Способ диагностики лептоспироза свиней

Способ диагностики лептоспироза свиней

Реферат

 

Использование: в ветеринарии, иммунологии. Сущность изобретения: в способе диагностики лептоспироза свиней методом микроточечного иммуноферментного анализа на основе дот-блоттинга в качестве антигена используют антиген, полученный выращиванием лептоспир серогрупп Pomona, Tarassovi, Grippotyhosa, Icterohacmorrhagiae, Canicola, Hebdomadis и Sejroe на водно-сывороточной питательной среде, смесь культур в равных соотношениях центрифугируют при 45000 g в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, полученный осадок подвергают дезинтеграции при частоте 20 кГц, мощности 100 Вт в течение 2 мин, экстракцию антигена проводят 50%-ным этиловым спиртом в течение 24 ч при -20^oС и 90%-ным этиловым спиртом при -20^o0с в течение 6 сут, отделение антигена осуществляют центрифугированием при 80000 g в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и доводят концентрацию белка в антигене до 20 мкг/см³.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к диагностике инфекционных заболеваний, и может быть использовано для диагностики лептоспироза у свиней.

Известен способ диагностики лептоспироза путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке крови животного с последующим определением титров лептоспирозных антител. В качестве антигена для обнаружения специфических антител в сыворотке крови животных с помощью реакции микроагглютинации (РМА) используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. Диагностические штаммы лептоспир лаборатории поддерживают периодическими пересевами через каждые 10-15 дн. В реакции используют культуры лептоспир в возрасте 5-10 дн без признаков агглютинации и лизиса с накоплением микробных клеток 50-100 млн/см³.

Однако известный способ трудоемок, учет реакции необходимо проводить только под микроскопом. Кроме того, способ требует постоянного поддерживания в лаборатории полного набора живых диагностических лептоспирозных культур, что представляет угрозу здоровью персонала ветеринарных лабораторий, так как в соответствии с положением Министерства здравоохранения СССР лептоспир включен во вторую группу инфекций, требующих особых мер предосторожности при работе.

Известен также антигенный состав для иммуноферментного выделения антител к лептоспирам, способ приготовления и его применение для диагностики лептоспироза.

В качестве антигена используют надосадочную жидкость культуры лептоспир: L. biflexa Patoc I, L.biflexa Sao Paolo, L.andamana CH II, L. andamana Bovedo.

Лептоспиры выращивают на питательной среде 55955, содержащей минеральные соли, микроэлементы, витамины, твин и бычий сыворотки альбумин (БСА).

Каждый из штаммов отдельно выращивают в термостате в течение 8-10 дн при +28^оС до получения средней концентрации 1,10⁸-2,10⁸ лептоспир в 1 см³. После проверки на незараженность, все культуры смешивают и обрабатывают чистым формальдегидом из расчета 1,5 см³ на 100 см³ смеси лептоспир и выдерживают 20-40 мин, затем смесь культур выдерживают в кипящей бане в течение 30 мин, охлаждают и доводят рН до 9,6, центрифугируют при 10000 g в течение 45 мин и собирают надосадочную жидкость, которую используют в качестве антигена. Для определения в сыворотке крови антител к возбудителю лептоспироза используют метод ELISA, применяя микроплаты с плоским дном. Учет реакции проводят визуально.

Однако полученный вышеуказанным способом антиген для выявления специфических антител к возбудителю лептоспироза в сыворотке крои людей менее специфичен, так как при изготовлении антигена используют непатогенные лептоспиры (L.biflexa), которые не вызывают заболевания лептоспирозом у животных и людей.

Для выращивания культур лептоспир требуются дорогостоящие питательные среды, для постановки реакции микроплаты.

Цель изобретения повышение эффективности способа диагностики лептоспироза у свиней и создание безопасных условий труда для персонала диагностических лабораторий.

Цель достигается тем, что лептоспирозные антитела в сыворотке крови свиней определяют с помощью способа иммуноферментного анализа (ИФА) на основе дот-блоттинга, с использованием инактивированных (убитых) антигенов и с визуальной (без инструментальной) оценкой результатов реакции.

Способ осуществляют следующим образом.

П о л у ч е н и е а н т и г е н а. Лептоспиры серогрупп Помона, Тарассови, Гриппотифоза, Иктерогеморрагия, Каникола, Гебдомадис и Сейро выращивают в водно-сывороточной питательной среде, каждую культуру в отдельности и смесь культур в равных соотношениях центрифугируют при 15 тыс. в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и микробные клетки лептоспир подвергают дезинтеграции при частоте 20 кГц, мощности 100 Вт в течение 2 мин. Затем проводят экстракцию антигена 50%-ным этиловым спиртом в течение 24 ч при -20^оС и 90%-ным этиловым спиртом при -20^оС в течение 6 сут. Полученный экстракт центрифугируют в течение 30 мин при 25 тыс g. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и доводят концентрацию белка в антигене по Лаури до 30 мкг/см³.

Полученные антигены наносят с помощью капилляра на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,20-0,45 мкм и высушивают при комнатной температуре.

П р о в е д е н и е а н а л и з а. Сыворотку крови свиней исследует в планшетах в разведениях от 1:50 до 1:3200 и т.д. до титра.

Перед проведением анализа нитроцеллюлозные мембраны, сенсибилизированные лептоспирозными антигенами, предварительно выдерживают в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин и затем нитроцеллюлозные мембраны, сенсибилизированные монолептоспирами разных серологических групп, а также общим антигеном вносят в планшеты в лунки с сыворотками и инкубируют 1 ч при комнатной температуре (18-24^оС) или 30 мин при 37^о в термостате. Далее осторожно удаляют раствор из каждой лунки, дважды с интервалом в 10 мин промывают каждую лунку буферным раствором. Затем в каждую лунку добавляют 0,5 см³разведенного конъюгата белка А с пероксидазой хрена и выдерживают 1 ч при 37^оС, проводят повторно отмывание и в каждую лунку добавляют 0,5 см³окрашивающего раствора (хромогена). При появлении интенсивно окрашенного пятна на нитроцеллюлозном блоке, инкубированном с положительной контрольной сывороткой (как правило, реакция проходит в течение 3-5 мин), тщательно удаляют из всех лунок следы раствора и промывают нитроцеллюлозные полоски в дистиллированной воде и оставляют на 10 мин при комнатной температуре для подсыхания, после чего проводят учет реакции.

У ч е т р е а к ц и и. Результат реакции читают против белого фона. Положительный контроль должен давать точки синего цвета на почти бесцветном фоне нитроцеллюлозного блока. Образцы, дающие интенсивность точек, сравнимую с положительным контролем, рассматриваются как положительные на наличие лептоспирозных антител. Образцы, у которых интенсивность точек равна или ниже интенсивности фона нитроцеллюлозного блока, рассматриваются как отрицательные на наличие лептоспирозных антител.

П р и м е р. Были тестированы в "слепом опыте" 100 проб сывороток крови свиней, часть которых были положительными на наличие лептоспирозных антител по результатам реакции микроагглютинации (РМА) к лептоспирам серогрупп Помона, Тарассови, Иктерогеморрагия, Каникола, Гебдомадис и Сейро.

В результате проверки установлено, что в сыворотках, положительных по результатам РМА, выявлялись лепстопирозные антитела к тем же серогруппам и в тех же титрах с помощью иммуноферментного способа на основе дот-блоттинга были отрицательными (100% специфичность).

Исследование сыворотки крови свиней с помощью иммуноферментного способа на основе дот-блоттинга проведены в неприспособленном помещении. Результат реакции получен в течение 2,5 ч.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики лептоспироза у свиней с помощью микроточечного иммуноферментного анализа на основе дот-блоттинга значительно упрощает диагностику лептоспироза благодаря применению в качестве антигенов убитых штаммов лептоспир, вследствие чего устраняются большие трудности, связанные с необходимостью поддержании и использования в диагностических лабораториях полного набора живых лептоспирозных культур. Кроме того, упрощается также учет полученных результатов реакции, который проводится визуально, а не в "темном поле зрения" микроскопа, как при РМА, исключается возможность неправильной интерпретации результатов.

Благодаря способу повышается производительность труда в связи с устранением необходимости просматривать под микроскопом и оценивать результаты реакции всех разведений сывороток с каждым из 23 сероваров лептоспир, появляется возможность одномоментно в "полевых условиях" исследовать большое количество сывороток крови свиней благодаря использованию микротитрационных панелей, а также обеспечивается безопасность работы персонала благодаря использованию убитого диагностикума вместо живых культур лептоспир.

Антиген, приготовленный из патогенных культур лептоспир, более специфичен по сравнению с антигеном, при изготовлении которого были использованы непатогенные штаммы лептоспир.

Формула изобретения

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА СВИНЕЙ, включающий определение наличия антител к возбудителю лептоспироза в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфического антигена и последующим учетов результатов реакции, отличающийся тем, что для определения наличия антител используют метод микроточечного иммуноферментного анализа на основе дот-блоттинга, а в качестве антигена - антиген, полученный выращиванием лептоспор серогрупп Pomona, Tarassovi, Yrippotyphosa, Icterohacmorrhagiae, Canicola, Hebdomadis и Sejroe, на водно-сывороточной питательной среде, смесь культур в равных соотношениях центрифигурируют при 45000 g в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, полученный осадок подвергают дезинтеграции при частоте 20 кГц, мощности 100 Вт в течение 2 мин, экстракцию антигена проводят 50%-ным этиловым спиртом в течение 24 ч при температуре минус 20^oС и 90%-ным этиловым спиртом при температуре минус 20^oС в течение 6 суток, отделение антигена осуществляют центрифугированием при 80000 g в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и доводят концентрацию белка в антигене до 20 мкг/см³.