Способ получения фолликулостимулирующего гормона

Способ получения фолликулостимулирующего гормона

Реферат

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения гормональных препаратов. При очистке конечного продукта, полученного из гомогенезированного гипофиза свиней осуществляют ионообменную хроматографию и гелевую фильтрацию в присутствии катионообменника СМ-сефадекса при pH среды 5,6 - 5,7. Единица массы конечного продукта по специфической активности эквивалентна активности ФСГ фирма Шеринг (США) в соотношении 1,20 - 1,25 : 1. 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения гормональных препаратов.

Известен способ получения белкового гидролизата из тканей эндокринных желез животных путем кислотного гидролиза белков, экстрагирования ацетоном, смесью хлороформ:спирт 2:1. Полученный концентрат обрабатывают соляной кислотой, гидролизуют, пропускают через ионообменную смолу и высушивают (авт.св. N 825083, кл. А 61 К 37/02, 1981).

Известен также способ получения белков из сырья животного происхождения, включающий экстракцию белков из сырья смесью хлороформа с метанолом, промывание экстракта перерастворение и осаждение. Промывку экстракта осуществляют 0,09-0,10-процентным раствором хлористого натрия. Перерастворяют белки органическими растворителями. Осаждают ацетоном при соотношении растворителя и ацетона 1: 5-1: 10 в течение 1-2 ч (авт.св. N 1080825, кл. А 61 К 37/22, 1984).

Однако известные способы извлечения белков из тканей животных не могут быть использованы при получении фолликулостимулирующего гормона из гипофиза убитых животных, поскольку в экстракте присутствует не менее девяти гормонов, контролирующих трофику других желез, например АКТГ, ТТГ, ЛГ, и др. (Дж. Бакл, Гормоны животных, М. "Мир", 1986, с. 9.27).

Выделение каждого из гормонов требует определенного индивидуального способа, поскольку они отличаются своими специфическими особенностями и различной молекулярной массой. Для суперовуляции самок крупного рогатого скота наибольшее значение имеет фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), являющийся глюкопротеидом, обладает биохимическими и иммунологическими свойствами, отличающимися от свойств гонадотропина, полученного из крови жеребых кобыл (СЖК). ФСГ не имеет половой специфичности, стимулирует созревание и рост фолликулов в яичниках самок сельскохозяйственных животных, образование фолликулярной жидкости и при совместном действии с лютеинизирующим гормоном способствует образованию эстрогенов в организме животных. Используется при лечении гипофункции коров и телок, для вызывания овуляции у самок-доноров по технологии получения эмбрионов. В семенниках самцов-производителей ФСГ стимулирует развитие спермагенных канальцев и начальную стадию сперматогенеза, но не влияет на гормональную активность семенников сельскохозяйственных животных (Ветеринарная энциклопедия. М. "Советская энциклопедия", 1976, с. 302).

Как видно из вышеприведенного, ФСГ может быть широко и продуктивно использован в животноводстве и ветеринарии. Однако выделение его из гипофиза с помощью вытяжки органическими растворителями по известным способам является сложным, дорогостоящим процессом, а конечный продукт (ФСГ), как правило низкоактивным. Приходится его закупать у иностранных фирм.

Цель изобретения повышение эффективности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что при очистке гормонального препарата осуществляют ионообменную хроматографию и гелевую фильтрацию в присутствии катионообменника СМ-сефадекса при рН-среды, равной 5,6-5,7.

Катионообменник СМ-сефадекс (карбоксиметилсефадекс) применяется при разделении и фракционировании основных белков (Н.Кацимпулас. Ионообменная хроматография. В кн. Хроматография. Практическое применение метода. М. "Мир", 1986, с. 109). В доступной нам научно-технической литературе использование СМ-сефадекса при очистке ФСГ методом ионообменной хроматографии и гелевой фильтрации с рН-средой, равной 5,6-5,7 не установлено. Именно эти существенные признаки нового способа с двукратной обработкой СМ-сефадексом (в начале гелем, а затем порошкообразным) гормонального препарата, полученного из гипофиза свиней, позволяют значительно повысить специфическую активность и эффективность использования целевого продукта, белорусского ФСГ в ветеринарии.

П р и м е р (конкретное выполнение способа). Свежезамороженный гипофиз свиней гомогенизируют, навеску в 200 г помещают в колбу емкостью 1500 мл, заливают экстрагирующей смесью, состоящей из 10%-ного ацетата натрия или ацетата аммония на 60% и 96%-процентного этилового спирта на 40% указанной емкости, рН раствора доводят до 5,7. Экстрагируют в холодильнике при 0-5^оС в течение 12-15 ч с использованием магнитной мешалки. Затем центрифугируют в центрифуги при 5000 об/мин. Сливают супернатант и измеряют его объем. К осадку добавляют 50 объема той же эстрагирующей смеси, встряхивают и тем же способом экстрагируют еще 2 ч и также центрифугируют. Супернатанты объединяют, перемешивают и определяют общий объем вытяжки, к которому добавляют 4,6 л 83-процентного этилового спирта. Отработанный осадок выбрасывают. Осаждение ФСГ проводят в морозильной камере при -18^оС в течение 12-15 ч, после чего прозрачную верхнюю часть смеси сливают, а нижнюю центрифугируют вышеописанным способом и отбирают снова светлую фракцию раствора. Осадок обрабатывают 4-миллимолярным раствором ацетата натриевого буфера на бидистиллированной воде с рН 5,7. Объем раствора доводят до 500 мл. Двукратное растворение осадка осуществляют в стеклянном стакане в холодильнике при температуре 0-5^оС в течение 1-2 ч с использованием магнитной мешалки, после чего вновь центрифугируют вышеописанным способом в течение 15 мин. Супернатанты смешивают и добавляют к заранее приготовленному гелю из СМ-сефадекса. Готовят его следующим образом: 10 г порошкообразного СМ-сефадекса заливают (500 мл) ацетатным 4-миллимолярным буфером. Созревание геля продолжается 30 мин. После чего излишки жидкости сливают.

Супернатанты в геле тщательно перемешивают стеклянной палочкой с последующим встряхиванием и смешиванием на магнитной мешалке в течение 2 ч при температуре окружающей среды 0-5^оС. Затем раствор фильтруют через фильтр Зейтца или через колонку с гель-фильтратом при той же температуре. К полученному фильтрату повторно добавляют 1 г СМ-сефадекса, но уже в сухом порошкообразном виде, перемешивают и таким же способом еще раз фильтруют. Отбирают 500 мл фильтрата, добавляют 1 млн.ед. тетрациклина для инъекций и лиофилизируют до порошкообразного состояния, примерно 48 ч, в алюминиевых поддонах при температуре 0^оС. Конечный продукт представляет собой сухой аморфный порошкообразный субстант бело-серого или серо-желтого цвета, растворимы в дистиллированной воде или физрастворе в течение 1 мин. ФСГ расфасовывают в 10-миллилитровые флаконы по 150 мг, закупоривают и маркируют. Хранят ФСГ при температуре 2-4^оС. Срок годности продукта 2 года.

Одновременно проводили еще два опыта по получению белорусского ФСГ по вышеописанной методике, но при разной рН-среды: 5,5 и 5,9. Все остальные параметры и последовательность действий способа были аналогичными, как и в вышеописанном примере конкретного выполнения способа.

Специфическую активность получения препаратов определяли биологическим методом по и способности стимулировать рост яичников у инфантильных самок на фоне введения избытка гонадотропина хориогонического (хориогонин) при сравнительном воздействии ФСГ с заведомо известной активностью производства фирмы Шеринг (США) на аналогичных животных. Препараты вводили подкожно в течение 4 сут, два раза в день. Контролем служили животные, получавшие инъекцию физраствора, и столько же животных, получавших по 40 ИЕ хориогонина, поскольку все опытные животные перед введением различных доз ФСГ обрабатывались таким же (40 ИЕ) количеством хориогонина. Начальной дозой ФСГ было 0,25 мг, затем 0,5 и 1,0 мг. Четвертая группа животных получала добавочную дозу ФСГ, полученного в среде с рН, равной 5,5, 5,7 и 5,9, для установления эквивалентно массы белорусского ФСГ Iму мг ФСГ фирмы Шеринг по специфической активности.

Результаты исследований приведены в табл.1. Данные свидетельствуют, что специфическая активность полученных гормональных препаратов слегка уступала активности импортного ФСГ фирмы Шеринг из США. На одну единицу массы импортного ФСГ приходилось 1,20-1,25 масс-единицы белорусского ФСГ. Более активным являлся ФСГ, полученный в среде с рН 5,7, в сравнении с ФСГ, полученным в среде с рН 5,5 и 5,9 (71,8 7,3 против 69,4 7,2 и 68,6 7,0).

Сравнительная оценка эффективности использования в ветеринарии для вызывания суперовуляции у самок крупного рогатого скота была осуществлена на животноводческой ферме конезавода "Заречье" Смолевичского района Минской области. По опробированной технологии производства эмбрионов 39 коров было обработано белорусским ФСГ. Контролем служила группа аналогичных животных, обработанных такой же дозой ФСГ производства фирмы Шеринг (табл.2).

Гормональная обработка коров-доноров проводилась по стандартной четырех-дневной схеме инъекций ФСГ в дозе 1200 ИЕ ФСГ белорусского производства, полученного в среде с рН 5,7 и производства фирмы Шеринг.

Таким образом, специфическая активность ФСГ, изготовленного по предлагаемому способу с использованием среды при рН 5,7 несколько превосходит аналогичный показатель ФСГ, полученный в среде с рН 5,5 и 5,9. Используя новый способ получения белорусского ФСГ можно обойтись без дефицитного, дорогостоящего импортного гормонального препарата, за который теперь приходится платить валютой.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА из гипофиза животных, включающий измельчение сырья и экстрагирование, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют в смеси 10%-ного раствора ацетата натрия или ацетата аммония и 96%-ного этилового спирта, взятых в соотношении 3 : 2 по объему, в течение 12 - 15 ч при температуре 0 - 5^oС, смесь центрифугируют и обрабатывают этиловым спиртом, осадок отбрасывают, осаждение целевого продукта проводят при температуре -18^oС в течение 12 - 15 ч осадок очищают с помощью СМ-сефадекса дважды: гелем и порошком, при этом гель готовят смешиванием порошкообразного сефадекса с 4-миллимолярным буфером ацетата натрия или ацетата аммония в соотношении 1 : 50 и выдерживают в течение 2 ч с очищаемым продуктом при температуре 0 - 5^oС, фильтруют, к профильтрованному экстракту добавляют 2 мг/мл порошкообразного сефадекса, перемешивают в течение 1 ч, вновь фильтруют и лиофильно высушивают.

РИСУНКИ

Рисунок 1