Способ определения гистамина в мокроте

Способ определения гистамина в мокроте

Реферат

 

Использование: медицина, клиническая биохимия, для определения гистамина в мокроте. Сущность изобретения: пробу мокроты гомогенизирут в равном объеме трихлоруксусной кислоты, после центрифугирования выделяют надосадочную часть, к которой добавляют раствор щелочи и смесь бутанол-хлороформ для перевода гистамина из водной фазы в органическую, осуществляют центрифугирование для разделения указанных фаз, после чего органическую фазу с растворенным в ней гистамином отделяют от водной и добавляют к ней раствор кислоты для перевода гистамина из органической фазы в водную, центрифугируют, отделяют водную фазу, добавляют к ней ортофталевый альдегид, полученный конденсат из гистамина и ортофталевого альдегида стабилизируют добавлением раствора ортофосфорной кислоты, после чего измеряют его концентрацию флюориметрически.

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано при проведении научно-исследовательских работ и в практической медицине для выяснения патогенетической роли гистамина у конкретного пульмонологического больного и назначения соответствующей полноценной терапии, что сокращает сроки нетрудоспособности, повышает трудовую реабилитацию, а следовательно, приносит определенный экономический эффект.

Известен способ определения гистамина в цельной крови по флюоресценции продуктов, образующихся при реакции с ортофталевым альдегидом, согласно которому в пробирку вносят 4,0 мл оксалатной крови, добавляют 4,0 мл 1 н. хлорной кислоты, встряхивают в течение трех минут. Центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. 4,0 мл надосадочной жидкости переносят в пробирки, содержащие 1,5 г кристаллического хлорида натрия, 0,5 мл 5 н. едкого натрия и 10,0 мл смеси бутанолхлороформ (соотношение 3:2). Встряхивают 3 мин, центрифугируют 5 мин при 400 об/мин. Водную фазу удаляют. К органической фазе приливают 5,0 мл 0,1 н. раствора едкого натра в насыщенном растворе хлорида натрия. Встряхивают 5 мин, центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. Верхний слой переносят в пробирки с 5,0 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Встряхивают 3 мин, центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. Верхний слой переносят в пробирки, в которые приливают 0,5 мл 1 н раствора едкого натра и 0,12 мл 0,1%-ного раствора ортофталевого альдегида в абсолютном метаноле, через 4 мин добавляют 0,2 мл 1,4 н раствора ортофосфорной кислоты. Флюоресценцию вызывают облучением монохроматическим светом с длиной волны 365 нм. измеряют интенсивность свечения при длине волны 460 нм [1] Применение данного способа для анализа мокроты не позволяет достаточно точно судить о содержании гистамина, так как значительная часть его теряется с осадком после обработки хлорной кислотой в силу того, что носителями гистамина в мокроте, в основном, являются тучные клетки, эозинофилы, которые при такой обработке не разрушаясь попадают в осадок.

Известен способ одновременного определения в мокроте гистамина, 1-метилгистамина и других биологических аминов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, заключающийся в выделении гистамина хроматографическим путем с последующим флюорометрическим определением его количества [2] В соответствии с этим способом, 1,0 мл мокроты смешивают с 1,0 мл 0,4 н. раствора хлорной кислоты и с 0,7 г хлорида натрия. Смесь центрифугируют. Супернатант наносят на хроматографическую колонку с 1,0 мл ионита Амберлит СG-50. Колонку промывают водой 0,5 М. NаОАс, 5 н. соляной кислотой. Гистамин элюируют 0,5 М. соляной кислотой. Элюат высушивают. Остаток растворяют в 250 мл боратного буфера рН 10,8. Точно через две минуты смесь вводят в хроматограф с колонкой 100 на 4,6 мм, заполненную сферисорбом 3ОDS (размер частиц 3 мкм) и с флюоресцентным детектором. Флюоресценцию возбуждают светом с длиной волны 350 нм, измеряют интенсивность свечения при 430 нм. Однако, при этом методе линейность калибровочных графиков сохраняется в пределах 0,1-10 мкг/л, поэтому необходима довольно высокая степень разведения мокроты (содержание гистамина в ней измеряется десятками и сотнями мкг/л). Кроме того, способ требует наличия сложного хроматографического оборудования и квалифицированного обслуживающего персонала, что ограничивает область его применения.

Цель изобретения определение содержания гистамина в мокроте больных с различными формами бронхолегочной патологии для разработки патогенетически обоснованного лечения, включая применение антигистаминных препаратов, а также снижение себестоимости метода исследования, его трудоемкости и расширение сферы применения.

Достигается это тем, что в способе определения гистамина в мокроте, включающем осаждение белков в пробе, конденсацию определяемого гистамина с ортофталевым альдегидом с последующим флюориметрическим определением концентрации полученного конденсата, одновременно с осаждением белков 16% раствором трихлоруксусной кислоты, пробу гомогенизируют. После центрифугирования к надосадку добавляют раствор щелочи и смесь бутанол хлороформ для перевода гистамина из водной фазы в органическую. Затем органическую фазу отделяют от водной и добавляют раствор кислоты для перевода гистамина в водную фазу. Такой последовательный перевод из водной фазы в органическую и опять в водную необходим для очистки от посторонних флюоресцирующих примесей. К выделенной водной фазе добавляют ортофталевый альдегид, полученный конденсат "гистамин-ортофталевый альдегид" стабилизируют добавлением раствора ортофосфорной кислоты и флюориметрируют.

Некоторые существенные признаки известны. Сведений об использовании существенного признака, касающегося введения новой операции гомогенизации пробы с одновременным осаждением белков, не имеется. На основании этого сделан вывод, что техническое решение обладает существенным отличием.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Мокроту собирают утром натощак, после ополаскивания полости рта кипяченой водой. Отбор проб ведется в чистую сухую стеклянную посуду с крышкой. Мокрота (нативная или разведенная бидистилированной водой), в количестве 4,0 мл гомогенезируется в таком же объеме 16%-ного раствора трихлоруксусной кислоты на протяжении 10 мин, после чего пробу центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. 4,0 мл надосадочной жидкости переносят в пробирку с притертой стеклянной или полиэтиленовой пробкой, содержащую 0,5 мл 5 н. раствора едкого натра, 1,5 г хлористого натрия и 10,0 мл смеси бутанол-хлороформ (объемное соотношение 3;2). В щелочной среде гистамин переходит в органическую фазу. Содержимое пробирок тщательно перемешивают в шуттель-аппарате и центрифугируют при 4000 об/мин. Нижнюю водную фазу удаляют. Затем в пробирку вносят 5,0 мл 0,1 н. раствора едкого натра, насыщенного хлоридом натрия. Пробирку энергично встряхивают в течение 3 мин. Пробу вновь центрифугируют в течение 5 мин при 4000 об/мин. После разделения фаз весь верхний (органический) слой переносят в другую пробирку, куда добавляют 5,0 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Смесь встряхивают 3 мин, затем центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. Верхний водный слой (гистамин в кислой среде переходит в водную фазу) полностью переносят в обычную пробирку, в которую добавляют 0,5 мл 1 н. раствора едкого натра 0,12 мл ортофталевого альдегида (0,1% раствор в абсолютном метаноле). Образовавшийся конденсат (гистамин-ортофталевый альдегид) через 4 мин стабилизируют добавлением 0,2 мл 1,4 м раствора ортофосфорной кислоты. Пробы флюориметрируют на обычном флюориметре или спектрофлюориметре.

Свечение образовавшегося конденсата возбуждают светом с длиной волны 365 нм, а измеряют интенсивность свечения при 460 нм. Флюороген стоек в течение 30 минут. Для приготовления контрольной пробы 4,0 мл 16%-ной трихлоруксусной кислоты, используемой вместо мокроты, проводят через все этапы метода. Параллельно опытным и контрольной пробам, обрабатывают стандартные, представляющие 4,0 мл 6% -ного раствора трихлоруксусной кислоты с добавлением известного количества гистамина (например, 0,1,0,5,1,0 мкг гистамина-основания). Сначала измеряют величину свечения контрольной, затем 1-2 стандартных и опытных проб. На основании полученных данных делают расчет концентрации гистамина в мокроте. Линейная зависимость между интенсивностью флюоресценции и концентрацией гистамина сохраняется в пределах от 5,0 до 500,0 мкг/л. Коэффициент вариации в исследуемых образцах 15,0% Расчет осуществляют по калибровочной кривой или по формуле: A где А содержание гистамина, мкг/мл; Ф_о разность в показаниях опытной и контрольной проб, по шкале флюориметра; Ф_с разность показаний стандартной и контрольной проб по шкале флюориметра; С содержание гистамина (мкг) в 4,0 мл стандартного раствора.

Специфичность измерения гистамина в мокроте определялась добавлением известных количеств экзогенного гистамина к образцам мокроты и сравнением результатов со стандартными растворами, а также использованием разного количества одного и того же образца мокроты.

Описанный метод предпочтительнее тем, что позволяет работать как с разведенной, так и с нативной мокротой. Кроме того, нет необходимости в использовании сложного лабораторного оборудования и реактивов. Заявляемым способом могут работать лаборатории не только научно исследовательских институтов, но и широкой сети клиник практического здравоохранения, так как для его осуществления используются распространенные реактивы, а из оборудования необходим спектрофлюориметр или флюориметр, имеющийся в большинстве клинических лабораторий. Все это значительно удешевляет материальные затраты на производство анализа.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА В МОКРОТЕ по реакции конденсации с ортофталевым альдегидом, включающий осаждение белков в пробе с последующим флюориметрическим определением концентрации полученного конденсата, отличающийся тем, что осаждение белков осуществляют раствором трихлоруксусной кислоты в процессе гомогенизации пробы, после центрифугирования гомогената отделяют супернатант, добавляют к нему раствор щелочи и смесь бутанол-хлороформ, смешивают, повторно центрифугируют, отделяют органическую фазу, добавляют к ней раствор кислоты, смешивают, вновь центрифугируют, отделяют водную фазу, добавляют к ней ортофталевый альдегид, затем добавляют к пробе раствор ортофосфорной кислоты и проводят ее флюориметрическое исследование при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны поглощения 460 нм.