Способ получения препарата "споробактерин"

Способ получения препарата "споробактерин"

Реферат

 

Использование: микробиология, получение препарата "Споробактерин", штамма Bacillus subtilis 534. Сущность изобретения: способ включает культивирование штамма в ферментере при перемешивании и аэрации в жидкой питательной среде. Посевную культуру получают непосредственно в ферментере в условиях повышенной аэрации, достигающей 50 - 70% от полного насыщения среды кислородом, основной процесс культивирования проводят в том же ферментере, используя посевную дозу 1 - 2 10⁹ кл/мл. После 8 - 10 ч выращивания культуры, когда происходит изменение pH в щелочную сторону, начинают pH-статирование процесса на уровне pH 7,5 - 8,0 до конца культивирования. После слива культуральной жидкости отделяют микробную массу методом микрофильтрации и отмывают в режиме диафильтрации. Способ обеспечивает высокий выход биомассы Bacillus subtilis 534 с выраженной антагонистической активностью. Получаемый препарат стандартен по количеству микробных клеток. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, касается способа получения препарата "Споробактерин", представляющего собой микробные клетки штамма Bacillus subtilis 534. Препарат предназначен для лечения и профилактики хирургических инфекций и дисбактериозов, вызванных патогенными и условно-патогенными бактериями, дрожжевыми грибками.

Известные способы культивирования различных штаммов B.subtilis направлены на получение из культуральной жидкости ряда ферментов, таких как -амилаза (1, 2, 3), протеаза (4), пектат-трансаминаза (5), а также ряда антибиотехнических веществ (6, 7). Они основаны на использовании периодического и непрерывного глубинного культивирования на жидких питательных средах.

Поскольку эти методы предусматривают получение продуктов метаболизма сенной палочки, что не обеспечивают максимального возможный выход бактериальных клеток и не могут быть использованы для получения биомассы B.subtilis 534. Кроме того, применяемые в них питательные среды, физические параметры и длительность проведения процессов не обеспечивают проявления антагонистических свойств бактериальной массой выращиваемого штамма.

Наиболее близким по совокупности признаков является способ получения препарата "Споробактерин" путем выращивания штамма B.subtilis 534 на твердой питательной среде в матрасах со скошенным мясо-пептонным агаром в термостате при (37 1)^оС в течение 24 ч. Выращенную биомассу смывают и разводят средой высушивания до нужной концентрации, разливают по ампулам и высушивают методом сублимации.

Недостатком способа является трудоемкость, нетехнологичность этапов засева и смыва культуры с агара, повышенная опасность контаминации целевого продукта посторонней микрофлорой из-за многократности открывания матрасов, отсутствие возможности получения стандартного по количеству микробных клеток препарата ввиду особенностей роста культуры штамма на плотной питательной среде (В виде врастающей в агар слизевой трудноразбиваемой пленки).

Целью настоящего изобретения является разработка способа глубинного периодического культивирования штамма B.subtilis 534, обеспечивающего высокий выход биомассы с выраженной антагонистической активностью для получения стандартного препарата "Споробактерина".

Поставленная цель достигается тем, что культивирование штамма проводят в ферментере при перемешивании и аэрации в жидкой питательной среде. Получение экспоненциальной маточной культуры в ферментере проводят в условиях повышенной аэрации, достигающей 50-70% от полного насыщения среды кислородом. Основной процесс культивирования проводят в том же ферментере и начинают, используя посевную дозу 1,0-2,0 ^.10⁹ микробных клеток в 1 мл; после 8-10 ч выращивания культуры, когда происходит изменение рН в щелочную сторону (рН 8,1 и выше), для устранения этого явления в последующие часы проводят рН-статирование процесса на уровне рН 7,5-8,0 до конца культивирования, микробную массу отделяют методом микрофильтрации и отмывают в режиме диафильтрации.

Сравнение существенных признаков предлагаемого технического решения с прототипом показывает, что общим для них является проведение процесса культивирования на питательной среде с целью получения биомассы штамма B.subtilis 534, обладающей антагонистической активностью в отношении ряда тестовых штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий.

Однако при известных условиях выращивания невозможно получить стандартный по количеству микробных клеток препарат "Споробактерин" из-за особенностей роста штамма на плотной питательной среде в виде врастающей в агар плотной слизевой пленки.

Отличительными особенностями предлагаемого способа являются: реакторное гомогенное глубинное культивирование штамма B.subtilis 534 на жидкой питательной среде, включающее: получение маточной экспоненциальной культуры в ферментере в условиях повышенной аэрации с целью исключения опасности контаминирования культуры B.subtilis 534 посторонней микрофлорой и сокращения времени ее получения с 72 ч (5), 24 ч (3), 18 ч (1,3) до 4-6 ч; рН-статирование культуральной жидкости с 8-10 ч от начала культивирования на уровне рН 7,5-8,0 с целью увеличения выхода бактериальной массы за счет продления фазы замедления скорости роста до полного истощения резервов питательной среды; выделение микробной массы из культуральной жидкости методом микрофильтрации и отмывка ее в режиме диафильтрации с целью получения бактериальной массы, очищенной от примесных компонентов питательной среды.

Приведенная совокупность существенных признаков заявляемого способа в литературе не описана. Она также не следует из научных данных о физиологии микроорганизма B.subtilis, т.е. не вытекает из известного уровня техники, а следовательно, соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру штамма B.subtilis 534, выращенную на агаре, засевают в ферментер в полусинтетическую картофельно-глицериновую питательную среду. Состав среды описан в заявке N 4899653, кл. С 12 N 1/20, положительное решение от 29.07.91 г. Подращивание проводят при температуре 37^оС и аэрации, обеспечивающей 50-70% насыщение среды кислородом. Через 5 1 ч культура достигает экспоненциальной фазы, которой соответствует удельная скорость роста 0,45-0,55/ч, а концентрация микробных клеток составляет 26-28 ^.10⁹ кл/мл. Основной процесс культивирования осуществляют в этом же ферментере. Посевная доза культуры соответствует 1,0-2,0х10⁹ кл/мл, для ее получения к маточной экспоненциальной культуре добавляют необходимый объем свежей питательной среды. Насыщение среды кислородом снижают до 25-30% После 8-10 ч культивирования проводят рН-статирование процесса на уровне значений рН 7,5-8,0 путем добавления 12,5%-ного раствора HCl. Продолжительность основного процесса культивирования составляет 36 ч. После слива культуральной жидкости микробные клетки отделяют методом микрофильтрации и отмывают от остатков питательной среды в режиме диафильтрации.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Культуру второго пассажа засевают в ферментер марки АК-10 с 2 л питательной среды. Подращивание проводят 5 1 ч при температуре 37^оС, подаче воздуха 14,1 л/мин и перемешивании 250-300 об/мин, обеспечивающих 50-70% концентрацию растворенного в среде кислорода. При достижении культурой экспоненциальной фазы роста часть культуральной жидкости сливают, оставляя такое ее количество, чтобы при добавлении 8 л свежей питательной среды получить посевную дозу культуры, равную 1,0-2,0х10⁹ кл/мл. Основное культивирование проводят при аэрации и перемешивании, создающих 25-30%-ное насыщение среды кислородом. Через 8-10 ч от начала процесса, когда рН культуральной жидкости становится 8,1 и выше, начинают рН-статирование 12,5%-ным раствором HCl, поддерживая его значения на уровне рН 7,5-8,0. Продолжительность выращивания соответствует 34-36 ч, при этом конечное содержание бактериальных клеток в среде культивирования составляет 20-24х10⁹ кл/мл. Клетки отделяют от среды культивирования микрофильтрацией на мембранах марки "мифил" и отмывают физраствором в режиме диафильтрации. Полученную биомассу проверяют на наличие антагонистической активности в отношении тестовых штаммов (таблица).

Сравнительный анализ предлагаемого способа культивирования с прототипом.

Расход питательной среды на одну серию препарата "Споробактерин" в объеме 1000 ампул: по способу-прототипу расходуется 60 л питательной среды, разлитой в 240 матрасов по 250 мл; по заявляемому способу требуется только 10 л питательной среды без агара.

Антагонистическая активность биомассы штамма B.subtilis 534: антагонистическая активность биомассы, получаемой по способу-прототипу и по заявляемому способу, существенно не отличается.

Стандартность конечного продукта-препарата "Споробактерин".

Способ-прототип не обеспечивает стандартность по количеству клеток препарата "Споробактерин" из-за особенностей роста штамма на твердой питательной среде в виде трудноразбиваемой слизевой пленки, врастающей в агар. Заявляемый способ свободен от этого недостатка.

Таким образом, сравнительный анализ заявляемого способа с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается технологичностью, меньшими затратами (в 6 раз меньший расход питательной среды на 1 серию препарата в 1000 ампул), позволяет получать стандартный пот количеству микробных клеток препарат "Споробактерин".

П р и м е р 2. Подращивание маточной культуры в ферментере проводят при аэрации и перемешивании, обеспечивающих 30-40%-ное насыщение среды кислородом. Остальные условия как в примере 1. Культура достигает экспоненциальной фазы через 8-10 ч от начала подращивания, это удлиняет процесс культивирования по сравнению с примером 1 на 4 ч.

П р и м е р 3. Подращивание маточной культуры и процесс культивирования осуществляют как в примере 1, однако рН-статирование не проводят. При этом после 8-10 ч культивирования рН культуральной жидкости достигает значений 9-10, а конечная концентрация полученной биомассы составляет 14-16х10⁹ кл/мл, т.е. на 8-10х10⁹ кл/мл ниже, чем в примере 1.

Таким образом, из примеров 2 и 3 видно, что снижение концентрации растворенного в среде кислорода на стадии подращивания культуры, отсутствие рН-статирования удлиняют процесс культивирования и снижают выход биомассы, т.е. не позволяют достичь того результата, который может быть получен в условиях, заявленных в формуле изобретения.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "СПОРОБАКТЕРИН", включающий посев штамма Bacillus subtilis 534 ВКМ N В-1666Д в питательную среду, его выращивание с последующим отделением микробных клеток и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что посев проводят в жидкую питательную среду, культуру выращивают в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих 50 - 70%-ное насыщение среды кислородом до фазы экспоненциального роста, затем осуществляют разведение культуры свежей питательной средой до концентрации (1 - 2) 10⁹ кл/мл, снижают насыщение среды кислородом и продолжают процесс культивирования при рН-статировании на уровне 7,5 - 8,0, а микробные клетки отделяют микрофильтрацией в режиме диафильтрации.

РИСУНКИ

Рисунок 1