в среде, пригодной для типа клеток, когда концентрация МТТ составляет 0,2 мкг/мл или более. Некоторые клетки, такие как бактерии, не проявляют чувствительности к МТТ, так как они не пропускают МТТ через мембрану клетки, даже если они содержат ДГФР. Клетки, которые содержат дикого вида ДГФР, будут чувствительными к метотрексату, если они проницаемы или способны поглощать МТТ.

"ДГФР дикого типа" относится к дегидрофолатредуктазе такой, которая находится в конкретном рассматриваемом организме. ДГФР дикого типа обычно чувствительна in vitro к низким концентрациям метотрексата.

"ДГФР протеин с низким сродством к связыванию МТТ" этот ДГФР-протеин обеспечивает рост чувствительных к МТТ клеток в среде, содержащей 0,2 мкг/мл или более МТТ.

"Вектор экспрессии" включает векторы, которые способны экспрессировать последовательность ДНК, содержащиеся в нем, при этом такие последовательности действительно связаны с другими последовательностями, способными влиять на их экспрессию. Эти векторы экспрессии должны реплицироваться в организмах-реципиентах или как эписомы, или как интегральная часть хромосомной ДНК. Обычно векторы экспрессии, используемые в технологии рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид, которые означают круглые, двунитевые ДНК, которые в их векторной форме не встроены в хромосому. В предлагаемом описании плазмида и вектор использованы взаимозаменяемо, так как чаще всего плазмида используется в форме вектора. Однако изобретение включает другие формы векторов экспрессии.

"Рекомбинантные клетки+реципиенты" означают клетки, которые трансформированы векторами, сконструированными с использованием техники рекомбинантной ДНК.

Культуры клеток-реципиентов и векторы (В) Векторы и способы, описанные здесь, пригодны для использования в клетках-реципиентах широкого круга прокариотных и двукариотных организмов.

Разумеется, обычно прокариоты являются предпочтительными для клонирования последовательностей ДНК при конструировании векторов. Особенно полезен штамм 294 Е. coli K12 (АТСС N 31446). Другими микробными штаммами, которые могут быть использованы, являются штаммы E. coli B и E. coli Х1776 (АТСС N 31537). Разумеется, что эти примеры приведены для иллюстрации и не ограничивают изобретение.

Могут быть использованы E.coli W3110/F^-- прототроф, (АТСС N 27325), бактерии, такие как Bacillus subtilis и другие энтеробактерии, такая как Salmonella typhimurium или Serratia marcescens и различные виды Psendomonas.

Обычно в сочетании с этими реципиентами используют плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые происходят из видов, совместимых с клетками-реципиентами. Обычно вектор несет участок репликации, а также маркерные последовательности для фенотипической селекции трансформированных клеток. Например, E. coli обычно трансформируют, используя pBP плазмиду рВР, 322. рВР, 322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. рВР, 322 плазмида или другие микробные плазмиды могут содержать промоторы, которые могут быть использованы микробным организмом для экспрессии протеинов. Чаще всего промоторы, используемые в конструировании рекомбинантной ДНК, включают промоторные системы -лактамазы.

Помимо прокариотов можно также использовать эукариоты, такие как культуры дрожжей. Широко используются среди эукариотных организмов Saccharomyces cerevisial или обычные пекарские дрожжи, хотя обычно доступны к другие штаммы. Для экспрессии в Saccharomyces обычно используют плазмиду YRp 7. Эта плазмида содержит trp 1 ген, который обеспечивает селективный отбор мугантного штамма дрожжей, потерявшего способность к росту в триптофане, например АТСС N 44076 или РЕР4-1.

Промоторные последовательности, используемые в дрожжевых клетках, включают промоторы для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируват киназа, триосефосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. При конструировании плазмид экспрессии концевые последовательности, ассоциированные с вышеперечисленными генами, также встроены в вектор экспрессии, чтобы обеспечить полиаденилирование м-РНК и терминацию. Другими промоторами являются индуцибельные промотирующие области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, и вышеупомянутых глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Пригодным является любой плазмидный вектор, содержащий дрожжесовместимый промотор, источник репликации и концевую последовательность. пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируват киназа, триосефосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. При конструировании плазмид экспрессии концевые последовательности, ассоциированные с вышеперечисленными генами, также встроены в вектор экспрессии, чтобы обеспечить полиаденилирование м-РНК и терминацию. Другими промоторами являются индуцибельные промотирующие области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, и вышеупомянутых глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы, и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Пригодным является любой плазмидный вектор, содержащий дрожжесовместимый промотор, источник репликации и концевую последовательность.

Кроме того, в качестве реципиентов могут использоваться культуры эукариотических клеток. В принципе любая такая клеточная культура является работоспособной, независимо от того, является ли она культурой позвоночного или беспозвоночного. Наибольший интерес представляют клетки позвоночных, так как размножение клеток позвоночных в культуре тканей становится рутинной процедурой в последние несколько лет. Примерами таких полезных линий являются VERR и He/La клетки, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и W138. ВНК, СOS 7 и ДМСК-линии клеток. Векторы экспрессии таких клеток обычно включают источник репликации, промотор, локализованный впереди гена, который должен быть экспрессирован, наряду с любыми участками, необходимыми для связывания рибосом, участком полиаденилирования, и транскрипционные последовательности.

Обычно используемые в культуре тканей промоторы происходят из полиомы. Аденовируса 2 и чаще Симиан Вирус 40 (SV40). Ранний и поздний промоторы SV40 вируса являются особенно полезными, потому что оба легко получаются из вируса в виде фрагмента, который также содержит источник репликации вируса SV40. Меньшие или большие фрагменты SV40 представляют собой последовательности размером 250 п.о. а именно Hind III Bgl I, фрагмент, локализованный в источнике репликации вируса. Желательно использовать промотирующие или регуляторные последовательности, ассоциированные с последовательностью экспрессируемого гена и совместимые с системами клеток-реципиентов.

Источник репликации может происходить из SV40 или другого вируса (например, Полиома, Адено, VSV, BPV и т.п.), или обеспечиваться механизмом хромосомной репликации клетки-хозяина, если вектор встроен в хромосому клетки-хозяина.

При отборе предпочтительной клетки-реципиента для трансфекции векторами изобретения, которые включают последовательности ДНК, кодирующие как т-АП, так и ДГФР-протеин, учитывают тип примененного ДГФР-протеина. При применении протеина ДГФР дикого типа выбирают клетку-реципиента, которая лишена ДГФР, в результате чего последовательность, кодирующая ДГФР, может использоваться в качестве маркера для отбора трансфектантов в среде, которая лишена гипоксантина, глицина и тимидина. Подходящей клеткой-реципиентом является линия клеток яичника китайского хомячка (СНО), лишенная ДГФР-активности.

В случае использования в качестве регуляторной последовательности ДГФР-протеина с низкой связывающей способностью к МТТ, нет необходимости использовать устойчивые к ДГФР клетки. При этом может быть использована среда, содержащая МТТ, в качестве средства для селекции. Большинство эукариотических клеток, которые способны адсорбировать МТТ, являются чувствительными к метотрексату. Одной линией клеток является линия СНО, СНО-ЕI АТСС N ССI 61.

Использованные методики Если в качестве клеток-реципиентов используют клетки без труднопреодолимых мембранных барьеров клетки, трансфекцию проводят методом осаждения фосфатом кальция. Однако могут быть использованы другие методы для введения ДНК в клетку, такие как инъекция ядра или слияние протопластов.

Если используют клетки прокариота или клетки, которые содержат различные конструкции клеточной стенки, предпочтительным способом трансфекции является кальциевая обработка с использованием хлористого кальция.

При конструировании подходящих векторов, содержащих желаемые кодирующие и регуляторные последовательности, применяют стандартные методики связывания. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК обрабатывают рестриктазой и снова лигируют для образования требуемой плазмиды. Расцепление проводят в результате обработки рестрикционным ферментом (или ферментами) в подходящем буфере. Обычно используют около 1 мкг плазмиды или фрагментов ДНК и примерно 1 ед. фермента в 20 мкл буферного раствора. (Соответствующие буферы и количества субстрата для конкретных рестрикционных ферментов определены производителем). Пригодным является время инкубации около 1 ч при 37^оС. После инкубаций протеин удаляют экстракцией фенолом и хлороформом, а нуклеиновую кислоту извлекают из водной фракции осаждением этанолом.

Если требуются тупые концы, фрагменты ДНК обрабатывают в течение 15 мин при 15^оС 10 ед. полимеразы 1 (Кленова), экстрагируют фенолом-хлороформом и осаждают этанолом.

Проводят разделение по размерам полученных фрагментов, используя 6%-ный полиакриламидный гель.

Для связывания нужных фрагментов их обрабатывают примерно 10 ед. Т4 ДНК лигазы на 0,5 мкг ДНК. Для предотвращения повторного связывания расщепленного вектора полезна предварительная обработка бактериальной щелочной фосфатазой.

Сконструированные плазмиды используют для трансформации E. coli К12 штамма 294 (АТСС 31446) и отбирают трансформанты по устойчивости к ампициллину или тетрациклину. Из трансформантов получают плазмиду, анализируют рестрикционным и/или иными методами.

Проводят амплификацию последовательностей, кодирующих ДГФР-протеин,в результате выращивания культуры клеток-реципиентов в присутствии приблизительно 20-500000 нМ концентраций метотрексата, конкурентного ингибитора ДГФР-активности. При этом эффективный интервал концентраций зависит от природы ДГФР-гена, протеина и характеристик реципиента. Можно также использовать подходящие концентрации других аналогов фолиевой кислоты или других соединений, которые ингибируют ДГФР. Однако МТТ является удобным, легко доступным и эффективным.

Сущность изобретения состоит в том, что человеческий активатор плазминогена ткани получают следующим образом.

Культивируют клетки человеческой мелономы, продуцирующие активатор тканевого плазминогена, для слияния.

Из клеточных культур экстрагируют в присутствии ингибиторов рибонуклеазы цитоплазмическую ДНК.

На олиго-dT колонке изолируют всю мРНК в полиаденилированной форме. Эту м-РНК фракционируют по размерам с использованием электрофореза на агарозном геле.

Идентифицируют гель-фракцию, содержащую специфическую ДНК активатора тканевого плазминогена. Транслируют РНК от каждой гель-фракции в системе in vitro лизата ретикулоцитов кролика, дополненную микросомами поджелудочной железы собаки. Полученные в результате продукты трансляции затем иммуноосаждают специфическим IgG антителом активатора плазминогена человеческой ткани.

Соответствующую ДНК (21 по 24 S) превращают в соответствующую однонитевую комплементарную ДНК (кДНК), из которой получают двунитевую кДНК. После поли-dC подготовки ее встраивают в вектор, такой как плазмида, несущая один или более фенотипических маркеров.

Используют полученные таким образом векторы для трансформации бактериальных клеток, получают библиотеку клонированной кДНК. Готовят и используют для зондирования библиотеки колоний пул радиоактивно меченых синтетических дезоксиолигонуклеотидов, комплементарных к кодонам для известных аминокислотных последовательностей в т-АП, таких как, например, пул из 8-14-меров, 5'-dTC/_G^A/CA/_G^A/TA/^CT/TCCCA-3/', компле- ментарный к последовательностям, кодирующим известную аминокислотную последовательность: триптофан глютаминовая кислота тирозинцистеин маспаргиновая кислота (W-E-Y-C-Д).

Выделяют из положительных клонов плазмиду, содержащую кДНК, и определяют последовательность.

Затем подготавливают ДНК, кодирующую t-РА, с определенной последовательностью для вставки in vitro в соответствующий вектор экспрессии, который используют для трансформации в подходящую клетку-реципиент, которую в свою очередь культивируют, и получают желаемый активатор плазминогена человеческой ткани.

Полученный таким образом активатор плазминогена человеческой ткани содержит примерно 251 аминокислоту в его серинпротеазном участке и участок tringle, с последовательностями, расположенными вверх от него, которые, как полагают в настоящее время, являются ответственными за связывание фибрина. Зрелый протеин плюс его сигнальная последовательность составляют в сумме 562 аминокислоты.

Описанная выше процедура позволяет получить чистый т-АП. Использование дополнительной кодирующей последовательности, чувствительной к метотрексату, позволяет получать в клетках-реципиентах при культивировании активный т-АП протеин в количествах более 0,1 п г на клетку в день. Применяя подходящие условия амплификации, можно получать количества более 20 пг на