Штамм бактерий bacillus thuringiensis var donegani для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, кристаллический параспоральный белковый токсин и способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми

Штамм бактерий bacillus thuringiensis var donegani для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых, кристаллический параспоральный белковый токсин и способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми

Реферат

 

Использование: производство микробиологических средств защиты растений от насекомых и касается нового штамма бактерий для получения вышеуказанного средства, кристаллического параспорального белкового токсина и способа борьбы с жесткокрылыми насекомыми. Сущность изобретения: штамм Bacillus thuringiensis var donegani выделен из мертвых личинок Tenebrio molitor, депонирован в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий, Лимитед, под. NNCIMB 40152. При культивировании штамма на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, продуцирует параспоральный белковый токсин, имеющий форму параллелепипеда с квадратным основанием, в верхней и нижней плоскостях которого построены две пирамиды с равными основаниями. Токсин растворим в воде при нейтральном значении pH и имеет мол.м. 64000-72000 и 34000-36000 Да. При обработке личинок Leptinotarsa decemlineata второй возрастной стадии на 5 сут. наблюдается 100%-ная смертность. 3 с.п.ф-лы, 15 табл.

Изобретение относится к штамму Bacillus thuringiensis "var. donegani" (Btd) NCIMB 40152, к препарату или токсину, полученному из него, обладающему инсектицидной активностью против Coleoptera.

Известно, что спорогенная бацилла Bacillus Thutingiensis (Bt) во время стадии спорогенеза продуцирует параспоральные кристаллы белковой природы и проявляет инсектицидную активность против большого числа насекомых, принадлежащих к отрядам Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. Такие кристаллы при проглатывании насекомым, чувствительным к их активности, вызывают необратимые разрушения кишечной слизистой оболочки, причем насекомое перестает питаться и погибает.

Известны многие разновидности Bt, которые отличаются друг от друга биохимическими и/или физиологическими характеристиками и их удельной/селективной инсектицидной активностью. Некоторые из этих разновидностей поставляются на рынок в качестве средств для использования в борьбе против насекомых.

Известные разновидности Bt подразделяются на основе их удельной/селективной активности на три патотипа (табл. 1).

В качестве патотипа С, обладающего удельной активностью против coleoptera, в литературе известны только две разновидности, то есть var. tenebrionis, заявленная в заявке на Европатент N 149162, и var. san diego, заявленная в заявке на Европатент N 202739.

Предлагаемое изобретение касается получения штамма Bt и инсектицидного препарата или токсина, полученного из него, обладающего улучшенной удельной инсектицидной активностью против coleoptera. Получение данного штамма является более дешевым, простым и более эффективным.

Обнаружен штамм Bacillus thurin- giensis патотип С, обозначенный var. donegani (Btd), NCIMB 40152. Выделенный из него инсектицидный препарат или токсин неожиданно обладает общей инсектицидной активностью.

Следовательно, предметом изобретения является разновидность donegani штамм NCIMB 40152 Bacillus thuringiensis.

Другим предметом изобретения является кристаллический параспоральный белковый токсин, получаемый из культур разновидности donegani NCIMB 40152 Bacillus thuringiensis после спорогенеза и последующего лизиса спорангия.

Кроме того, предметом изобретения является способ борьбы с насекомыми, в частности coleoptera, который предусматривает нанесение на растения или на их части, такие как листья, стебли, или в почву, на которой они произрастают, эффективного количества Btd NCIMB 40152, препарата или токсина на основе выделенного из данной разновидности, как такового или в качестве пригодной композиции, содержащей инертный, твердый или жидкий носитель или другие добавки.

Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40152 обладает удельной инсектицидной активностью против coleoptera, в частности против листоеда Leptinotarsa decemlineata (Doriphora картофеля), и поэтому принадлежит к патотипу С. Btd NCIMB 40152 отличается от известных разновидностей Btd тем, что она обладает другими биохимическими и физиологическими характеристиками и, в частности, отличается от разновидностей tenebrionis и san diego также тем, что продуцирует параспоральный кристалл с другими морфологическими характеристиками, а также иными физико-химическими и физиологическими характеристиками.

Морфология и биохимические характеристики Btd NCIMB 40152.

Штамм Bacillus thuringiensis var. donegani (Btd) NCIMB 40152 был выделен из мертвых личинок Tenebrio molitor и включен в прейскурант для внутреннего лабораторного использования с традиционным кодом ВТ/43. Выделенный клон культивировали на агаризованной твердой питательной среде, которой была придана селективность при помощи добавления 10 ед./мл Пенициллина G. Насекомых предварительно обрабатывали при температуре 80^оС в течение 15-20 мин с целью селективного выделения спорогенных бацилл. Культуру данного микроорганизма внесли в реестр в соответствии с Будапештским Договором в Национальной Коллекции Промышленных Бактерий (свидетельство о происхождении: Национальная коллекция промышленных и морских бактерий Лимитед. Торри Рисерч Стэйшн, Р.О. Вох 31, 135 Abbey Road, Абердин АВ 98 DG, Шотландия, Великобритания), где ей присвоен депозитарный номер NCIMB 40152.

Btd NCIMB 40152 можно хранить на обычных средах, например агаризованной твердой питательной среде, при температуре 25-30^оС, и размножать с использованием методик, известных специалисту в данной области знания.

Определение рода и вида было осуществлено на основе морфологических и биологических характеристик микроорганизма.

Морфология.

Выделенные колонии Btd NCIMB 40152 на агаризованной твердой питательной среде являются плоскими, имеющими либо кольцевую, либо нерегулярную форму, а также аэродированный или дольчатый край, причем они имеют бледный цвет. Вегетативная клетка имеет форму маленького стержня, является грамположительной, имеет диаметр от 1 до 2 мкм и длину от 6 до 8 мкм.

Температура выращивания составляет от 25 до 35^оС.

Когда культуру микроорганизма обрабатывают в автоклаве при температуре 121^оС в течение 15 мин, и споры, и токсин инактивируются.

Положение споры является центральным или субтерминальным. Параспоральный кристалл, наблюдаемый под растровым электронным микроскопом, имеет форму параллелепипеда с прямоугольным основанием и двумя пирамидами с равными основаниями на верхней грани и нижней грани, с размерами, составляющими от 1 до 2 мкм, и поэтому отличается от параспорального кристалла, продуцируемого разновидностями Bt tenebrionis и san diego, который в обоих случаях является плоским и имеет форму параллелограмма.

Биохимические характеристики.

Btd NCIMB 40152 в своей вегетативной стадии имеет биохимические характеристики, приведенные в табл. 2.

Метод, используемый в данном описании, описан (Прокариоты. Спрингер Верлаг, 1981. Руководство по методом для общей бактериологии. Американское общество микробиологии).

Расхождение между Btd 40152 и известными в данной области техники разновидностями можно также выявить путем сравнения биохимических характеристик Btd 40152 c теми, которые присущи известным разновидностям Bt, как приведено в табл. 3.

Характеристики, относящиеся к культуре, и методы выделения активного начала.

Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152 можно культивировать на общих жидких средах, таких как, например, питательный бульон, при температуре 25-30^оС с использованием известных в данной области техники методик.

К концу процесса ферментации и спорогенеза биомассу можно разделить центрифугированием ферментационного бульона.

Разделенную таким образом биомассу можно затем подвергнуть упариванию или лиофилизации с тем, чтобы получить твердый продукт в порошковой форме, обладающий инсектицидной активностью. Инсектицидная активность Btd NCIMB 40152 в основном обусловлена параспоральным кристаллическим токсином белковой природы, который растворяется в воде при нейтральном значении рН в отличие от токсина, продуцируемого разновидностями Bt tenebrionis и san diego. Следовательно, такой токсин может быть выделен путем суспендирования в воде при нейтральном значении рН, при этом биомассу выделяют центрифугированием из ферментационного бульона после спорогенеза, и путем сохранения полученной таким образом суспензии при перемешивании, при комнатной температуре в течение периода времени от 1 до 12 ч.

После последовательного центрифугирования или фильтрации водной суспензии восстанавливают водный раствор, свободный от спор и ферментационных остатков, который в основном содержит белковый токсин. Белковый токсин может быть извлечен из раствора при помощи хорошо известных методик, таких как лиофилизация.

Затем определен молекулярный вес токсина с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. При этом были выявлены две следующие основные группы полос: первая группа из трех полос с мол.м. составляющей от 64000 до 72000, вторая группа из двух полос с мол.м. составляющей от 34000 до 36000.

Биологическая активность.

Btd NCIMB 40152, препарат или токсин, полученный из данного штамма, проявляет инсектицидную активность против coleoptera, например Leptinotarsa decemlineata.

В противоположность этому никаких токсичных эффектов не наблюдается в отношении некоторых Lepidoptera, таких как например, Spodoptera littoralis и Ephestia kuehniella, а также в отношении Dipteran Aedes aegypti.

Модульность действия активного начала против личинок Coleoptera является аналогичной, как в случае препаратов на основе патотипа А Bt, несколько часов после обработки личинки прекращают питание и умирают через 24-48 ч. Смерть происходит в результате воздействия токсина на кишечный эпителий насекомого, который подвергается необратимым повреждениям.

Лиофилизированные твердые продукты, полученные в результате ферментации и спорогенеза Btd NCIMB 40152, а также его параспоральный белковый токсин как таковой или в виде пригодной композиции, следовательно, являются пригодными в борьбе против Coleoptera, которые заражают сельскохозяйственные угодия. По этой причине предпочтительно использовать выделенный токсин.

По сравнению с токсинами, полученными из известных разновидностей Bt и, в частности, разновидностей tenebrionis и san diego патотипа С, токсин, полученный из Btd NCIMB 40152 в соответствии с предлагаемым изобретением имеет целый ряд преимуществ на коммерческо-промышленном уровне относительно его извлечения, его применения и его инсектицидной активности. Эти преимущества состоят в следующем: выделение токсина из культуральной среды является более простым и более легким благодаря растворимости данного токсина в воде, а следовательно, указанный токсин может быть получен в концентрированной форме, свободной от спор, клеток и ферментационных остатков; концентрированные водные растворы токсина, которые в отличие от суспензий или дисперсий известных токсинов не осаждаются, могут храниться и транспортироваться более легко; токсин может наноситься из его растворов более легко и эффективно, нежели аналогичные токсины, которые наносят диспергированными в твердой форме благодаря их несовместимости с традиционными органическими растворителями, используемыми в композициях.

Кроме того, неожиданно обнаружено, что токсин, происходящий от Btd NCIMB 40152, также проявляет общую инсектицидную активность в отличие от токсинов, продуцируемых другими разновидностями Bt.

Такая общая активность заключается в том, что активное начало мигрирует к частям растений более быстро от точки нанесения, что гарантирует более широкую защиту растения и делает возможным использование меньших количеств активного начала; в частности, токсин в соответствии с предлагаемым изобретением движется через корневой аппарат растений.

Кроме того, токсин может действовать эффективно в течение более продолжительных периодов времени, так как, проникая в васкулярную систему растения, он более защищен от воздействия внешних агентов, которые имеют склонность к его расщеплению или вымыванию.

Общая активность токсина является еще более благоприятной, когда обрабатывают растения, которые находятся в стадии их роста.

Кроме того, общая (системная) активность наделяет токсин более высокой эффективностью в превентивных обработках и уменьшает необходимость проведения повторных обработок во время цикла роста растений.

Продукт Bacillus thuringiensis var. donegani NCIMB 40152, полученный в результате его ферментации и спорогенеза, а также параспоральный токсин может использоваться в виде концентрированных жидкостей, смачиваемых порошков с использованием жидких или твердых инертных носителей, а также композиционных вспомогательных средств и/или добавок, таких как смачивающие вещества, промоторы адгезии, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы и другие добавки, обычно используемые в инсектицидных составах.

Для практического применения в сельском хозяйстве пригодны те дозы, которые, как в случае использования токсина из Btd NCIMB 40152, составляют от 0,05 до 4 кг/га и предпочтительно от 0,2 до 2 кг/га.

П р и м е р 1. Колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 100 мл среды, состоящей из триптонового соевого бульона (OXOID), инокулируют 1 мл 16-часовой культуры Bacillus thuringiensis NCIMB 40152 в питательном бульоне в качестве среды.

Колбы Эрленмейера поддерживают при орбитальном перемешивании при температуре от 25 до 35^оС. Спорогенез проверяют на микроскопе. В конце ферментации биомассу центрифугируют, суспендируют вновь в воде с рН 7 и поддерживают при перемешивании в течение 3 ч при комнатной температуре. Раствор, полученный после выделения центрифугированием спор и ферментационных остатков, лиофилизируют и используют для определения биологической активности или для получения составов.

П р и м е р 2. Определение инсектицидной активности лиофилизированного препарата, полученного в соответствии с примером 1, в основном состоящего из параспорального белкового токсина, осуществляют с использованием данного препарата в виде водного раствора при различных концентрациях.

Модальности проведения испытаний на активность в соответствии с используемым насекомым приведены ниже.

LEPTINOTARSA DECEMLINEATA Покрывающая активность.

Личинок второй возрастной стадии кормят молодыми растениями картофеля, обработанными водным раствором лиофилизированного токсина, как описано в примере 1. Условия окружающей среды во время наблюдения следующие: температура составляет 251^оС, относительная влажность составляет 602% Конечное определение смертности осуществляют через 48 ч после заражения; результаты приведены в табл. 4.

Общая активность.

Личинок насекомого второй возрастной стадии кормят молодыми растениями картофеля, которые поддерживаются 12 ч и 24 ч в культуре без почвы, содержащей лиофилизированный препарат в соответствии с примером 1, растворенный при концентрации 200 ppm. По истечении 48-часового периода сохранения личинок в кондиционированной среде, температура 25^оС и относительная влажность 60% в обоих случаях определяют 100%-ную смертность насекомых.

TRIBOLIUM CONFUSUM, TENEBRIO MOLITOR, EPHESTIA KUEHNIELLA Личинок третьей возрастной стадии выращивают при регулируемых условиях, температуре 251^оС, относительной влажности 652% в белой муке с предварительным прибавлением в нее лиофилизированного продукта примера 1. Смертность определяют через 14 дней заражения; результаты приведены в табл. 4.

AEDES AEGYPTI Активность: личинок третьей возрастной стадии переносят в дистиллированную воду, содержащую лиофилизированный препарат примера 1. Личинок сохраняют при регулируемых условиях при температуре 251^оС, относительной влажности 60% и кормят ежедневно. Смертность, приведенную в табл. 4, измеряют через 5 дней после начала обработки.

SPODOPTERA LITTORALIS Покрывающая активность: личинок второй возрастной стадии кормят табачными листьями, обработанными погружением в водный раствор лиофилизированного продукта, описанного в примере 1. Окружающие условия во время наблюдения: температура 251^оС, относительная влажность 602% Определение смертности осуществляют через 5 дней после заражения; результаты приведены в табл. 4.

Для определения активности B. thuringiensis в отношении Coleoptera в качестве стандарта использовали упомянутый препарат 5653, который имеет активность 50000 колор. жидкости МЕ/мг (СРВ 1 Us/mg) (табл. 5).

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var donegani N NCIMB 40152 для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых.

2. Кристаллический пароспоральный белковый токсин, обладающий инсектицидной активностью против жесткокрылых насекомых, полученный путем культивирования штамма бактерий Bacillus thuringiensis var donegani N NCIMB 40152 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, имеющий форму параллелепипеда с квадратным основанием, в верхней и нижней плоскостях которого построены две пирамиды с равными основаниями, размером 1 2 нт, растворимый в воде при нейтральном значении рН и имеющий мол.м. 64000 72000 и 34000 36000 Да, при определении электрофорезом и додецил-сульфат-натрий полиакриламидном геле.

3. Способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми путем обработки растений или почвы, на которой выращивают растения, препаратом, полученным на основе штамма бактерии Bacillus thuringiensis, отличающийся тем, что из штаммов бактерий Bacillus thuringiensis используют штамм бактерий Bacillus thuringiensis var donegani N NCIMB 40152.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3