Штамм бактерий vibrio cholerae eltor jnaba, используемый для иммунопрофилактики холеры

Штамм бактерий vibrio cholerae eltor jnaba, используемый для иммунопрофилактики холеры

Реферат

 

Использование: биотехнология, вакцина, иммунопрофилактика холеры. Сущность изобретения: получен штамм бактерий Vibrio Cholerae eltor Inaba КМ-184, полученный генно-инженерным способом, путем введения в специально подобранный авирулентный и атоксигенный штамм V.Cholerae 118 б гена, кодирующего синтез иммуногенной субъединицы В холерного токсина и плазмиды, кодирующей синтез антигена колонизирующего фактора CFaI из кишечной палочки. В результате проведенных работ штамм приобрел способность приживаться в кишечнике на срок, необходимый для формирования кишечного иммунного ответа, и может быть использован для иммунопрофилактики холеры. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и иммунологии, а именно к генной инженерии, и представляет собой штамм Vibrio cholerae eltor Inaba КМ-184, который содержит в хромосоме ген В-субъединицы холерного токсина (В-ХТ) и плазмиду антигенов колонизирующего фактора CFAI и используется для пероральной иммунопрофилактики холеры.

Как известно, в настоящее время имеет место широкое распространение холеры. По данным ВОЗ ежегодно от холеры погибает более 150000 человек. На данном этапе наиболее перспективными препаратами для иммунопрофилактики холеры по мнению экспертов ВОЗ являются убитые и живые оральные препараты (Bul. WHO, 1991, v. 69, N 6, р. 667-678).

В соединенных Штатах Америки разработан штамм V. cholerae CVD-103 HgR, происходящий из высокотоксигенного и слабоколонизирующего штамма V, cholerae 569B classical Inaba (Kaper J. B. e.a. //Rev. Infect. Dis. 1989, v. 11, s. 3, p. 568-573; Levine M. M.e.a. //Lancet. 1988, N 6809, р. 467-470), в котором из гена, кодирующего синтез холерного токсина, был удален участок, ответственный за синтез токсической субъединицы. А. Штамм V. cholerae CVD-103HgR обеспечивал наработку специфических антител и защиту добровольцев от заражения.

Штамм Vibrio cholerae eltor Inaba KM-184, полученный генно-инженерным путем, используется для иммунопрофилактики холеры.

Штамм Vibrio cholerae eltor Inaba КМ-184 хранится в Музее живых культур патогенных микроорганизмов Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером КМ-184. Указанный штамм обладает всеми свойствами, характерными для рода Vibrio (таблица).

Культурально-морфологические свойства.

Штамм V. cholearae eltor Inaba КМ-184 состоит из подвижных, прямых или слегка изогнутых палочек, грамотрицательных, аспорогенных, полиморфных, с одним полярно расположенным жгутиком. На щелочном агаре рН 7,6 через сутки при 32-37^оС вырастают небольшие прозрачные колонии с голубоватым отливом, в бульоне равномерное помутнение.

Физиологические свойства.

Штамм образует индофенолоксидазу, ферментируют глюкозу как в аэробных, так и в анаэробных условиях, декарбоксилирует лизин и орнитин, не расщепляет аргинин. Относится по Хейбергу к 1 ферментативной группе, агглютинируется холерными сыворотками 01, Инаба до диагностического титра. Штамм лизируется соответствующими диагностическими фагами "С", "эльтор", обладает нестабильной гемолитической активностью в пробе Грейга.

Штамм растет на средах, обычных для холерного вибриона: 1% пептонная вода, бульон и мясопептонный, Мартена, Хоттингера, казеиновый агар, с настоем сердечной мышцы и др. Обладает устойчивостью к канамицину (маркер наличия vct-В гена), триметоприму (маркер плазмиды, кодирующей CFAI).

Вирулентные свойства.

Штамм авирулентен для крольчат-сосунков в дозе 10⁹ м.т. кaк с применением иммунодепресантов (циклофосфана), так и без них, после 10-кратного пассирования на крольчатах-сосунках, авирулентен в лигированных петлях взрослых кроликов.

Антигенные и иммуногенные свойства.

Штамм обладает типичным 01 Инаба соматическим холерным антигеном, способен вызывать образование специфических антител в организме кролика при однократном пероральном введении.

Все вышеперечисленные свойства штамма определяются в соответствии с "Инструктивно-методическими указаниями по лабораторной диагностике холеры", М. 1984.

Генетические свойства.

Штамм Vibrio cholerae eltor Inaba КМ-184 получен генно-инженерным путем из природного штамма Vibrio cholerae 118 б (КМ-27), не обладающего геном, кодирующим синтез холерного токсина (авирулентный и атоксигенный штамм при исследованиях на крольчатах-сосунках, взрослых кроликах, методом генетического зондирования). В штамм Vibrio cholerae 118б с помощью векторной плазмиды, включающей в себя последовательности F, КмR, vct B, H ген, vct В был введен на место последовательности F H. Полученные генно-инженерные мутанты содержат в составе своей хромосомы ген КмR (канамициноустойчивости) и ген vct В. Наличие или отсутствие генов токсинообразования подтверждалось ДНК-ДНК-гибридизацией с зондом на ген холерного токсина. Рекомбинантный штамм способен продуцировать В-субъединицу холерного токсина (В-ХТ) в количествах, соответствующих продукции целого токсина (ХТ), вирулентными штаммами вибрионов эльтор, что определялось методом Gm-ELISA.

Для улучшения колонизирующей способности в этот штамм была дополнительно введена плазмида, кодирующая синтез фактора колонизации CFA I (Colonisation Factor Antigen) из клеток E. coli с маркером TpR (триметопримустойчивости).

В результате изменения иммунобиологических свойств рекомбинантного штамма Vibrio cholerae elton Inaba КМ-184 он остается полностью и стабильно авирулентным и атоксигенным на модели кроликов-сосунков по Датта и Хаббу (10 пассажей в дозе 10⁹ м.т. с циклофосфаном и без него), в лигированных петлях взрослого кролика по Де и Чаттерджи (дозы 10⁷ и 10⁹ м.т.) при пероральном внутригастральном заражении взрослых кроликов по Крэйгу с соавт. (дозами 5 х 10¹⁰ м.т.) в кожной пробе по Крейгу, при патогистолических исследованиях.

П р и м е р. Штамм Vibrio cholerae eltor Inaba КМ-184 приживается в кишечнике (1-3 дня) и вызывает иммунологическую перестройку организма (в том числе и наработку специфических антител), приводящую к защите его от заражения вирулентными штаммами Vibrio cholerae при внутрикишечном заражении в изолированные петли на 14-21 день.

Использование предлагаемого штамма для иммунопрофилактики и защиты от холеры имеет большое практическое значение, т.к. приведет к улучшению общественного здравоохранения.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae eltor Jnaba КМ-184, используемый для иммунопрофилактики холеры.

РИСУНКИ

Рисунок 1