Штамм бактерий pseudomonas putida - биостимулятор роста растений

Штамм бактерий pseudomonas putida - биостимулятор роста растений

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового биологического средства для стимуляции роста сельскохозяйственных растений, а именно получения бактериального штамма, обладающего этим свойством. Штамм P. putida ВКПМВ-4308 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика" за N ВКПМВ-4308. Штамм стимулирует рост технических, зерновых и овощных культур, обеспечивая высокие темпы их роста, достигающие в отдельных случаях 4 - 6 раз. Штамм не фитотоксичен, не патогенен по отношению к растениям, не снижает всхожести семян, хорошо сохраняется в почве и ризосфере растения, может размножаться в этих условиях. Стимулирующий эффект достигается путем замачивания семян растений в суспензии штамма в концентрации 1,5 10⁶ - 1,5 10^-7 клеток на 1 г семян. 7 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового биологического средства для стимуляции роста сельскохозяйственных растений, а именно получения бактериального штамма, обладающего этим свойством.

Известен штамм Agrobacterium radio-bаcter, на основе которого получен препарат, стимулирующий прорастание семян томата, а также их дальнейшее развитие. Существенным недостатком этого штамма является то, что он может легко приобретать вирулентные свойства и вызывать раковые заболевания двудолевых растений после переноса в его клетки онкогенной Ti-плазмиды из близкородственных вирулентных штаммов Agrobacterium tumefaciens. При этом процесс передачи онкогенного фактора (Ti-плазмиды) в клетки Agrobacterium radiobacter может происходить при контакте штаммов в почве или на растении.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является выбранный в качестве прототипа штамм Pseudomonas B 10, стимулирующее действие которого обусловлено продукцией желто-зеленого флуоресцирующего пигмента и проявляется после обработки семенного материала суспензией этого штамма. Бактерии штамма Pseudomonas В10 обладает способностью размножаться в ризосфере (прикорневой зоне) растения, для синтеза стимулятора не требуют дополнительных факторов роста. Однако биостимулирующая способность штамма проявляется в отношении того растения, из ризосферы которого он был первоначально выделен, а именно культуры картофеля.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий P.putida ВКПМВ-4308, являющегося биостимулятором роста сельскохозяйственных культур и обладающего более широким спектром стимулирующего действия.

Штамм идентифицирован как P. putida ВКПМВ-4308 согласно определению Bergey's.

Штамм P. putida ВКПМВ-4308 хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИ Генетика N ВКПМВ-4308.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки штамма.

Клетки прямые, палочковидной формы с округленными концами 0,6 2-3 , подвижные, грамотрицательные, спор не образуют.

Культуральные признаки.

Колонии на питательных средах гладкие, плоские, круглые, край ровный, серовато-белые. В жидких питательных средах образуют интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатные аэробы; температура роста 28-30^оС, рН среды в пределах 6,8-7,3. Азот утилизируют в виде солей аммония, мочевины, нитратов.

Пигменты.

Образуют желто-зеленый водорастворимый флуоресцирующий пигмент. Внутриклеточных пигментов не образуют.

Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Индол не образуют. Аммиак образуют. Сероводород не выделяют. На питательных средах, содержащих 5 процентный раствор сахарозы, леван не образуют. Лецитиназная активность отсутствует.

Крахмал, желатин, Твин-80 не гидролизуют.

В качестве источников углерода используют глицерин, глюкозу, мальтозу, фруктозу, этанол, бутанол, метанол, сукцинат, ацетат, малонат, лактат, цитрат, пируват, мочевину, формиат, бензиламин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аргинин, пролин, тирозин, фенилаланин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, орнитин, гистидин, глицин. Не утилизируют сорбит, целлобиозу, дульцит, лактозу, рамнозу, инозит, маннит, ксилозу, арабинозу, маннозу, лактозу, раффинозу, серин, треонин, норлейцин, никотинат, ацетамид, креатин, триптамин, триптофан.

Условия хранения культуры.

Культуру штамма P.petida ВКПМВ-4308 хранят на косяках с мясо-пептонным агаром при 4^оС с периодическими пересевами через месяц.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 продуцирует желто-зеленый флуоресцирующий пигмент с максимумом поглощения при 210 и 403 нм. Продукцию пигмента в жидких средах учитывают визуально по желто-зеленому окрашиванию среды, либо спектрофотометрически по характерному спектру поглощения. Для спектрофотометрического анализа используют культуральную жидкость, освобожденную от бактериальных клеток путем центрифугирования (5000 об/мин, 15 мин). На агаризованных средах синтез пигмента определяют визуально по характерному окрашиванию среды в зоне диффузии пигмента в агар вокруг колонии штамма-продуцента. При облучении чашек УФ-светом (длина волны 254 нм) в этой зоне наблюдают флуоресцирующий пигмент.

Биостимулирующая рост растений активности штамма P.putida ВКПМВ-4308 обусловлена продукцией флуоресцирующего пигмента. У мутантов, дефектных по синтезу флуоресцирующего пигмента, биостимулирующая активность отсутствует.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 не патогенен для растений. Патогенность штамма проверяют с помощью реакции сверхчувствительности по методу Klement на листьях табака (Nicotina tabacum L) сорта Трапезунд. Суспензию клеток штамма (10⁸ клеток в 0,5 мл) в стерильной дистиллированной воде вводят шприцем под кожицу листа. Реакцию регистрируют через 24 ч и 48 ч. Реакция сверхчувствительности у бактерий P.putida ВКПМВ-4808 отрицательная.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 не фитотоксичен. Фитотоксичность штамма проверяют экспресс-методом на культуре хлореллы (Chlorella vulgaris). Для этого суспензию клеток хлореллы с стерильной дистиллированной водой вносят в концентрации 10⁶ клеток/мл в расплавленную и охлажденную до 45^оС агаризованную среду с глюкозой (0,2% ) и разливают в чашки Петри. Бактерии P.putida ВКПМВ-4308 засевают в виде "пятна" диаметром 0,5 см по центру чашки и культивируют в течение 24 ч при 28^оС, после чего чашки помещают в светотеплицу и инкубируют на свету при той же температуре в течение 3 сут. для роста хлореллы. Отсутствие зон задержки роста хлореллы вокруг колонии штамма P.putida ВКПМВ-4308 свидетельствует о его нетоксичности для растений.

Штамм P. putida ВКПМВ-4308 не снижает всхожести семян сельскохозяйственных растений. Для проверки семена различных растений замачивают в суспензии штамма в концентрации 10⁷ клеток на 1 г сухих семян, помещают во влажную камеру в светотеплицу и проращивают в течение 3-10 дней в зависимости от вида испытуемых растений. В качестве контроля семена замачивают в дистиллированной воде. Всхожесть семян после обработки суспензией штамма P.putida ВКПМВ-4308 по сравнению с контролем составляет 100% Штамм P.putida ВКПМВ-4308 размножается в почве и сохраняется в этих условиях в течение длительного времени. Для проверки в нестерильную почву (рН почвы 6,0) вносят суспензию штамма в концентрации 10⁶ клеток на 100 г почвы. Через определенные промежутки времени производят высев суспензии почвы (1 г на 5 мл дистиллированной воды) на питательную среду и после культивирования в течение двух суток при 28^оС подсчитывают число находящихся в почве бактерий P.putida ВКПМВ- 4308. Результаты испытаний приведены в табл.1.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 размножается в ризосфере растений.

Семена растений замачивают в суспензии штамма в концентрации 10⁷ клеток на 1 г сухих семян в течение 24 ч. Затем обработанные семена каждого растения высаживают в нестерильную почву (рН 6,0) помещают в светотеплицу и выращивают в течение 10-20 сут. при 20-22^оС. Затем осуществляют подсчет числа жизнеспособных клеток штамма P.putida ВКПМВ-4308 на корнях растений. Для этого корешки растений помещают в пробирку с дистиллированной водой (1 г на 5 мл воды), встряхивают и производят высев полученной суспензии на питательную среду. Через двое суток подсчитывают число выросших бактерий штамма P.putida ВКПМВ-4308. Результаты испытаний приведены в табл. 2.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 стимулирует рост растений.

Стимулирующее действие штамма испытывают на различных сельскохозяйственных растениях после замачивания семян в суспензии штамма в концентрации 1,510⁶-1,510⁷ клеток на 1 г семян и последующего проращивания их в течение 5-10 сут. во влажной камере в светотеплице при 20-22^оС на фильтровальной бумаге в чашках Петри (лабораторных условиях), а также в условиях закрытого грунта после высадки замоченных в суспензии штамма семян непосредственно в почву (рН 6,0) и выращивания их в течение 10-20 дней при этой же температуре. В контрольных экспериментах замачивание семян осуществляли в воде. Через определенный интервал времени производят замеры стебля и корневой системы растения. В случае разветвленных стеблей и мочковатой корневой системы производят взвешивание отдельно надземной и подземной частей растения. Стимуляцию роста определяют при сопоставлении размеров (или веса) растений (по 200 штук) в опыте и в контроле.

Стимулирующее действие штамма P.putida ВКПМВ-4308 в лабораторных условиях зарегистрировано в отношении 9 технических культур: люпина, сои, фасоли, вики, чумизы, тыквы, клевера и рапса. Прибавка роста составляет для корневой системы 1,2-3,5 раза и 1,1-3,6 раза для проростков в зависимости от вида растения.

Стимулирующее действие штамма P.putida ВКПМВ-4308 в лабораторных условиях зарегистриpовано также для 7 зерновых культур: кукурузы, овса, пшеницы, ячменя, проса, ржи и гречихи. Прибавка роста корневой системы в этом случае соответствует 1,8-5,3 раза, а проростков от 1,3 до 2,3 раза в зависимости от вида растения.

Стимулирующее действие штамма P.putida ВКПМВ-4308 проявляется также в лабораторных условиях в отношении ряда овощных культур: томатов, редиса, огурцов, салата, свеклы и картофеля (всего 8 культур). При этом прибавка роста корневой системы составляет 1,8-6,3 раза, а проростков в 1,2-3,1 раза в зависимости от вида растения.

Штамм P.putida ВКПМВ-4308 оказывает стимулирующее действие на рост растений в условиях закрытого грунта. Рост корневой системы технических и зерновых культур стимулируется в 1,2-4,1 раза, а проростков в 1,2-6,1 раза. Наибольший стимулирующий эффект в условиях закрытого грунта наблюдается для овощных культур рост корневой системы растений увеличивается в 2,4-4,3 раза, а проростков в 1,8-4,3 раза в зависимости от вида растения.

Стимулирующая рост растений активность штамма P.putida ВКПМВ-4308 иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Готовят суспензию штамма P.putida ВКПМВ-4308 в дистиллированной воде путем смыва с косяков суточной культуры, выращенной на питательной среде, приготовленной на основе рыбного гидролизата (28 г сухого питательного агара Дагестанского НИИ питательных сред на 1000 мл воды). Полученной суспензией обрабатывают семена технических культур люпина (2 сорта), сои, фасоли, вики, чумизы, тыквы, клевера и рапса (в концентрации 1,510⁶ клеток на 1 г сухих семян) путем их замачивания на фильтровальной бумаге в чашках Петри и проращивания в этих условиях в течение 9-10 сут. во влажной камере в светотеплице при 20-22^оС. В контрольных экспериментах семена замачивают в дистиллированной воде и затем проращивают в тех же условиях. После этого измеряют длину корешков и проростков растения, либо определяют его вес. Для испытаний берут по 200 растений из опытной и контрольной серии для каждого вида испытуемой технической культуры. Результаты измерений приведены в табл.3.

П р и м е р 2. Приготовление суспензии штамма P.putida ВКПМВ-4308, обработку семян и учет результатов производят как в примере 1 за исключением того, что для испытания стимулирующего действия штамма используют семена зерновых культур кукурузы, овса, пшеницы, ячменя, проса, ржи и гречихи. Результаты измерений приведены в табл. 4.

П р и м е р 3. Приготовление суспензии штамма P.putida ВКПМВ-4308, обработку семян и учет результатов производят как в примере 1 за исключением того, что концентрация бактерий для обработки соответствует 1,510⁷ клеток на 1 г сухих семян и для испытания стимулирующего действия штамма используют семена овощных культур томатов, редиса (2 сорта), огурцов (2 сорта), салата, свеклы и картофеля. Результаты измерений приведены в табл. 5.

П р и м е р 4. Приготовление суспензии штамма P.putida ВКПМВ-4308, обработку семян и учет результатов производят как в примере 1, за исключением того, что концентрация бактерий для обработки соответствует 1,510⁷ клеток на 1 г сухих семян, после замачивания семян в суспензии штамма в течение суток их высаживают в почву (рН 6,) в условиях закрытого грунта и выращивают с периодическим поливом водой в течение 20 дней при 20-22^оС, для испытания стимулирующего действия штамма в условиях закрытого грунта используют семена технических и зерновых культур люпина, ячменя, пшеницы, проса, ржи, овса, кукурузы и гречихи. Результаты измерений приведены в табл. 6.

П р и м е р 5. Приготовление суспензии штамма P.putida ВКПМВ-4308, обработку семян и учет результатов производят как в примере 4, за исключением того, что для испытания стимулирующего действия штамма в условиях закрытого грунта используют семена овощных культур редиса, томатов, огурцов (2 сорта). Результаты измерений приведены в табл. 7.

Штамм P. putida ВКПМВ-4308 стимулирует рост технических, зерновых и овощных культур в лабораторных условиях и условиях закрытого грунта, обеспечивая высокие темпы их роста. Преимущества штамма P.putida ВКПМВ-4308 по сравнению с прототипом состоят в том, что он способен стимулировать рост широкого круга сельскохозяйственных культур, причем стимулирующий эффект в отдельных случаях достигает 6 раз (у прототипа не более 2 раз). Штамм не фитотоксичен, не патогенен по отношению к растениям, не снижает их всхожести, хорошо сохраняется в почве и ризосфере растений, может размножаться в этих условиях.

Таким образом, штамм P.putida ВКПМВ-4308 является универсальным биостимулятором растений и может широко использоваться для усиления роста различных сельскохозяйственных культур.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В - 4308 - биостимулятор роста растений.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5