Способ определения биологической активности -эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis

Способ определения биологической активности -эндотоксинов различных патотипов bacileus thuringiensis

Реферат

 

Использование: микробиологическая промышленность, определение биологической активности d - эндотоксинов. Bacilluc thuringiensis. Сущность изобретения: берут суспензию спор и кристаллов Bac. thuringiensis, промывают водой, раствором поваренной соли, смесью ацетона с водой в соотношении 2 : 3, удаляют нерастворимые компоненты центрифугированием, затем кристаллы растворяют щелочью NaOH, осаждают d - эндотоксины добавлением уксусной кислоты при pH 4,0 - 6,5. Полученный осадок растворяют в буфере при pH 8,5 - 9,0, определяют количество белка спектрофотометрически. Отбирают растворы с концентрацией белка 65 - 250 мкг/мл и вносят на агаризованные среды, засеянные тест - микроорганизмом, например, Micrococcus flavus, Aspergillus terreus инкубируют, определяют антибактериальную активность и по ней судят о биологической активности. 1 табл.

Изобретение относится к способам определения биологической активности различных -эндотоксинов гликопротеинов параспоральных кристаллов B.thuringiensis и может быть применено в микробиологии, биотехнологии.

Известен способ определения биологической активности параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, токсичных для жесткокрылых насекомых, путем скармливания личинкам колорадского жука Leptinotarsa decemineata I возраста дисков из листьев картофеля, смоченных суспензией кристаллов различной концентрации, и оценки ЛК₅₀ через определенный промежуток времени (3 сут). Метод требует использования личинок определенных насекомых единственной стадии развития, высокочувствительных к данному -эндотоксину, а также листьев картофеля, может применяться для определения биологической активности -эндотоксинов только одного патотипа -С.

Способ имеет следующие недостатки: 1, Невысокая экономичность способа.

2. Невысокая чувствительность способа.

3. Сезонность применения способа из-за трудности выращивания тест-объектов и корма для них в определенное время года.

Известен способ определения биологической активности параспоральных кристаллов B.thuringiensis subspp. insectus, galleriae, alesti, dendrolimus, токсичных для чешуекрылых насекомых, основанный на регистрации уменьшения привеса гусениц Galleria mellonella, получающих -эндотоксины вместе с кормом. Кристаллы растворяют в щелочи, определяют концентрацию белка в растворе по методу Лоури, добавляют к сухому корму для гусениц раствор белка, взвешивают гусениц через 1,2,5 сут, учитывая уменьшение их привеса по сравнению с контролем из-за прекращения питания под действием -эндотоксинов.

Способ имеет следующие недостатки: 1. Длительность и громоздкость способа.

2. Невысокая экономичность способа.

3. Ограниченность применения способа определением биологической активности растворов параспоральных кристаллов патотипа А.

4. Невысокая точность способа, не учитывающего изменение специфичности действия различных -эндотоксинов на разных насекомых.

Известен способ определения биологической активности -эндотоксинов кристаллов B.thurindiensis, токсичных для чешуекрылых насекомых, путем определения антибактериальной активности их растворов, который целесообразно принять за прототип. Промытые кристаллы (можно в смеси со спорами) растворяют в щелочных условиях в буфере с роданидом калия и дитиотреитолом, высокомолекулярную фракцию очищают гель-фильтрацией и вносят в агаризованную среду для роста тест-микроорганизма в лунки; определяют зоны подавления роста через 36-48 ч пребывания агара во влажной камере и последующей 15-24-часовой инкубацией при 30^оС.

Прототип имеет следующие недостатки: 1. Длительность и громоздкость способа.

2. Невысокая экономичность способа.

3. Ограниченность применения способа определением биологической активности параспоральных кристаллов патотипа А.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение, повышение экономичности способа, расширение границ его применения.

Цель достигается тем, что параспоральные кристаллы B.thuringiensis патотипов А и С, полученные при выращивании культур эндомопатогенных бактерий (например, B.thuringiensis sspp. thuringiensis, kurstaki, dendrolimus, galleriae, alesti, tenebrionis и др.) на средах любого известного состава, отмывают от адсорбированных на их поверхности примесей водой, IM NaCl, смесью ацетон: вода (2:3) и снова дистиллированной водой. Затем кристаллы (можно в смеси со спорами) растворяют в 0,015-0,035 н.NaCl 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием (на качалке при 250 об./мин), осаждают -эндотоксины из подкисленного уксусной кислотой до рН 4-6,5 супернатанта центрифугированием (при 12-15 тыс.об./мин 20 мин) на холоду, осадок перерастворяют в буфере (например, 0,01 М фосфатно-цитратном) при рН 8,5-9, немедленно устанавливают количество -эндотоксинов в единице объема исследуемого образца спектрофотометрически, определяют и сравнивают биологическую активность растворов -эндотоксинов с известной концентрацией по скорости агрегации клеток тест-микроорганизма (предварительно выращенного в питательной среде с добавлением 0,1-1% полиэтиленгликоля 600 и 510^-4-10^-3 М ЭДТА) в буфер или методом диффузии в агар с 0,2-0,4% твина.

Так, из данных, представленных в таблице видно, что предлагаемый способ позволяет определять и сравнивать в течение от нескольких часов до одних суток биологические активности -эндотоксинов B.thuringiensis патотипов А и С, благодаря тому, что -эндотоксины влияют на клетки микроорганизмов не с такой высокой специфичностью, как на клетки насекомых, хотя природа действия -эндотоксинов на клетки разных тест-объектов одинакова (4, 5).

Метод удобно и выгодно применять при контроле биологической активности основных токсикологических компонентов бактериальных инсектицидов -эндотоксинов, в процессе их разработки, производства, хранения.

П р и м е р 1. Берут 5 мл суспензии спор и кристаллов B.thuringiensis ssp. dendrolimus, полученных при выращивании бактерий на среде, содержащей 2,5% дрожжей БВК и 2,5% кукурузной муки. Остатки твердых компонентов среды осаждают центрифугированием при 2 тыс. об./мин. 3 мин. Кристаллы отделяют от спор известным способом, промывают в воде, 1 М NaCl, смеси ацетон:вода (2:3) и снова в воде 3 раза. При промывании кристаллы осаждают центрифугированием при 12 тыс. об/мин. 10 мин. Промытые кристаллы помещают в колбу с 50 мл 0,015 н.NaOH, растворение проводят при комнатной температуре на качалке (250 об. /мин. ) 1 ч. Из супернатанта после центрифугирования при 12 тыс. об/мин. 20 мин осаждают -эндотоксины путем подкисления до рН 4 уксусной кислотой, выдерживают при 4^оС 15 мин, осаждают при 12 тыс.об./мин. 30 мин с охлаждением. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатно-цитратной буферной системе рН 8,5 и определяют количество белка спектрофотометрически. Затем из исходного раствора получают путем разведения в таком же буфере растворы с поглощением в УФ-области при 280 нм 0,2; 0,1; 0,05, что соответствует примерно концентрации -эндотоксинов 250, 130, 65 мкг/мл. Эти растворы вносят по 20 и 40 мкл в заранее подготовленные подсушенные лунки в агаризованном разбавленном в 3 раза бульоне Хоттингера с 0,2% твина, засеянном газоном тест-микроорганизма Micrococcus flavus, оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч, затем инкубируют при 37^о 16 ч и определяют антимикробную активность по диаметру зон подавления роста тест-микроорганизма. Выражают антимикробную активность в относительных единицах, равных отношению диаметра подавления роста тест-микроорганизма к количеству белка -эндотоксинов. Удельная антимикробная активность (отн.ед./мг) отражает активность смеси -эндотоксинов кристаллов, выраженную на мг белка, а общая количество антимикробной активности в единице объема. Изменение удельной антимикробной активности обусловлено тем, что в состав кристаллов входят в различных соотношениях различные -эндотоксины, а также могут входить разные количества неактивных белков.

До засева в газон бактерии выращивают 16-20 ч на агаризованной среде Хоттингера с добавлением 0,1% ПЭГ-600 и 510^-4 М ЭДТА, затем смывают 0,005 М фосфатно-цитратным буфером рН 7,5 и используют для определения антибактериальной активности. В таблице приводятся данные, полученные при усреднении значений для 3 концентраций растворов в 3 повторностях.

П р и м е р 2. Берут суспензию спор и кристаллов B.thuringiensis subsp. tenebrionis, полученную так, как описано в примере 1, промывают так, как описано в примере 1, растворяют (без отделения спор) в 0,035 н.NaOH так, как описано в примере 1. -Эндотоксины осаждают из супернатанта уксусной кислотой при рН 6,5, центрифугируют на холоду при 15 тыс.об./мин, 20 мин, осадок перерастворяют в 0,05 М трис-HCl буферном растворе рН 9. Количество белка и антибактериальную активность определяют так, как описано в примере 1, кроме следующих отличий: а) тест-микроорганизм подращивают в присутствии 0,5% ПЭГ-600 и 10^-3 М ЭДТА; б) в агар для определения вносят 0,4% твина. Результаты приведены в таблице.

П р и м е р 3. Берут по 3 мл суспензии спор и кристаллов B.thuringiensis подвидов kurstaki и tenebrionis, полученных и промытых так, как описано в примере 1. Растворяют в присутствии 0,02 н.NaOH так, как описано в примере 1, осаждают уксусной кислотой, доводя рН растворов до 4 (для подвида kurstaki) и 6,5 (для подвида tenebrionis). Осадки перерастворяют в 0,05 М фосфатно-цитратной системе рН 8,7; устанавливают количество -эндотоксинов в 1 мл и определяют антибактериальную активность так, как описано в примере 1, в агаризованном разведенном в 3 раза бульоне Хоттингера с добавлением 0,3% твина. Тест-микроорганизм подращивают перед определением антибактериальной активности -эндотоксинов в присутствии 0,5% ПЭГ-600 и 10^-3 М ЭДТА ( что повышает его чувствительность к действию -эндотоксинов на 30-70%). Значения, приведенные в таблице, показывают, что в данном опыте удельная антибактериальная активность -эндотоксинов подвида tenebrionis примерно в 4 раза выше, чем таковая подвида kurstaki. Такое сравнение биологических активностей -эндотоксинов патотипов А и С, необходимое при многих исследованиях, можно проводить только предложенным способом.

П р и м е р 4. Берут кристаллы B.thuringiensis ssp. kurstaki, полученные при выращивании бактерий на среде, содержащей (в г/л): MgSO₄ 0,3; MnSO₄ 0,05; CaCl₂ 0,165; ZnSO₄ 0,0035; FeSO₄ 0,0005; CuSO₄ 0,005; K₂HPO₄ 0,25; (NH₄)₂SO₄ 2,0; крахмал 10; сорбит 10; триптон 5,0; рН 7,2. Промывание кристаллов проводят так, как описано в примере 1. Растворение кристаллов проводят в 0,035 н.NaOH так же, как описано в примере 1. Определяют антибактериальные действие полученного раствора по изменению оптической плотности суспензии M. flavus в 0,01 М фосфатно-цитратном буфере рН 7,5 через 1, 5, 10, 30 мин по сравнению с контролем. Полученный результат, выраженный в относит. ед. представлен в таблице.

П р и м е р 5. Берут кристаллы B.thuringiensis subsp. kurstaki, полученные и промытые так, как описано в примере 1. Растворение кристаллов проводят в 0,02 н.NaOH так же, как описано в примере 1 определяют антимикробную активность -эндотоксинов по действию на Aspergillus terreus методом диффузии в агаризованной среде Чапека-Докса раствора -эндотоксинов, нанесенных на диски. Полученные значения антибиотической активности приведены в таблице.

П р и м е р 6. Берут кристаллы B.thurinsiensis subsp. galleriae, полученные и промытые так, как описано в примере 1. Растворяют их (можно в смеси со спорами) в 0,06 н.NaOH так, что описано в примере 1. Определяют биологическую активность -эндотоксинов так, как описано в примере 1. В качестве тест-объекта используют клетки M. flavus, предварительно не росшие в присутствии ЭДТА и ПЭГ-600. Получают значения антибактериальной активности меньшие, чем при выполнении приведенных условий определения.

П р и м е р 7. Растворение всех кристаллов подвидов B.thuringiensis, используемых в работе, в 0,005 н.NaOH не приводит к достаточному полному выходу -эндотоксинов, поэтому проведение всех остальных операций, описанных в примере 1, дало возможность получить значительно более слабые значения биологической активности -эндотоксинов.

Использование предлагаемого способа имеет следующие преимущества: 1. Ускорение, упрощение, повышение экономичности.

2. Возможность сравнения биологической активности -эндотоксинов разных патотипов B. thuringiensis с помощью одного тест-организма. Других способов сравнения биологической активности -эндотоксинов патотипов А и С пока неизвестно.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ -ЭНДОТОКСИНОВ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОТИПОВ BACILEUS THURINGIENSIS, предусматривающий растворение кристаллов щелочью, удаление нерастворимых компонентов, определение количества белка в растворе, добавление раствора на агаризованную среду, предварительно засеянную тест-микроорганизом, инкубирование смеси, определение антибактериальной активности, по которой судят о биологической активности d-эндотоксинов, отличающиеся тем, что перед растворением кристаллы последовательно промывают водой, раствором поваренной соли и ацетоноводной смесью в соотношении 2 : 3, после удаления нерастворимых компонентов из раствора эндотоксины осаждают уксусной кислотой при рН 4,0 - 6,5, полученный осадок растворяют в буфере при рН 8,5 - 9,0, а на агаризованную среду вносят растворы с концентрацией белка 65 - 250 мгк/мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1