Способ определения цитотоксической активности клеток

Способ определения цитотоксической активности клеток

Реферат

 

Использование: в медицине, а именно в иммунологии, и может применяться в различных областях клинической и экспериментальной иммунологии для выявления повышенной чувствительности к инфекционным и неинфекционным антигенам. Сущность: из крови больного выделяют лимфоциты и нейтрофилы, а киллерную активность лимфоцитов предварительно стимулируют путем обработки клеток - эффекторов антигеном в течение одного часа при 37^oС с последующим отмыванием от него, после чего в опытной пробе взвесь гранулоцитов смешивают с обработанными антигеном лимфоцитами в соотношении 1 : 10, в к контрольной пробе - с необработанными антигеном лимфоцитами, инкубируют пробы 18 ч при 37^oС в термостате. Регистрацию разрушения клеток - мишений определяют по выходу калия в кондиционную среду с помощью пламенного фотометра. Результаты реакции расчитывают по формуле: цитотоксическая активность клеток где К_о - содержание калия в опытной пробе (показание шкалы прибора), К_к - содержание калия в контрольной пробе. Способ прост в исполнении при сохранении точности определения цитотоксической активности клеток. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной иммунологии для выявления повышенной чувствительности к инфекционным и неинфекционным аллергенам.

Цель изобретения упрощение способа.

Известен способ определения цитотоксического действия лимфоцитов путем инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями, нагруженными антигеном. В качестве клеток-мишеней используют эритроциты барана либо аутогранулоциты крови (Лабораторное дело. 1980, N 9, с. 543-547).

Регистрация разрушения клеток осуществляется по выходу калия из клеток-мишеней. Этот способ выбран нами за прототип.

Однако способ-прототип достаточно трудоемок, так как требует получения взвеси эритроцитов барана, подготовки (сенсибилизации) клеток-мишеней путем двухчасовой инкубации их с антигеном с последующим отмыванием клеток, подсчетом и доведением до нужной концентрации. Кроме того с помощью способа-прототипа выявляется активность лишь части киллерных клеток, а именно тех киллеров, которые действуют на нагруженные антигеном клетки-мишени, в то время, как в крови имеются и другие популяции киллерных клеток (например, естественные киллеры), активирующиеся при реакциях замедленной гиперчувствительности.

Цель изобретения упрощение способа. Эта цель достигается тем, что производится инкубация лимфоцитов (клеток-эффекторов) в течение 60 мин с антигеном, после чего лимфоциты смешивают с собственными гранулоцитами больного, инкубируют 18 ч и определяют степень лизиса клеток-мишеней по выходу каля из поврежденных клеток.

В предлагаемом способе в отличие от прототипа антигеном обрабатывают не клетки-мишени, а клетки-эффекторы (лимфоциты). В результате отпадает этап сенсибилизации клеток-мишеней. Положитель- ным моментом является и то, что мы используем меньшую концентрацию клеток-эффекторов, а следовательно, уменьшается необходимое количество крови для исследования: 2-3 мл в заявляемом способе против 5-7 мл в прототипе. Инкубация клеток-эффекторов с антигеном приводит к активации различных популяций киллерных клеток, усиленному синтезу лимфоцитов и это позволяет относительно просто и с высокой точностью определять цитотоксическую активность мононуклеарных клеток. Кроме того, исключается влияние ксеногенного антигена клеток-мишеней на результаты реакции.

Эти существенные отличия заявляемого способа от способа-прототипа позволяют сделать вывод, что заявляемый способ соответствует критерию "новизна". В просмотренной нами литературе мы не встретили технических решений, в которых бы использовали предварительную антигенную стимуляцию киллерной активности клеток-эффекторов перед инкубацией их с клетками-мишенями, следовательно, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию "существенные отличия".

Способ испытан при диагностике острой дизентерии и при выявлении аутоаллергии у больных острыми вирусными и хроническими гепатитами. В табл.1 и 2 приведены данные наших исследований.

Представленные данные свидетельствуют о том, что с помощью предлагаемого метода четко регистрируется наличие повышенной чувствительности к микробному (дизентерийному) антигену и наличие аутоаллергии при острых и хронических гепатитах.

Нами было проведено сопоставление чувствительности предлагаемого метода и метода-прототипа.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что чувствительность данного способа не ниже, а даже несколько выше, чем у прототипа.

Способ осуществляют следующим образом. К 2 мл гепаринизированной крови прибавляли 0,3 мл полиглюкина или 6%-ного раствора декстрана для быстрого осаждения эритроцитов, кровь отстаивается в термостате 30 мин. Плазму, обогащенную лейкоцитами, помещали на фиколл-верографиновый градиент и выделяли лимфоциты путем центрифугирования. Затирали лимфоцитарное кольцо и клетки дважды отмывали средой 199 с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 100 Ед/мл). Параллельно получали гранулоциты из осадка, лизируя эритроциты дистиллированной водой 25-30 сек, после чего восстанавливают изотоничность, добавляя 8,9% -ный раствор хлористого натрия. Клетки дважды отмывают средой 199 с антибиотиками. Производят подсчет клеток и доводят концентрацию лимфоцитов до 10⁶/мл и гранулоцитов до 10⁵/мл. Проводят обработку лимфоцитов антигеном путем 60-минутной инкубации 0,5 мл взвеси клеток с 50 мкл антигена в заранее оттитрованной концентрации. В предварительных экспериментах было показано, что инкубация в течение 1 ч и 2 ч дает аналогичные результаты, а обработка клеток эффекторов 30 мин недостаточна, так как данное время инкубации не дает возможности проявления максимального цитотоксического эффекта. В контрольной пробе лимфоциты инкубируют со средой 199. Затем все клетки отмывают дважды средой 199 с антибиотиками и 10%-ной инактивированной сывороткой крупного рогатого скота и восстанавливают до прежней концентрации.

В опытной пробе 0,1 мл взвеси аутогранулоцитов смешивают с равным объемом обработанных антигеном лимфоцитов. В контрольной пробе нейротрофилы смешивают с лимфоцитами, не обработанными антигеном. Все пробы проводят в трех повторах. Пробирки инкубируют в термостате 18 ч при 37^оС. Затем во все пробирки добавляют 0,8 мл изотонического раствора хлористого натрия и центрифугируют 10 мин при 400 g. Надосадочную жидкость отсасывают и определяют в ней содержание калия с помощью атомно-абсорбционного фотометра в соответствии с инструкцией к прибору. Результаты реакции рассчитывают по формуле: 100% где К_о содержание калия в опытной пробе, К_к содержание калия в контрольной пробе.

П р и м е р 1. Больной Ч. 40 лет. Диагноз: Хронический активный гепатит, фаза стихающего обострения.

В пробирку с гепарином получили 2 мл венозной крови, добавили 0,5 мл полиглюкина (1: 4), кровь поместили в термостат при 37^оС. Плазму с лейкоцитами отобрали и наслоили на 2 мл фиколл-верографина плотностью 1,077, процентрифугировали 30 мин при 400 g. Отобрали лимфоцитарное кольцо. Надосадок удалили и путем гемолиза получили гранулоциты: для этого к осадку прибавляли 0,9 мл дистиллированной воды, ресуспендировали 30 сек, затем для восстановления изотоничности добавляли 0,1 мл 8,9%-ный раствор хлористого натрия. Все клетки отмывали дважды средой 199 с антибиотиками. Затем провели подсчет клеток и довели концентрацию лимфоцитов до 110⁶ клеток/мл и гранулоцитов до 110⁵/мл. Обработку антигеном лимфоцитов больного проводили и в трех режимах: 2 ч, 1 ч, 30 мин в термостате при 37^оС. Для этого пробирки маркировали и в каждую пробирку к 0,5 мл взвеси лимфоцитов прибавляли 50 мкл антигена (препарат липопротеида печени человека Рижского медицинского института). В контрольных пробах лимфоциты инкубировали со средой 199 также в трех режимах. Затем все клетки отмывали дважды средой 199 с антибиотиками и 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота. В опытной пробе 0,1 мл взвеси гранулоцитов смешивали с равным объемом обработанных антигеном лимфоцитов. В контрольной пробе гранулоциты смешивают с лимфоцитами, не обработанными антигеном. Пробы проводили в двух повторах. Все пробирки инкубировали в термостате 18 ч при 37^оС. Затем во все пробы добавляли 0,8 мл физиологического раствора и центрифугировали 10 мин при 400 g. Надосадочную жидкость забирали и определяли в ней содержание калия с помощью пламенного фотометра. Результаты определения: I режим 2 ч предварительной обработки лимфоцитов перед инкубацией с клетками-мишенями, опытные пробы К_о1 26, 27, среднее значение 26,5 контрольные пробы К_к1 23, 24, среднее значение 23,5. Цитотоксическая активность клеток 100% 12,77% II режим 60-минутная обработка лимфоцитов, опытные пробы К_о2 25, 27, среднее значение 26, контрольные пробы К_к2 22, 24, среднее значение 23. Цитотоксическая активность клеток 100% 13,04% III режим 30-минутная обработка лимфоцитов, опытные пробы К_о3 24, 25, среднее значение 24,5, контрольные пробы К_к3 22, 24, среднее 23, цитотоксическая активность клеток 100% 6,52% От того же больного получили 5 мл венозной крови в другую пробирку с гепарином. Аналогичным способом были получены и отмыты лимфоциты, получили взвесь клеток в среде 199 с антибиотиками в концентрации 410⁶клеток/мл. Консервированные эритроциты барана трижды отмыли физиологическим раствором хлористого натрия и к 1 мл 5% взвеси клеток добавили 50 мкл печеночного антигена. Параллельно приготовили эритроциты барана без антигена и обе пробирки инкубировали 2 ч при 37^оС. Затем эритроциты барана отмыли и довели до концентрации 2 10⁵ клеток/мл средой 199 с антибиотиками и 10%-ной инактивированной сывороткой крупного рогатого скота, 0,1 мл взвеси лимфоцитов смешали с 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов барана (две пробы опытных пробирок) и 0,1 мл несенсибилизированных эритроцитов барана (контрольные пробирки). Пробирки выдерживали 18 ч в термостате при 37^оС, после чего во все пробы добавляли по 0,8 мл физиологического раствора хлористого натрия и определяли калий аналогичным способом в надосадочной жидкости.

Результаты определения: контрольные пробы 24, 26, среднее значение 25, опытные пробы 26, 28. Цитотоксическая активность клеток 100% 8% Таким образом показано, что предлагаемый способ определения цитотоксической активности клеток более прост в исполнении, имеет меньшие временные затраты, достоверен, не требует сложного оборудования, обладает хорошей воспроизводимостью в условиях стандартной клинико-иммунологической лаборатории, может быть использован для решения различных диагностических вопросов в практической медицине.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК путем инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями по выходу калия из разрушенных клеток, отличающийся тем, что инкубируют 0,5 10⁶ клеток-эффекторов в течение 60 мин при 37^oС в опытной пробе с печеночным или Шигелл-Флекснера антигеном, взятым в оттированной концентрации в объеме 550 мкл и в контрольной пробе с равным количеством среды 199, а ннкубацию лимфоцитов, полученных в опытной и контрольной пробах с клетками-мишенями, взятыми в соотношении 0,1 10⁶ лимфоцитов и 0,1 10⁵ клеток-мишеней, проводят в течение 18 ч при 30^oС, после чего определяют цитотоксическую активность (ЦА) по формуле где K_о - содержание калия в опытной пробе; K_к - содержание калия в контрольной пробе.

РИСУНКИ

Рисунок 1