Адъювант

Адъювант

Реферат

 

Использование: ветеринария, в частности производство иммунизирующих препаратов для профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: предложен адъювант, содержащий эмульгатор ЭПОЛ - продукт этерификации смеси олеиновой и стеариновой кислот с полиглицерином и масляную основу. ЭПОЛ растворяют в масляной основе в заданных соотношениях и смесь стерилизуют. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость желтого цвета. 4 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а более конкретно к масляным адъювантам, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных.

При изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение в основном следующие адъюванты: минеральные сорбенты в сочетании с сапонином для изготовления сорбированных вакцин и масляные адъюванты для эмульсионных.

Исследования свидетельствуют о преимуществах и перспективе использования эмульсионных препаратов, которые готовят с использованием масляных адъювантов.

Изготовление эмульсионных препаратов является результатом смешивания двух взаимно нерастворимых фаз масляной (масляного адъюванта) и водной, содержащей антигены (антиген), путем их энергичного перемешивания (эмульгирования).

При этом в зависимости от состава масляного адъюванта может быть получена эмульсия различных типов: "вода в масле" (обратная), "масло в воде" (прямая) или "вода-масло-вода" (множественная).

Для иммунизации сельскохозяйственных животных наиболее широко используют эмульсии обратного типа, для получения которых используют адъюванты следующего состава, мас.

1. Минеральное масло Байоль 85 Арлацел А (неполный адъювант Фрейнда) 15 2. Масляная основа 85 Безводный ланолин 15 3. Масляная основа 84-89 Безводный ланолин 10-14 Холестерин 1-2 В качестве масляной основы обычно используют вазелиновое, парфюмерное, вакцинное масло или масло для противоящурных биопрепаратов.

Общими недостатками вышеуказанных адъювантов являются сильная реактогенность для крупного и мелкого рогатого скота и высокая вязкость (выше 2000 мм²/с) полученных с их использованием препаратов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результаты к изобретению при использовании является адъювант, содержащий масляную основу и эмульгатор ВНИИЖ смесь полиглицериноалканоатов на основе непредельных жирных кислот при следующем соотношении компонентов, мас. Эмульгатор ВНИИЖ 10-15 Масляная основа 85-90 В качестве масляной основы используют масло для противоящурных биопрепаратов.

Недостатком прототипа является его высокая реактогенность.

В задачу создания предлагаемого изобретения входила разработка адъюванта и иммунизирующего препарата на его основе, обладающих низкой реактогенностью.

Поставленная задача решена тем, что известный адъювант, включающий эмульгатор и масляную основу, в соответствии с изобретением содержит в качестве эмульгатора ЭПОЛ продукт этерификации смеси олеиновой и стеариновой кислот с полиглицерином при следующем соотношении ингредиентов, мас. ЭПОЛ 6-10 Масляная основа 90-94 ЭПОЛ представляет собой смесь моно- и диэфиров общей формулы: НО(-СН₂СНОНСН₂О-)nОСН₃₃С₁₇ (моноэфир) С₁₇Н₃₃СОО(-СН₂СНОНСН₂О-)_nОСН₃₃С₁₇ (диэфир), где n 5.

ЭПОЛ имеет следующие физико-химические показатели: Внешний вид и цвет Мазеобразная масса от желтого до коричневого цвета Эфирное число, нг КОН/г 130-150 Кислотное число, нг КОН/г Не более 8 Плотность, г/см³ 0,980 Вязкость, мПа.с 1200 ГЛБ 5-6 Гарантийный срок хранения не менее 1 года.

ЭПОЛ хорошо сочетается с жирными минеральными и растительными маслами, растворяется в органических растворителях.

ЭПОЛ не является токсичным, относится к 4 классу веществ, малоопасных для развития острых отравлений. Расчетная величина ОБУВ для воздуха рабочей зоны равна 10 мг/м³ (заключение НИИ гигиены труда и профзаболеваний N 06.01-14-13 от 12.01.90). Известно использование ЭПОЛа в косметических изделиях в качестве эмульгатора типа "вода в масле".

По сравнению с прототипом предлагаемый адъювант отличается тем, что содержит в качестве эмульгатора ЭПОЛ при следующем соотношении ингредиентов, мас. ЭПОЛ 6-10 Масляная основа 90-94 По результатам опытов на лабораторных и сельскохозяйственных животных впервые обнаружены новые свойства эмульгатора ЭПОЛ: он не разрушает вирус, не обладает токсичностью, его использование в составе вакцины приводит к снижению ее реактогенности. Снижение реактогенности адъюванта обусловлено высокой молекулярной массой ЭПОЛа и низким содержанием свободных жирных кислот.

В качестве масляной основы используют минеральное масло для противоящурных биопрепаратов или минеральное масло для универсального адъюванта, при использовании которых получены аналогичные результаты.

Вышеуказанные отличия предлагаемого адъюванта от прототипа являются существенными, так как они являются достаточными во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата, указанного в задаче создания изобретения.

Признаки, отличающие предлагаемый адъювант от прототипа, не выявлены в других известных решениях при изучении данной и смежных областей знаний.

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый адъювант, достигается технический результат, заключающийся в снижении реактогенности адъюванта и полученного на его основе иммунизирующего препарата, что подтверждено результатами многочисленных исследований, сведения о которых приведены ниже.

П р и м е р 1.

Состав адъюванта, мас. ЭПОЛ 6 Масляная основа 94 Адъювант готовят следующим образом. Навеску ЭПОЛа растворяют в минеральном масле для ящурных биопрепаратов или минеральном масле для универсального адъюванта в оптимальных отношениях. Полученный раствор стерилизуют известными методами: либо нагреванием в сушильном шкафу при 120-130^оС в течение 2 ч, либо путем стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок "СФ", ЕКS, JAM -150 и т.п. при комнатной температуре. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость желтого цвета, допускается слабая опалесценция. Адъювант разливают в стерильные флаконы и хранят при комнатной температуре до момента использования.

П р и м е р 2.

Состав адъюванта, мас. ЭПОЛ 8 Масляная основа 92 Адъювант готовят так, как описано в примере 1.

П р и м е р 3.

Состав адъюванта, мас. ЭПОЛ 10 Масляная основа 90 Адъювант готовят так, как описано в примере 1.

Для экспериментальной проверки предлагаемого адъюванта были подготовлены пять смесей ингредиентов, три из которых показали оптимальные результаты. Оптимальный состав предлагаемого адъюванта определили в результате изучения физических свойств (вязкость, устойчивость), полученных на его основе иммунизирующих эмульсий из вируса ящура А₂₂, который использован в качестве модельного образца, что никоим образом не ограничивает объем изобретения.

Вакцины получали путем смешивания ящурного антигена и предлагаемого адъюванта в отношении 1:1 в размельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин при 5000 об/мин.

Вязкость образцов эмульсионных вакцин определяли с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-2 при 20^оС и выражали в мм²/с.

Устойчивость эмульсионных препаратов определяли путем визуального наблюдения за расслоением 20 см³ образца эмульсии при 37^оС. Устойчивость характеризовали временем ее хранения до начала выделения водной фазы. Кроме того, определялась устойчивость эмульсии центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Стабильными считали эмульсии, устойчивые к центрифугированию и не выделяющие водной фазы в течение 3 месяцев и более.

Результаты исследований приведены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что оптимальный состав предлагаемого адъюванта следующий, мас. ЭПОЛ 6-10 Масляная основа (образцы 2, 3, 4, 7, 8, 9) 90-94 В этом случае устойчивость эмульсий сохраняется в течение 3 месяцев и более, а вязкость не превышает 98 мм²/с, что обеспечивает легкую инъецируемость препаратов. Повышение содержания эмульгатора не улучшает свойств эмульсии, а уменьшение до 5% приводит к снижению устойчивости (образцы 1 и 6).

Эффективность предлагаемого адъюванта в сравнении с прототипом и аналогами проверена в ряде опытов также в составе эмульсионной противоящурной вакцины А₂₂.

Реактогенность адъювантов определяли количественным методом на белых мышах и качественным на свиньях и крупном рогатом скоте.

Белым мышам массой около 20 г в область подошвы одной из задних конечностей вводили образцы адъювантов в дозе 0,05 мл. На каждый образец использовали не менее 10 мышей. Через 10 дней животных забивали, конечности обрезали по скакательный сустав и взвешивали. Реактогенность определяли как процент прироста массы в результате воспалительной реакции по формуле Реактогенность 1100% где М_о сумма масс опытных лапок; М_к сумма масс контрольных лапок.

Реактогенность адъювантов на свиньях и крупном рогатом скоте оценивали по наблюдениям за клиническим состоянием, температурой тела и по результатам патолого-анатомического исследования через 10 дней после введения вакцин, содержащих различные адъюванты. Крупному рогатому скоту препараты вводили подкожно, а свиньям внутримышечно в область шеи.

В табл. 2 и 3 приведены результаты оценки реактогенности предлагаемого адъюванта и эмульсионной вакцины на его основе в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Как видно из табл. 2 и 3, предлагаемый адъювант и вакцины на его основе обладают значительно меньшей реактогенностью, чем известные.

Из опытов на мышах (табл. 2) следует, что реактогенность предлагаемого адъюванта в 1,8-3,6 раза ниже, чем у адъюванта-прототипа.

Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что вакцина с предлагаемым адъювантом вызывает на месте введения у крупного рогатого скота значительно меньшую воспалительную реакцию, чем вакцины с адъювантом-прототипом. Кроме того, она не вызывает образования абсцессов и повышения температуры тела у животных.

В опыте на свиньях были изучены иммуногенная активность и реактогенность вакцин с предлагаемым адъювантом и адъювантом-прототипом. Препараты вводили в дозе 1 мл внутримышечно в область шеи в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000 (по 4 головы на каждое разведение). Вакцины разводили "Плацебо" с использованием аналогичного адъюванта. Через 10 дней после вакцинации всех привитых и 2 контрольных животных заражали 10000 ИД₅₀/0,2 мл гомологичным вирусом в слизистую языка. Через 8 дней после заражения учитывали результаты и оценивали реактогенность по месту введения (табл. 4).

Как видно из табл. 4, вакцина с предлагаемым адъювантом создает у свиней напряженный иммунитет, не уступая при этом вакцине с масляным адъювантом-прототипом.

Кроме того, при патолого-анатомическом исследовании в месте введения вакцины с предлагаемым адъювантом не отмечено воспалительных реакций, тогда как у 7 из 12 животных, привитых вакциной с адъювантом-прототипом, установлено образование гранулем.

Из вышеизложенного следует, что предлагаемый адъювант обладает более низкой реактогенностью по сравнению с прототипом, наряду с высокой иммуностимулирующей активностью. Кроме того, препараты, полученные с использованием предлагаемого адъюванта, стабильны и легко инъецируемы.

Экономический эффект от использования предлагаемого адъюванта будет складываться из уменьшения потерь мяса ввиду незначительных изменений на месте введения препаратов, изготовленных с его использованием.

Предлагаемый адъювант найдет применение при изготовлении и применении средств диагностики и специфической профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных.

Формула изобретения

АДЪЮВАНТ, включающий эмульгатор и масляную основу, отличающийся тем, что в качестве эмульгатора он содержит ЭПОЛ продукт этерификации смеси олеиновой и стеариновой кислот с полиглицерином при следующем соотношении ингредиентов, мас.

ЭПОЛ 6 10 Масляная основа Остальное

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3