Способ получения веществ ws 7622 а, в, с и/или d- ингибиторов лейкоцитэластазы человека или их фармацевтически приемлемых солей

Способ получения веществ ws 7622 а, в, с и/или d- ингибиторов лейкоцитэластазы человека или их фармацевтически приемлемых солей

Реферат

 

Использование: фармацевтическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: культивируют штамм Streptomyces resistomyciticus N 7622 (FERM ВР 2306) в жидкой питательной среде и из культуральной среды выделяют вещества WS 7622 А, В, С или D или их фармацевтически приемлемые соли ингибиторы лейкоцитэластазы человека. 12 ил. 6 табл.

Изобретение касается способа получения новых веществ под обозначением WS 7622А, В, С и D, а именно к новым веществам WS 7622А, В, С и D и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим ингибирующим действием на лейкоцитэластазу человека, и способам их получения.

Вещества WS 7622А, В, С и D могут быть получены культивированием в питательной среде штаммов рода Streptomyces, продуцирующих вещества WS 7622А, В, С и D.

Микроорганизм, который может быть использован для получения веществ WS 7622А, В, С и D, относится к продуцирующему эти вещества штамму, принадлежащему к роду Streptomyces, среди которых и недавно выделенный из образца почвы, собранной в Хиронохо, Фукушима-кен (Япония), штамм Streptomyсes resistomycificus N 7622.

Лиофилизованный образец недавно выделенного Streptomyces resistomycificus N 7622 первоначально депонирован при участии Международного депозитарного агентства согласно Будапештскому соглашению Исследовательским институтом ферментации, Агентством промышленных наук и технологии под регистрационным номеpом ГЕРМ ВР-2306 (дата депонирования 23 февраля 1989 г.), но затем этот штамм получил наименование Streptomyces resistomycificus N 7622.

Для Streptomyces resistomycificus характерны следующие морфологические, культуральные, биологические и физиологические показатели. (1) Морфологическая характеристика.

Для таксономных исследований использованы известные методики.

Морфологические наблюдения проведены с помощью оптического и электронного микроскопа на культурах, выращенных при 30^оС в течение 14 дн на овсяном агаре, солодовом агаре с дрожжевым экстрактом и крахмальном агаре с неорганическими солями.

Вегетативный мицеллий развивается хорошо и без фрагментации. Воздушный мицеллий ветвится моноподиально и образует спиральные цепи и прямогибкие цепи спор с более чем 30 спорами на цепь. Споры имеют гладкую поверхность, овальную форму размером 0,7-0,9-0,8-1,1 мкм. Склеротичных гранул, спорангий и зооспор не наблюдается. (2) Культуральная характеристика.

Культуральные показатели наблюдают на десяти типах сред.

Инкубирование ведут 21 день при 30^оС. Использованная в настоящем исследовании цветовая характеристика взята из Справочника цветности Mettmen. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Окраска воздушного мицеллия от голубовато-серой до коричневато-серой. Цвет обратной стороны при росте коричневый на солодовом агаре с дрожжевым экстрактом и овсяном агаре, фиолетово-коричневый на крахмальном агаре с неорганическими солями и серовато-красный на сахаронитратном агаре. Образуются меланоидные пигменты, других растворимых пигментов не обнаружено. (3) Тип клеточной стенки.

Анализ клеточной стенки осуществлен по известным методикам.

Анализ полного клеточного гидролизата штамма N 7622 показывает присутствие L, L-диаминопимелиновой кислоты. Соответственно клеточная стенка данного штамма классифицирована как принадлежащая типу I. (4) Биологические и физиологические свойства.

Физиологические свойства и усвоение источников углерода отражены соответственно в табл. 2 и 3.

Температурный интервал для роста штамма задается на солодовом агаре с дрожжевым экстрактом с помощью инкубатора ТN-3, обеспечивающим температурный градиент.

Усвоение источников углеродов определяют по известной методике.

На основе морфологических и физиологических показателей штамм N 7622 отнесли к роду Streptomyces.

Так, проведено сравнение с разновидностями Streptomyces. В результате обнаружено, что данный штамм очень похож по своим показателям на Streptomyces resistomycificus IF012814. Т. е. найдено, что свойства обоих штаммов почти идентичны за исключением некоторых различий.

В табл. 4 приведены различия между обоими штаммами.

Следовательно, эти различия слишком незначительны для того, чтобы отнести штамм N 7622 к другому виду.

Таким образом, этот штамм идентифицирован как Streptomyces и обозначен как Streptomyces resistomycificus N 7622.

Вещества WS 7622А, В, С и D продуцируются при выращивании в питательной среде, содержащей ассимилирующие источники углерода и азота, в аэробных условиях (например, встряхиваемая культура, погруженная культура и т. п.), принадлежащих к роду Streptomyces штаммов, продуцирующих вещества WS 7622А, В, С и D. Среда может быть искусственной или натуральной.

Рекомендуемыми источниками углерода может служить глюкоза, манноза, глицерин, мелласа, крахмал, гидролизат крахмала и т. п. а рекомендуемыми источниками азота могут служить мясной экстракт, гидролизат казеина, пептон, мука из клейковины, кукурузная мука, мука из жмыха хлопковых семян, соевая мука, раствор после замачивания кукурузы, сухие дрожжи, фосфат аммония, сульфат аммония, мочевина и т. п. В среду могут быть также введены неорганические соли, такие как фосфаты, хлориды, и дpугие соли металлов, например динатрийгидрофосфат, калийдигидрофосфат, карбонат кальция, сульфат железа (II), сульфат магния, сульфат меди, сульфат цинка, хлорид марганца, хлорид магния и т. д. Если в ходе ферментации происходит обильное пенообразование, в среду в приемлемых количествах может быть добавлено пеногасящее средство, такое как растительные масла, например соевое масло, льняное масло и т. д. высшие спирты, например октадеканол.

Ферментацию рекомендуют проводить 50-200 ч при 30^оС.

Из вышеприведенных условий ферментации подбирают оптимальный вариант условий в соответствии с показателями используемого штамма микроорганизма.

Поскольку основная часть полученных таким образом веществ WS 7622А, В, С и D присутствует внутриклеточно в культуре бульона, бульон вначале фильтруют. К полученной мицеллильной лепешке добавляют приемлемый растворитель, такой как ацетон, после чего целевое соединение отделяют от полученной смеси и очищают по методике, обычно применяемой для получения антибиотиков. К примеру, могут быть использованы следующие методики: концентрирование при пониженном давлении, сушка вымораживанием, экстрагирование растворителем, регулирование рН, обработка анионообменной смолой, катионообменной смолой, неионной адсорбирующей смолой и т. д. обработка адсорбирующим средством, таким как активированный уголь, кремниевая кислота, силикагель или окись алюминия, кристаллизация и перекристаллизация как по отдельности, так и в приемлемом сочетании.

Компоненты WS 7622А, В, С и D могут быть выделены из культурального бульона, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих условиях: Колонка: Ямамура Химический институт, Киото, A-302 (OD64^х 150 мм), Подвижная фаза: СH₃OH=CH₃CN=0,3% водн. Н₃PO₄ (10:1:10), Детектирование: 210 нм, Скорость потока: 1 мл/мин, Время удерживания (мин): WS 7622А 6,93, WS 7622В 10,08, WS 7622С 5,3, WS 7622D 4,38.

Образовавшиеся в культуральном бульоне вещества WS 7622А, В, С и D могут быть выделены в свободной форме или при желании в виде соответственно фармацевтической приемлемой соли. Для выделения этих веществ в виде фармацевтически приемлемой соли полученное из мицеллиального экстракта целевое соединение обрабатывают основанием, таким как неорганическое основание, например соединение щелочного металла (например, гидроксид натрия, гидроксид калия и т. д. ), соединение щелочноземельного металла (например, гидроксид кальция, гидроксид магния и т. д.), аммиак, органическое основание (например, триэтиламин, дициклогексиламин и т. д.), или кислотой, такой как неорганическая кислота (например, хлористоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т. д. ) или органическая кислота (например, муравьиная кислота, уксусная кислота, п-толуолсульфокислота, лимонная кислота, щавелевая кислота и т. д.) с получением в результате соответствующей соли каждого из веществ WS 7622А, В, С и D.

Каждая из полученных солей веществ WS 7622А, В, С и D может быть вновь превращена известными способами в свободные вещества WS 7622А. В, С и D.

(1) Вещество WS 7622А Вещество SW 7622А является новым соединением со следующими физико-химическими свойствами. Физико-химические свойства вещества WS 7622А: Внешний вид бесцветные призмы Характер вещества кислый Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода; отрицательные: нингидрин, реактив Молиша Растворимость растворимо: метанол, этанол, н-бутанол плохо растворимо: хлороформ, ацетон этилацетат; не растворимо: вода, н-гексан Тонкослойная хроматография (ТСХ) хлороформ-метанол (5:1 об.(об.) Rf 0,51 ацетон-метанол (10:1) -"- 0,62 (пластинки кизельгель 60 F254 силикагель, Мерк) Температура плавления 250-252^оС (разл. ) Удельное вращение ()_D²³ + 36^о (с 1,0, МеОН) Уф-спектр _max (МеОН) 287 нм ( 3600), _max (MеОН-НСl): 287 нм, _max (МеОН-MaОН): 298 нм Молекулярная формула С₄₇Н₆₃N₉O₁₃ Элементный анализ: Вычислено для С₄₇Н₆₃N₉O₁₃ C 56,56, H 6,77, N 126,3% Найдено: C 56,65, H 6,62, N 12,27% Молекулярная масса: FAB-MSm/z 984(M + Na)⁺ Инфракрасный спектр поглощения (ИК) (см. рис. 1): D _max(КВF): 3400, 3300, 3060, 2980, 2940, 1735, 1710, 1690, 1670, 1660, 1640, 1540, 1520, 1470, 1380, 1330, 1300, 1260, 1220, 1200, 1160, 1130, 1090, 1000, 980, 940, 920 см^-1. Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н(¹Н-ЯМР) (см. фиг. 2) (400 МГц: CD₃OD) 7,22-7,09 (3Н, m), 6,88-6,77 (3Н, m), 6,74 (1H, s), 6,46 (1H, s), 5,46 (1H, m), 5,18 (1H, s), 4,85 (1H, s), 4,77 (1H, m) 4,65 (1H, m), 4,5 (1H, m), 3,96 (1H, m), 3,91 (1H, d, J 9 Гц), 3,6-3,47 (2Н, m), 3,03 (1H, m), 2,9 (3H, S), 2,86 (1H, m), 2,59-2,49 (2H, m), 2,39 (1H, m), 2,29-2,16 (2H, m), 2 (1H, m), 1,84 (1H, m), 1,74 (3H, d, J 6 Гц), 1,72-1,53 (4H, m), 1,44 (3H, d, J6 Гц), 1,12 (1Н, m), 1,1 (6H, d, J 6 Гц), 0,99 (3Н, d, J 6 Гц), 0,94 (3Н, d, J 6 Гц). Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С (¹³С-ЯМР) (см. фиг. 3) (100 МГц, СD₃OD ) 179.7 (s), 176,3 (S), 174,7 (s), 173,3 (s), 172,4 (s), 171,4 (s), 170,3 (s), 165,8 (s), 160,2 (s), 145,7 (s), 145,6 (s), 137,5 (s), 134 ( d), 131,4 (s), 130,6 (d) x 2, 129,8 (s), 129,1 (d) x 2, 129,1 (s), 127,6 (d), 119,1 (d), 118 (d), 76 (d), 73,4 (d), 63,1 (d), 61,4 (d), 57,1 (d), 53,6 (d), 52,7 (d), 50,5 (d), 39,9 (t), 36,1 (t), 35,8 (d), 31,8 (q), 31 (t), 30,8 (d), 29,9 (t), 29,7 (t), 25,2 (t), 22,3 (t), 20,2 (q), 20 (q) x 2, 19,7 (q), 19,5 (q), 13,3 (q).

(2) Вещество WS 7622 В Вещество WS 7622В является новым соединением со следующими физико-химическими свойствами. Физико-химические свойства вещества WS 7622В: Внешний вид бесцветные иглы Характер вещества кислый Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода, хлорид железа (III); отрицательные: нингидрин, реактив Молиша, реактив Драгендорффа Растворимость растворимо: метанол, этанол, н-бутанол; плохо растворимо: хлороформ, ацетон; не растворимо: вода, н-гексан Тонкослойная хроматография (ТСХ) хлороформ-метанол (5:1 об./об.) Rf 0,55 (пластинки кизельгель 60 F254 силикагель, Мерк) Температура плавления 248-250^оС (разл. ) Удельное вращение ()_D²³ + 39^о (с 1,0, МеОН) УФ-спектр _max (МеОН) 287 нм ( 3800), _max (МеОН-НСl): 287 нм, _max (МеОН)-NaОН): 299 нм Молекулярная формула С₄₈Н₆₅N₉O₁₃ Элементный анализ: Вычислено для С₄₈Н₆₅N₉O₁₃ 3H₂O: С 55,96, H 6,95, N 12,24% Найдено: С 55,84, Н 7,05, N 12,12% Молекулярная масса: FAB-MSm /Z 998 (M+ Na)⁺ ИК-спектр (см. фиг. 4) _max (КВF): 3400, 3300, 2960, 1735, 1680, 1660, 1640, 1540, 1520, 1460, 1400, 1380, 1330, 1290, 1250, 1200, 1180, 1150, 1130, 1080, 1050, 1000, 980, 940, 920 cм^-1.

¹Н-ЯМР-спектр (см. фиг. 5) (400 МГц: ДМСО d₆) 9,48 (1Н, шир.s), 9,03 (1Н, шир.s), 8,76 (1Н, шир.S), 8,3 (1Н, шир.d, J6 Гц)7,77(1, Н, d, J 7 Гц), 7,21 (1Н, d, J8 Гц), 7,2-7,11 (3Н, m), 6,97 (1Н, шир. d, J7 Гц), 6,8 (2Н, d, J 8 Гц), 6,72 (1Н, шир. s), 6,67 (1Н, s), 6,63 (1H, q, J 7 Гц), 6,37 (1Н, s), 5,48 (1H, m), 5,4 (1H, m), 5,09 (1H, m), 4,77 (1H, m), 4,64 (1H, m), 4,38 (1H, m), 4,31 (1H, m), 3,87-3,8 (2H, m), 3,4-3,3 (2H, m), 2,95 (1H, m), 2,79 (3H, s), 2,65 (1H, m) 2,4-2-2 (4H, m), 2 (1H, m), 1,87 (1H, m), 1,73 (1H, m), 1,65 (3H, d, J 7 Гц), 1,65-1,4 (5H, m), 1,32 (3H, d, J 6 Гц), 1,27 (1Н, m), 0,97 (3H, d, J 6 Гц), 0,97 (1Н, m), 0,91 (3H, d, J 6 Гц), 0,88 (3H, d, J 6 Гц), 0,81 (3Н, t, J 7 Гц).

¹³С-ЯМР-спектр (см. фиг. 6) (100 МГц, ДМСО d₆) 175,6 (s), 174,8 (s), 172 (s), 170,9 (s), 170,6 (s), 170,3 (s), 168,7 (s), 162,5 (s), 157,4 (s), 144,2 (s), 144,2 (s), 136,5 (s), 131,1 (d), 130,7 (s), 129,6 (d) x 2, 128,4 (s), 127,9 (d) x 2, 127,8 (s), 126,4 (d), 118,9 (d), 116,8 (d), 74,2 (d), 72,1 (d), 61 (d), 59,8 (d), 55,2 (d), 51,6 (d), 50,8 (d), 48,6 (d), 40,9 (d), 38,2 (t), 35 (t), 30,8 (q), 29,8 (t), 28,8 (d), 28,4 (t), 28,1 (t), 27,1 (t), 23,3 (t), 21,2 (t), 19,6 (q), 19,1 (q), 19 (q), 17,7 (q), 12,9 (q), 11,9 (q).

(3) Вещество WS 7622C Вещество WS 7622С является новым соединением со следующими физико-химическими свойствами. Физико-химические свойства WS 7622С: Внешний вид бесцветные иглы Характер вещества кислый Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода, хлорид железа (III); отрицательные: нингидрин, реактив Молиша, реактив Драгендорффа Растворимость растворимо: метанол, этанол; плохо растворимо: хлороформ, ацетон, этилацетат; не растворимо: вода, н-гексан Тонкослойная хроматография (ТСХ) хлороформ-метанол (4:1 об./об) Rf 0,56 (Пластинки с кизельгелем 60 F 254 силикагелем, Мерк) Температура плавления 250-252^о (разл.) Удельное вращение ()_D²³ + 36^о (с 0,5, МеОН) УФ-спектр _max (МеОН) 287 нм ( 3500), _max (МеОН-НСl): 287 нм, _max (МеОН-NаОН) 298 нм Молекулярная формула С₄₆Н₆₁N₉O₁₃ Элементный анализ: Вычислено для С₄₆Н₆₁N₉O₁₃ 6H₂O: С 52,31, Н 6,97, N 11,94% Найдено: С 51,95, Н 6,66, N 11,77% Молекулярная масса: FAB-MSm/Z 970 (M+ Na)⁺ ИК-спектр (см. фиг. 7) (КВF) _max: 3400, 3300, 2980, 1740, 1700, 1660, 1640, 1540, 1470, 1450, 1410, 1335, 1260, 1230, 1200, 1160, 1140, 1070, 1010, 980, 940, 920, 880 см^-1.

¹Н-ЯМР-спектр (см. фиг. 8) (400 МГц, СD₃OD) 7,21-7,1 (3H, m), 6,86-6,77 (3H, m), 6,75 (1H, s), 6,47 (1H, s), 5,46 (1H, m), 5,18 (1H, m ), 4,85 (1H, S), 4,74 (1H, m), 4,65 (1H, m), 4,51 (1H, m), 3,94 (1H, m), 3,9 (1H, d, J 10 Гц), 3,58-3,46 (2H, m), 3,02 (1H, m), 2,9 (3H, s), 2,86 (1H, m), 2,55 (1H, m), 2,38 (1H, d, J 14 и 11 Гц), 2,28 (2H, q, J 7 Гц), 2,3-2,16 (2H, m), 1,99 (1H, m), 1,84 (1H, m), 1,75 (3H, d, J 7 Гц), 1,78-1,54 (4H, m), 1,44 (3H, d, J 6,5 Гц), 1,13 (3H, t, J 7 Гц), 1,12 (1H, m), 1,01 (3H, d, J 6,5 Гц), 0-97 (3H, d, J 6,5 Гц).

¹³С-ЯМР-спектр (см. фиг. 9) (100 МГц, СD₃OD) 176,7(s), 176,4 (s), 174,7 (s), 173,4 (s), 172,5 (s), 171,4 (s), 170,4 (s), 165,8 (s), 160,4 (s), 145,8 (s), 145,7 (s), 137,5 (s), 134 (d), 131,4 (s), 130,6 (d) x 2, 129,8 (s), 129,1 (d) x 2, 129,1 (s), 127,7 (d), 119,1 (d), 118 (d), 76 (d), 73,5 (d), 63,1 (d), 61,4 (d), 57,1 (d), 53,7 (d), 52,7 (d), 50,5 (d), 39,9 (t), 36,1 (t), 31,8 (q), 31 (t), 30,8 (d), 29,9 (t), 29,7 (t), 25,3 (t), 22,3 (t), 20,2 (q), 19,4 (q), 13,3 (q), 10,3 (q).

(4) Вещество WS 7622D Вещество WS 7622D является новым соединением со следующими физико-химическими свойствами. Физико-химические свойства вещества WS 7622D: Внешний вид бесцветные иглы Характер вещества кислый Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода, хлорид железа (III); отрицательные: нингидрин, реактив Молиша, реактив Драгендорффа Растворимость растворимо: метанол, этанол; плохо растворимо: вода, хлороформ; не растворимо: н-гексан Тонкослойная хроматография (ТСХ) хлороформ-метанол (4:1 об./об.) Rf 0,45 (пластинки с кизельгелем 60 F254 силикагелем, Мерк) Температура плавления 250-252^оС Удельное вращение ()_D²⁴ + 35,8^о (c 0,5, МеОН) УФ-спектр (МеОН) _max: 287 нм ( 3640), (МеОН-НСl) _max 287 нм, (МеОН-NаОН) _max 298 нм Молекулярная формула: С₄₅Н₅₉N₉O₁₃ Элементный анализ: Вычислено для С₄₅H₅₉N₉O₁₃ 6H₂O: C 51,86, H 6,87, N 12,10% Найдено: С 51,90, Н 6,26, N 12,08% Молекулярная масса: FAB-MSm/Z 956 (М+ Na)⁺ ИК-спектр (см. фиг. 10) (КВF) _max: 3360, 2950, 1730, 1700, 1680, 1660, 1640, 1530, 1460, 1380, 1330, 1290, 1250, 1200, 1170, 1160, 1140, 1080, 980, 940, 920, 880 см^-1.

¹Н-ЯМР-спектр (см. фиг. 11) (400 МГц, СD₃OD) 7,2-7,1 (3Н, m), 6,85-6,77 (3Н, m), 6,73 (1H, s), 6,46 (1H, s), 5,46 (1H, m), 5,18 (1H, m), 4,84 (1H, s), 4,73 (1H, m), 4,64 (1H, m), 4,5 (1H, m), 3,99-3,87 (2H, m), 3,58-3,46 (2H, m), 3,01 (1H, m), 2,9 (3H, s), 2,87 (1H, m), 2,53 (1H, m), 2,38 (1H, d-d, J 14 и 11 Гц), 2,3-2,16 (2H, m), 2 (1H, m), 1,99 (3H, s), 1,84 (1H, m), 1,75 (3H, d, J 7 Гц), 1,76-1,55 (4Н, m), 1,43 (3H, d, J 6,5 Гц), 1,15 (1H, m), 1 (3H, d, J 6,5 Гц), 0,95 (3H, d, J 6,5 Гц).

¹³С-ЯМР-спектр (см. фиг. 12) (100 МГц, СD₃OD) 176,4 (s), 174,6 (s), 173,4 (s), 173 (s), 172,4 (s), 171,4 (s), 170,4 (S)m 165,8 (s), 160,3 (s), 145,9 (s), 145,9 (s), 137,5 (s), 134 (d), 131,4 (s), 130,6 (d) x 2, 129,8 (S), 129,1 (d) x 2, 129,1 (s), 127,6 (d), 119 (d), 118 (d), 76 (d), 73,5 (d), 63,1(d), 61,3 (d), 57,1 (d), 53,9 (d), 52,7 (d), 50,5 (d), 39,9 (t), 36,1 (t), 31,8 (q), 31 (t), 30,7 (d), 39,9 (t), 39,6 (t), 25,3 (t), 20,2 (q), 19,5 (q), 19,4 (q), 13,3 (q).

Фармацевтически приемлемые соли каждого из веществ WS 7622А, В, С и D включают соли с неорганическими или органическими основаниями, такими как: соль щелочного металла (например, соль натрия, соль калия и т. д.), соль щелочноземельного металла (например, соль кальция и т. д.), соль аммония, соль этаноламина, соль триэтиламина, соль дициклогексиламина и т. п. а также соли, образуемые добавлением органических и неорганических кислот, такие как: метансульфонат, хлоргидрат, сульфат, нитрат, фосфат и т. п.

Вещества WS 7622А, В, С и D и их фармацевтически приемлемые соли обладают ингибирующей активностью по отношению к лейкоцитэластазе человека, и применимы в качестве ингибиторов лейкоцитэластазы человека для лечения некоторых заболеваний, например: эмфиземы легких, атеросклероза, ревматоидного артрита, остеоартрита, псориаза, панкреотита, респираторного дистресс-синдрома у взрослых и т. п.

Для иллюстрации применимости WS 7622А, В, С и D, их производных и их фармацевтически приемлемых солей ниже приведены данные фармакологических испытаний.

Опыты с ингибированием протеазы (1) Получение грубой лейкоцитэластазы человека.

У здорового добровольца отбирают 50 мл крови. Использованием Моно-Поли-разрешающей среды отделяют лейкоциты, которые собирают центрифугированием. Оставшиеся эритроциты лизируют добавлением дистиллированной воды с осаждением и центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин. К полученному осадку добавляют 10 мл 2М NaClO₁₀ и экстрагируют эластазу. После экстрагирования в течение 120 мин при 0^оС центрифугированием получают жидкую часть с эластазной активностью. После добавления к жидкой части равного объема хлороформа и интенсивного встряхивания отделяют прозрачный раствор с эластазной активностью. Прибавляют 10 мл НЕРЕS-буфера и используют в ферментивных испытаниях. (2) Методика.

В ходе испытания используют 0,1М НЕРЕS-буфер (N-(2-гидроксилэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), содержащий 0,5 NaCl, рН 7,5. В ячейках пластины для микротитрования с 96 ячейками смешивают двадцать 25 мкл 2 мМ раствора метоксисукцинил-(Ala)₂-Pro-Val-п-нитроанилида (100 мМ раствор в диметилсульфоксиде, разбавленный буфером) с 50 мкл образца (10 мкл образца в органическом растворителе разбавляют в 5 раз буфером). С помощью микропластинчатого считывающего устройства измеряют поглощение смеси при длине волны 415 нм. После измерения добавляют 25 мкл препарата эластазы мокроты человека (ЭПЧ) в концентрации 6 мкг/мл или 25 мкл препаратa лейкоцитэластазы человека и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После этого измеряют поглощение при 415 нм. Процент ингибирования лекарством определяют по формуле: 100 х (1- "r" в присутствии ингибитора) "r" в отсутствие ингибитора), где "r" поглощение после 30-минутного инкубирования минус поглощение перед добавлением фермента. Действие ингибиторов на другие протеазы определяют аналогично использованием N-сукцинил-(Ala)₂-п-нитроанилида для эластазы поджелудочной железы свиньи (тип IV, конечная концентрация 5 мкг/мл), N-альфа-бензоил-Arg-п-нитроанилида для трипсина поджелудочной железы быка (тип I, конечная концентрация 16 мкг/мл), метоксисукцинил-(Ala)₂-PrO-Met-п-нитроанилида для химотрипсина поджелудочной железы быка (тип II, конечная концентрация 1,5 мкг/мл) и катепсина G мокроты человека (конечная концентрация 10 ед./мл). ЭМЧ и катепсин G получены от Эластин Продакто Сомпани Инк. шт. Монтана, США. Все другие субстраты и протеазы поставлены фирмой Сигма Кемикалз Ко.

Результаты приведены в табл. 5 и 6.

Каждая величина выражена в виде 50%-ной ингибирующей концентрации.

П р и м е р 1 (Получение вещества WS 7622А) В каждую из двенадцати колб Эрленмейера на 500 мл загружают водную посевную среду (200 мл), содержащую 1% растворимого крахмала, 1% сахарозы, 1% глюкозы, 1% фарма-среды (фирменное название муки из хлопковых семян), 0,5% полипептона, 0,5% соевой муки и 0,1% СаСО3, и стерилизуют 30 мин при 120^оС. Каждую из посевных сред заражают петелькой Streptomyces resistomycificus N 7622 на зрелой скошенной культуре. Колбы встряхивают 3 дня при 30^оС с помощью роторных качалок. Полученный посевной культурой заражают 160 л стерильных ферментативных сред, содержащих 4% Пайн-Декс (фирменное название кислотного гидролизата крахмала), 1% муки из клейковины, 0,5% проросшей пшеницы, 0,5% картофельного белка и 0,2% СаСО₃, в сосуде-ферментаторе на 200 л из нержавеющей стали. Ферментацию ведут 5 дн при 25^оС, скорости подачи воздуха 160 л/мин и перемешивании со скоростью 200 об/мин.

Количество вещества WS 7622А в ферментационном бульоне оценивают в испытании на ингибирование эластазы in vitro.

Для испытания образец готовят следующим образом.

При интенсивном перемешивании к бульону добавляют равное количество ацетона. Смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре и затем фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении до необходимого объема. Испытание на ингибирование эластазы описано ранее.

Культуральный бульон (160 л) фильтруют через диатомовую землю и при перемешивании к мицелиальному пирогу добавляют 50 л ацетона. Смесь оставляют примерно на сутки при комнатной температуре и затем фильтруют. Для удаления ацетона фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Фильтрат (140 л) вышеполученного бульона и мицелиальный экстракт объединяют и пропускают через колонку с полимерным адсорбентом Диаионом НР-20. Колонку промывают 50 л воды и 50% -ным водным метанолом (50 л). Концентрированием элюата при пониженном давлении получают маслянистый остаток, который переносят на колонку с силикагелем (Кизельгель 60, 70-230 меш, Мерк, 1,3 л) и хроматографируют. Колонку промывают 2 л смеси н-гексан-этилацетат (1:1 об./об.) и 4 л этилацетата, активное вещество элюируют с колонки ацетоном (3 л) и смесью ацетон-метанол (10:1,6 л). Активные фракции (6 л) соединяют, концентрируют досуха и подвергают колоночной хроматографии на силикагеле со ступенчатым элюированием смесями хлороформа с метанолом в качестве растворителей. Активное вещество элюируется смесью хлороформ-метанол (10:1 об./об.). Концентрированием и высушиванием фракций при пониженном давлении получают 3 г желтого порошка. Вещество WS 7622А выделено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением колонки УМС-D-ODS-15В (30 х 250 мм) из нержавеющей стали, заполненной S-15 окисью кремния в качестве обращенной фазы. В 50 мкл метанола растворяют 50 мг желтого порошка и наносят на колонку для ВЭЖХ с 60%-ным водным метанолом в качестве подвижной фазы при скорости потока 20 мл/мин. Время удерживания вещества WS 7622А 17,6 мин. Хроматограмму воспроизводят 60 раз, содержащие вещество WS 7622А фракции объединяют и концентрируют досуха. Остаток растворяют в небольшом количестве метанола и после выдерживания примерно сутки получают 600 мг вещества WS 7622А в виде бесцветных призм.

П р и м е р 2 (Получение вещества WS 7622В).

В каждую из двенадцати колб Эрленмейера на 500 мл помещают водную посевную среду (200 мл), содержащую 1% растворимого крахмала, 1% сахарозы, 1% глюкозы, 1% фарма-среды (фирменное название муки из семян хлопка), 0,5% полипептона, 0,5% соевой муки и 0,1% СаСО₃ и стерилизуют 30 мин при 120^оС. В каждую из посевных сред вносят для заражения петельку зрелой скошенной культуры Streptomyces resistomycificus N 7622. Колбы встряхивают 3 дня при 30^оС с помощью роторной качалки. Полученной посевной культурой заражают 160 л стерильной ферментационной среды, содержащей 4% Пайн-Декс (фирменное название кислотного гидролизата крахмала), 1% муки из клейковины, 0,5% проросшей пшеницы, 0,5% картофельного белка и 0,2% СаСО₃, в сосуде-ферментаторе из нержавеющей стали на 200 л. Ферментацию ведут 5 дн. при 25^оС, скорости пропускания воздуха 160 л/мин и скорости перемешивали 200 об./мин.

Количество вещества WS 7622В в ферментационном бульоне оценивают в испытании ингибирования эластазы in vitro. Образец для испытания готовят следующим образом.

При интенсивном перемешивании к бульону прибавляют равное количество ацетона, смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре и затем фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении до необходимого объема. Испытание на ингибирование эластазы описано ранее.

Культуральный бульон (160 л) фильтруют через диатомовую землю. При перемешивании к мицелиальному пирогу добавляют 50 л ацетона. Смесь оставляют примерно на сутки при комнатной температуре и затем фильтруют. Для удаления ацетона фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Фильтрат (140 л) из вышеполученного бульона и мицелиальный экстракт объединяют и затем пропускают через колонку с примерным адсорбентом Диаионом НР-20 (фирменное название). Колонку промывают 50 л воды и 50%-ным водным метанолом (50 л), абсорбат элюируют 40 л метанола. Элюат концентрируют при пониженном давлении с получением маслянистого остатка, который переносят на колонку с силикагелем (Кизельгель 60, 70-230 меш, Мерк, 1,3 л) и хроматографируют. Колонку промывают 2 л смеси н-гексан-этилацетат (1:1 об./об.) и 4 л этилацетата, активное вещество элюируют из колонки ацетоном (3 л) и смесью ацетон-метанол (10:16 л). Активные фракции (6 л) объединяют, концентрируют досуха и подвергают колоночной хроматографии на силикагеле со ступенчатым элюированием смесями хлороформ-метанол в качестве растворителей. Активное вещество элюируется смесью хлороформ-метанол (10: 1). Концентрированием фракций и высушиванием при пониженном давлении получают 3 г желтого порошка. Вещество WS 7622В выделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением колонок УМС-D-ODS-15В (30 х 250 мм) из нержавеющей стали, заполненных S-15 окисью кремния в качестве обращенной фазы. В 50 мкл метанола растворяют 50 мг желтого порошка и переносят в ВЭЖХ-колонку вместе с 60%-ным водным метанолом в качестве подвижной фазы при скорости потока 20 мл/мин. Время удерживания вещества WS 7622В 23 мин. Хроматограмму воспроизводят 60 раз, содержащие вещество WS 7622В фракции объединяют, концентрируют и после кристаллизации из метанола получают 180 мг вещества WS 7622В в виде бесцветных игл.

П р и м е р 3 (Получение вещества WS 7622С и D).

Ферментацию проводят по методике примера 1.

К полученному в результате ферментационному бульону (70 л) при перемешивании добавляют 70 л метанола. Смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре и затем фильтруют. К фильтрату добавляют 140 л воды и получают 280 л 25% -ного водного раствора метанола. Раствор пропускают через колонку с полимерным адсорбентом Диаионом НР-20 (фирменное название, 5 л). Колонку промывают 10 л 50%-ного водного метанола и элюируют 10 л метанола. Концентрированием элюата при пониженном давлении получают маслянистый остаток, который переносят в колонку с силикагелем (Кизельгель 60, 70-230 меш, Мерк, 2,2 л) и хроматографируют. Колонку промывают 10 л ацетона, активные вещества элюируют смесью ацетон-метанол (5:1). Собраны следующие фракции элюата: фракция N 1 1 л, фракция N 2 5,4 л, фракция N 3 3,8 л, фракция N 4 3,2 л. Вещества WS 7622С и D элюируются во фракции N 3 и фракции N 4 соответственно.

Выделение вещества WS 7622С.

Концентрированием и высушиванием при пониженном давлении фракции N 3 получают 1,2 г желтого порошка. 1 г содержащего вещество WS 7622С порошка растворяют в 6 мл смеси хлороформ-метанол (10:1) и подвергают колоночной хроматографии на силикагеле (100 мл), предварительно промытой смесью хлороформ-метанол (10:1). Колонку промывают 30 мл смеси хлороформ-метанол (10: 1) и вещество WS 7622С элюируют смесью хлороформ-метанол (5:1). Первые 180 мл элюата отбрасывают, последующие 80 мл собирают и после концентрирования и высушивания при пониженном давлении получают 372 мг порошка. Порошок растворяют в 6 мл этанола и после выдерживания 1 ч при 4^оС получают 170 мг вещества WS 7622С в виде бесцветных игл.

Выделение вещества WS 7622D.

Концентрированием фракций N 4 досуха получают 3,3 г желтого порошка. 1 г содержащего вещество WS 7622D порошка растворяют в 60 мл смеси хлороформ-метанол (20:1) и подвергают хроматографии в колонке с 100 мл силикагеля, предварительно смоченного хлороформом. Колонку промывают 300 мл смеси хлороформ-метанол (20: 1) и 300 мл смеси хлороформ-метанол (10:1), вещество WS 7622D элюируют смесью хлороформ-метанол (5:1). Первые 200 мл элюата отбрасывают, последующие 90 мл собирают и после концентрирования досуха получают 127 мг порошка. Порошок растворяют в небольшом количестве этанола и после выдерживания около суток при 4^оС получают 90 мг вещества WS 7622D в виде бесцветных игл.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ WS 7622 А, В, С И/ИЛИ D-ИНГИБИТОРОВ ЛЕЙКОЦИТЭЛАСТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СОЛЕЙ, заключающийся в том, что культивируют штамм-продуцент Streptomyces resistomycificus N 7622 (FERMBP-2306) в жидкой питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и минеральные соли, культуральную жидкость фильтруют и выделяют целевые продукты или их фармацевтически приемлемые соли со следующими физико-химическими свойствами: Вещество WS 7622А: Внешний вид: бесцветные призмы.

Характер веществ кислотный.

Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары Йода, отрицательные: нингидрин, реактив Молиша.

Растворимость растворимо: метанол, этанол, н-бутанол, плохо растворимо: хлороформ, ацетон, этилацетат, нерастворимо: вода, н-гексан.

Тонкослойная хроматография (ТСХ): хлороформ-метанол (5:1 об./об.) Rf 0,51, ацетон-метанол (10:1 об./об.) Rf 0,52, пластинки с кизельгель 60, F254 силикагелем, Мерк.

Температура плавления 250-252^oС (разл.).

Удельное вращение ()²_D³+36 (концентрация 1,0 MeOH).

УФ-спектр (MeOH) _max:287нм(=3600),(MeOH-HCl)_max: 287 нм, (MeOH-NaOH) _max:298нм. Молекулярная формула: C₄₇H₆₃N₉O₁₃.

Элементный анализ: выч.для C₄₇H₆₃N₉O₁₃ 2H₂O C 56,56, H 6,77, N 12,63% найдено: C 56,65, H 6,62, N 12,27% Молекулярная масса FAB MSm/z 984 (M + Na)⁺.

Инфракрасный спектр поглощения (КВГ) _max 3400, 3300, 3060, 2980, 2940, 1735, 1710, 1690, 1670, 1660, 1640, 1540, 1520, 1470, 1380, 1330, 1300, 1260, 1220, 1200, 1160, 1130, 1090, 1000, 980, 940, 920 см^-1.

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н/400 МГц, CP₃OD/ 7,22-7,09 (3H, m), 6,88 6,77 (3H, m), 6,74 (1H, s), 6,46 (1H, s), 5,46 (1H, m), 5,18 (1H, s), 4,85 (1H, s), 4,77 (1H, m), 4,65 (1H, m), 4,5 (1H, m), 3,96 (1H, m), 3,91 (1H, d, J=9Гц), 3,6-3,47 (2H, m), 3,03 (1H, m), 2,9 (3H, s), 2,86 (1H, m), 2,59-2,49 (2H, m), 2,39 (1H, m), 2,29-2,1 (2H, m), 2(1H, m), 1,84 (1H, m), 1,74 (3H, d J=9Гц), 1,72-1,53 (4H, m), 1,44 (3H, d, J= 6гц), 1,12 (1H, m), 1,1 (6H, d, j=6Гц), 0,99 (3H, d, J=6Гц), 0,94 (3H, d, J= 6Гц).

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С/100 МГц, CD₃OD/ 179,7 (s), 176,3 (s), 174,7 (s), 173,3 (s), 172,4 (s), 171,4 (s), 170,3 (s), 165,8 (s), 160,2 (s), 145,7 (s), 145,6 (s), 137,5 (s), 134 (d), 131,4 (s), 130,6 (d) 2, 129,8 (s), 129,1 (d) 2, 129,1 (s), 127,6 (d), 119,1 (d), 118 (d), 76 (d), 73,4 (d), 63,1 (d),61,4 (d), 57,1 (d), 53,6 (d), 52,7 (d), 50,5 (d), 39,9 (t), 36,1 (t), 35,8 (d), 31,9 (q), 31 (t), 30,8 (d), 29,9 (t), 39,7 (t), 25,2 (t), 22,3 (t), 20,2 (q), 20 (q) 2, 19,7 (q), 19,5 (q), 13,3 (q).

Вещество WS 7622В: Внешний вид бесцветные иглы.

Характер вещества кислотный.

Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода, хлорид железа (III), отрицательные: нингидрин, реактив Молиша, реактив Драгендорффа.

Растворимость растворимо: метанол, этанол, н-бутанол, плохо растворимо: хлороформ, ацетон, нерастворимо: вода, н-гексан.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) хлороформ-метанол (5:1 об./об.) Rf 0,55, пластинки с кизельгелем 60, F 254 силикагелем, Мерк.

Температура плавления 248-250^oС (разл.).

Удельное вращение ()²_D³+39 (концентрация 1,0 MeOH).

УФ-спектр (MeOH) _max 287hm, (=3800),, (MeOH-HCl) _max 287hm, (MeOH-NaOH) _max 299hm.

Молекулярная формула: C₄₈H₆₅N₉O₁₃.

Элементный анализ: выч.для C₄₈H₆₅N₉O₁₃ 3H₂O C 55,96, H 6,95, N 12,24% найдено: C 55,84, H 7,05, N 12,12% Молекулярная масса FAB-MSm/z 998 (M+Na)⁺.

Инфракрасный спектр поглощения (KBF) _max 3400, 3300, 2960, 1735, 1680, 1660, 1640, 1540, 1520, 1460, 1400, 1380, 1330, 1290, 1250, 1460, 1400, 1380, 1330, 1290, 1250, 1200, 1180, 1050, 1000, 980, 940, 920 см^-1.

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С/400 Мгц, ДМСО- d₆/: 9,48(1Н, шир. s), 9,03(1Н, шир.s), 8,76(1Н, шир.s), 8,3(1Н, шир.d, J=6Гц), 7,77(1Н, d, J=7 Гц), 7,21(1Н, d, J=8Гц), 7,2-7,11(3Н,m), 6,97(1Н, шир.d, J=7 гц), 6,8 (2Н, d, J=8 Гц), 6,72(1Н, шир.s), 6,67(1Н, s), 6,63(1Н, q, J=7 Гц), 6,37 (1Н, s), 5,48(1Н, m), 5,4(1Н, m), 5,09(1Н,m), 4,77(1Н,m), 4,64(1Н, m), 4,38(1Н, m), 4,31(1Н, m), 3,87-3,8(2Н, m), 3,4-3,3(2Н, m), 2,95(1Н,m), 2,79(3Н, s), 2,65(1Н, m), 2,4-2,2(4Н, m), 2(1Н,m), 1,87(1Н,m), 1,73(1Н,m), 1,65(3Н, d, J= 7 Гц), 1,65-1,4(5Н, m), 1,32(3Н, d, J=6 Гц), 1,27(1Н,m), 0,97(3Н, d, J=6 Гц), 0,97(1Н, m), 0,91(3Н, d, J=6 Гц), 0,88(3Н, d, J=6 Гц), 0,81(3Н, t, J=7 Гц).

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С/100 МГц, ДМСО d₆/: 175,6(s), 174,8(s), 172(s),170,9(s),170,6(s), 170,3(s), 168,7(s), 162,5(s), 157,4(s), 144,2(s), 144,2(s), 136,5(s), 131,1(d), 130,7(s), 129,6(d) 2, 128,4(s), 127,9(d) 2, 127,8(s), 126,4(d), 118,9(d), 116,8(d), 74,2(d), 72,1(d), 61(d), 59,8(d), 55,2(d), 51,6(d), 50,8(d), 48,6(d), 40,9(d), 38,2(t), 35(t), 30,8(q), 29,8(t), 28,8(d), 28,4(t), 28,1(t), 27,1(t), 23,3(t), 21,2(t), 19,6(q), 19,1(q), 19(q), 17,7(q), 12,9(q), 11,9(q).

Вещество WS 7622С: Внешний вид бесцветные иглы.

Характер вещества кислотный.

Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода, хлорид железа (III), отрицательные: нингидрин, реактив Молиша, реактив Драгендорффа.

Растворимость растворимо: метанол, этанол, плохо растворимо: хлороформ, ацетон, этилацетат, нерастворимо: вода, н-гексан.

Тонкослойная хроматография (ТСХ): хлороформ-метанол (4:1 об./об.)Rf 0,56 (пластинки с кизельгелем 60, F 254 силикагелем, Мерк).

Температура плавления 250-252^oС (разл.).

Удельное вращение (/²_D³+36 (концентрация0,5, MeOH).

УФ-спектр (MeOH) _max 287 нм (=3500), (MeOH-HCl) _max 287 hm, (MeOH-NaOH) _max 298 hm.

Молекулярная формула C₄₆H₆₁N₉O₁₃.

Элементный анализ: выч.для C₄₆H₆₁N₉O₁₃ 6H₂O C 52,31, H 6,97, N 11,94% найдено: C 51,95, H 6,66, N 11,77% Молекулярная масса: FAB MSm/Z 970/M+Na/⁺ Инфракрасный спектр поглощения (KBF) _max 3400, 3300, 2980, 1740, 1700, 1660, 1640, 1540, 1470, 1450, 1410, 1335, 1260, 1230, 1200, 1160, 1140, 1070, 1010, 980, 940, 920, 880 см^-1.

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н/400 МГц, CD₃OD/ 7,21-7,1(3Н, m), 6,86-6,77(3Н, m), 6,75(1Н, s), 6,47(1Н, s), 5,46(1Н,m), 5,18(1Н, m), 4,85(1Н, s), 4,74(1Н, m), 4,65(1Н,m), 4,51(1Н,m), 3,94(1Н,m) 3,9(1H, d, J= 10Гц), 5,58-3,46(2Н, m), 3,02(1Н, m), 2,9(3Н,s), 2,86(1Н,m), 2,55(1Н, m), 2,38(1Н, d,J=14 и 11 Гц), 2,28(2Н, q, J=7 Гц), 2,3-2,16(2Н,m), 1,99(1Н,m), 1,84(1Н,m), 1,75(3H,d,J=7 Гц), 1,78-1,54(4Н,m), 1,44(3Н,d, J=6,5 Гц), 1,13(3Н, t, J=7Гц), 1,12(1H,m), 1,01(3H, d, J=6,5 Гц), 0,97(3H, d J=6,5 Гц).

Спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹³С/100 МГц, CD₃OD/ 176,7(s), 176,4(s), 174,7(s), 173,4(s), 172,5(s), 171,4(s), 170,4(s), 165,8(s), 160,4(s), 145,8(s), 145,7(s), 137,5 (s), 134 (d), 131,4(s), 130,6(d) 2, 129,8(s), 129,1(d) 2, 129,1 (s), 127,7 (d), 119,1 (d),118 (d), 76(d), 73,5(d), 63,1(d), 61,4(d), 57,1(d), 53,7(d),52,7(d), 50,5(d), 39,9(t), 36,1(t), 31,8(q), 31(t), 30,8(d), 29,9(t), 29,7(t), 29,7(t), 25,3(t), 22,3(t), 20,2(q), 19,4(q), 19,4(q), 13,3(q), 10,3(q).

Вещество WS 7622D: Внешний вид бесцветные иглы.

Характер вещества кислотный.

Цветные реакции положительные: сульфат церия, пары йода, хлорид железа (III), отрицательные: нингидрин, реактив Молиша, реактив Драгендорффа.

Растворимость растворимо: метанол, этанол, плохо растворимо: вода, хлороформ, нерастворимо: