Фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур

Фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Сущность изобретения. Создана генноинженерная конструкция на основе фрагмента ДНК размером 1737 п.н. из домена альфа-глобиновых генов кур, содрежащего участок прикрепления ДНК к ядерному матриксу, тканенеспефицический энхансер транскрипции, участок начала репликации и конститутивный участок гиперчувствительности к ДНКазе 1. Фрагмент домена расположен на растоянии 4 т. п. н. от альфа-пи глобинового гена кур. Для получения трансгенных животных (кроликов, овец) создана оригинальная генноинженерная конструкция pMTBGHtt, содержащая предложенный фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур. Наличие в геноме животных данной конструкции с исследуемым фрагментом обеспечивало повышение экспрессии гена BGH. Уровень экспрессии BGH у трансгенного кролика с предложенным фрагментом ДНК в половозрелом возрасте составлял в среднем 55 нг/мл против 7,0 нг/мл у кролика без указанного фрагмента. Изобретение применимо в научных исследованиях, а также для получения линий клеток и трансгенных животных - продуцентов фармакологически ценных веществ. 5 ил. 5 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.

Известна конструкция контрольного участка локуса бета-глобиновых генов человека (LCR), обеспечивающая независящую от позиции интеграции высокоэффективную экспрессию интегрированных чужеродных генов. Однако, этот контрольный элемент имеет высокую тканевую специфичность и обеспечивает высокий уровень экспрессии лишь в эритроидных клетках. Кроме того, максимальная активность регуляторного элемента обеспечивается лишь при включении в состав конструкта достаточно длинного (> 10 т. п. н.) фрагмента ДНК из 5'-концевой области домена бета-глобиновых генов [Jarman A.P. Higgs D.R. EMBOJ, 1988, 7: 3337-3344] Технический результат изобретения состоит в том, что предложена генноинженерная конструкция фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур, предназначенный для обеспечения сайт-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках животных, размером 1737 п.н. со следующей последовательностью, (табл.1), содержащий участок прикрепления ДНК к ядерному матриксу, тканенеспецифический энхансер транскрипции, участок начала репликации ДНК и конститутивный участок гиперчувствительности к ДНК-азе 1 (фиг.1). Фрагмент расположен на 5' конце домена альфа-глобиновых генов кур.

На фиг.1 изображена схема домена альфа-глобиновых генов кур: 1 нуклеотидный комплекс МАR; 2 тканенеспецифический энхансер транскрипции, участок начала репликации ДНК; 3 конститутивный участок гиперчувствительности к ДНКазе 1; 4 участки прикрепления к ядерному матриксу; П пи-ген; а^A -альфа D ген; а^D альфа А ген.

на фиг.2 физическая карта вектора pMTk3att, где сайты рестрикции обозначены: Н НindIII, K KpnI, P-PstI, Pv-PvuII, R-EcoRI, S-SacI, BamH сайт предназначен для клонирования чужеродных генов; на фиг.3 физическая карта рекомбинантной плазмиды pMTbGHatt, где сайты рестрикции обозначены: В ВаmHI, K-KpnI, H-HindIII, P-PstI, Pv-PvuII, R-EcoRI, S-SacI; на фиг.4 физическая карта рекомбинантной плазмиды pMTbGHch, где сайты узнавания рестриктазами обозначены: B-BamHI, H-HindIII, K-KpnI, P-PstI, Pv-PvuII, R-EcoRI, S-SacI, Sm-SmaI; на фиг.5: А трансгенный кролик, полученный путем трансплантации зиготы, микроинъецированной рекомбинантной конструкцией pMTbGHatt, Б контрольный кролик.

Нуклеотидная последовательность фрагмента домена содержит множество сайтов связывания с сиквенс-специфическими регуляторными белками, а также гомологи с участками начала репликации папававирусов (SV 40, JC, полиома).

П р и м е р 1. Для проверки энхансерной функции генноинженерной конструкции сконструирована плазмида на основе вектора pUSVL-CAT, содержащего ген бактериальной хлорамфеникол-ацутилтрансферазы (САТ), поздний участок полиаденилирования SV 40 и фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур. Плазмиду, содержащую ген САТ, поздний промотор SV 40 тестируемую последовательность трансфецировали в клетки RAT-1. Через 48 ч определяли количество САТ (отсутствующего в нормальных клетках эукариот) в клеточных лизатах (Васецкий Е. С. Разин С.В. Кварцхава А.И. Гриненко Н.Ф. Георгиев Г.П. Участок начала репликации, расположенный в 5' конце домена -глобиновых генов кур, содержащий энхансер транскрипции. ДАН СССР, 1990, т.313б, с.485-487).

Установлено, что изучаемый фрагмент содержит энхансер, обладающий примерно 2-5% эффективностью по сравнению с энхансером, содержащимся в RSV LTR. В результате субклонирования фрагмента, содержащего энхансер, определено точное положение последовательности ДНК, сохраняющей свойства энхансера. Именно этот фрагмент содержит независимый от транскрипции участок гиперчувствительности к ДНКазе I.

П р и м е р 2. Для получения трансгенных животных была создана оригинальная генно-инженерная конструкция. Исследуемый фрагмент домена альфа-глобиновых генов кур (аtt) выделяли из плазмиды 5НR (Razin S.V. Kekelidze M. G. Lukanidin E.M. Scherrer K. Georgiev G.P.//Nucleic Acids Res 1986. v.14. p 8189-8207) рестриктазами ЕсоRI и HindIII. Затем вектор pMTk3 обрабатывали рестриктазой НindIII, легировали с фрагментом аtt, а после этого обрабатывали Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы, с целью затупить некомплементарные концы легировали. Ориентацию вставки определяли путем обработки рестриктазой PstI. Таким образом был получен вектор pMTk3att (фиг.2).

Следующим этапом было клонирование гена гормона роста быка (bGH) в ВаmHI сайт указанного вектора. В результате была получена рекомбинантная плазмида pMTbGHatt (фиг.3).

П р и м е р 3. Рекомбинантная конструкция pMTbGHatt была использована на кроликах и овцах. Частота интеграции в геном животных при микроинъекции в мужской пронуклеус зигот составляла 3,6-18,2% у кроликов и 5,7% у овец. Наличие в геноме животного использованной конструкции обеспечивало экспрессию гена bGH.

П р и м е р 4. При трансплантации зиготы, микроинъецированной рекомбинантной конструкцией pMTbGHatt получен трансгенный кролик N28. Факт интеграции конструкции установлен с использованием блот-гибридизации и РСR. Гибридизационный анализ проводили с использованием гена bGH в качестве зонда, а в качестве матрицы для амплификации ДНК фрагмента домена альфа-глобиновых генов кур. Рекомбинантная ДНК в количестве трех копий интегрировала в геном животного тандемно, "голова к хвосту".

Определение концентрации bGH в крови животного, экстрактах тканей, органов, культуральной жидкости осуществляли при помощи твердофазного иммуноферментного теста. Количественную оценку bGH в образцах трансгенного кролика N28 проводили относительно аналогичных тканей клинически здоровых нетрансгенных животных-аналогов и трансгенного кролика N80 с интегрированной в геном конструкцией pMTbGHch (фиг.4).

Уровень экспрессии bGH у кролика N28 в половозрелом возрасте составлял в среднем 55,0 нг/мл, у кролика N80 7,0 нг/мл, у контрольного кролика 0 нг/мл.

Выраженная экспрессия bGH была зафиксирована в различных исследованных тканях и клетках культуры ткани органов трансгенного кролика N28 (табл.2). В клетках культуры ткани кролика N 80 уровень экспрессии составлял 7 нг/мл (табл.2).

Как видно из табл.2 содержание bGH приблизительно одинаково во всех исследованных органах за исключением легкого. Однако, в культуре ткани легкого содержание bGH одинаково с содержанием в культуре других органов.

При добавлении в рацион трансгенного кролика N28 ZnSO₄ в количестве 25 mM, уровень экспрессии возрос в 3,6 раза с 55,0 нг/мл до 197,4 нг/мл (табл. 3).

Физическое развитие трансгенного кролика N28 при стандартном рационе кормления соответствовало требованиям первого класса для животных породы шиншилла.

Начиная с 6 месяцев у животного был отмечен прогрессирующий рост лобных костей черепа и конечностей, что к годовалому возрасту привело к характерным для акромегалии изменениям формы головы животного и нарушениям опорно-двигательного аппарата, возникающим при повышенной эндогенной секреции гормона роста (фиг.6). Соответственно этому была увеличена масса отдельных внутренних органов животного (табл. 4). Масса сердца и печени трансгена увеличена приблизительно в 2 раза, масса отдельных органов увеличена примерно на 50% В результате повышенной секреции bGH изменились также биохимические показатели сыворотки крови (табл.5).

Снижение альбумино-глобулинового коэффициента (в 2 раза) при неизменном содержании альбуминов у трансгенного кролика свидетельствует о повышенном содержании глобулинов. Этот признак указывает на цирротические изменения в печени при акромегалии. Уровень холестерина у трансгенного кролика был также значительно повышен (в 3,7 раза) по сравнению с контрольными животными. Среди ферментов, отражающих состояние функции печени, наблюдали значительное снижение активности АЛТ (аланин-аминотрансферазы). Кроме того, у трансгенного кролика значительно повышено соотношение активностей аминотрансфераз АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса). Содержание прямого билирубина у трансгенного кролика в 4 раза выше, чем у контрольных животных, что доказывает нарушение пигменторегулирующей функции печени. Таким образом, у трансгенного кролика N28 наряду с явно выраженной акромегалией, наблюдали изменения в белковом, жировом и пигментном обмене, которые обусловлены значительной экспрессией гена pMTbGHatt.

Изобретение применимо в научных исследованиях, а также для получения линий клеток и трансгенных животных продуцентов фармакологически ценных веществ.

Формула изобретения

ФРАГМЕНТ ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР, предназначенный для обеспечения сайт-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках животных, содержащий участок прикрепления ДНК к ядерному матриксу, тканенеспецефический энхансер транскрипции, участок начала репликации ДНК и конститутивный участок гиперчувствительности к ДНК-азе 1, размером 1737 п.н. со следующей нуклеотидной последовательностью, указанной в описании и расположенный на 5 конце домена альфа-глобиновых генов кур.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8