Плазмида pvt1 размером 8,4 т.п.н., определяющая синтез термостабильной - галактозидазы и термостабильная b - галактозидаза, выделенная из бактерий escherichia coli tg1, трансформированных плазмидой pvt1

Плазмида pvt1 размером 8,4 т.п.н., определяющая синтез термостабильной - галактозидазы и термостабильная b - галактозидаза, выделенная из бактерий escherichia coli tg1, трансформированных плазмидой pvt1

Реферат

 

Использование: промышленная биотехнология, получение ферментных препаратов. Сущность изобретения: конструирование плазмиды pV TI, определяющей синтез термостабильной b - галактозидазы, и выделение фермента, обладающего b - галактозидазной активностью из штамма бактерий Escherichia coli tg 1, трансформированных указанной плазмидой. Новый фермент обладает повышенными термостабильностью и сродством к субстрату при оптимальном значении pH, что позволяет использовать его для промышленного приготовления молочных продуктов. 2 с. п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологическому получению ферментных препаратов и может найти применение в производстве ферментов, используемых в пищевой промышленности, преимущественно при производстве молочных продуктов.

Известно, что во многих странах высокий процент населения страдает интолерантностью (непереносимостью) к молоку, что обусловлено отсутствием в организме этих людей ферментов, сбраживающих молочный сахар лактозу. Это делает актуальной проблему получения безлактозного молока (молока, в котором процентное содержание лактозы снижено на 50-60%). Удаление лактозы из молока может быть осуществлено ее ферментативным разложением на галактозу с помощью фермента бета-галактозидазы.

Поскольку производство молочных продуктов связано с необходимостью проведения их термической обработки пастеризации), целесообразно использовать для разложения лактозы термостабильную бета-галактозидазу.

Продуцентами термостабильной бета-галактозидазы могут быть микроорганизмы, содержащие плазмиду, определяющую синтез данного фермента.

Известна рекомбинантная плазмида, кодирующая синтез термостабильной бета-галактозидазы (Saito T, et al. Isolation of thermostable galactosidase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in Escherihia coli. Enzyme Microb, Technol. 1989, v. 11, N 5, р. 302-305). (1).

Однако отсутствуют сведения о термофильном микроорганизме, послужившем источником гена, кодирующего синтез данного фермента и перенесенного в плазмиду штамма продуцента. Поэтому отсутствует возможное повторное конструирование данной известной плазмиды, т.е. воспроизведение и использование ее на практике.

Известен фермент, обладающий бета-галактозидазной активностью. Однако указанный фермент обладает более высоким оптимумом рН, что осложняет использование его в промышленных условиях обработки отходов молочной промышленности, а также более высоким значением константы Михаэлиса, что характеризует меньшее сродство фермента к субстрату и, следовательно, требует большее количество фермента для разложения того же количества субстрата.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является также получение нового ферментного препарата, обладающего активностью бета-галактозидазы с повышенной термостабильностью, с повышенным сродством к субстрату с оптимальным значением рН, благоприятным для применения нового ферментного препарата в условиях промышленного приготовления молочных продуктов.

Достигается технический результат тем, что в плазмиде рUT1 размером 8,4 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), определяющей синтез термостабильной бета-галактозидазы, содержится: ДНК плазмиды вектора рUC19 размером 2,7 т.п.н; ДНК хромосомы Clostridium thermohydrosulfuricum sp. размером 5,7 т.п.н.

уникальные сайты рестрикции: ВсIII, SalGl, XbaI, KpnI, Smal, Bsu15; 3 фрагмента с размерами 3,5 т.п.н. 3,0 т.п.н. 1,9, т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой HindIII; 2 фрагмента с размерами 7,4 т.п.н. и 1,0 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой HincII; 2 фрагмента с размерами 7,1 и т.п.н. и 1,3 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой РstI; 2 фрагмента с размерами 6,6 т.п.н. и 1,8 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой SphII; 2 фрагмента с размерами 6,6 т.п.н. и 1,8 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой EcoRU; 2 фрагмента с размерами 4,4 т.п.н. и 4,0 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой NdeI; гены; синтеза бета-галактозидазы; устойчивости к ампициллину (200 мкг/мл); находящийся на плазмиде р С19 ген синтеза термостабильной -галактозидазы с собственными регуляторными элементами, находящийся на фрагменте ДНК хромосомы С.thermohydrosubfavicum sp.

неконьюгативна; в клетках Е.coli присутствует в количестве 20 копий на клетку; не влияет на скорость роста и морфологию клеток E.coli; при трансформации клеток E.coli TG1 ДНК плазмиды рUТ1 образует 10⁵ трансформантов на 1 мкг ДНК.

Технический результат достигается также тем, что фермент, выделенный из бактерий E. coli TG1 (pUT1), обладает бета-галактозидазной активностью и имеет следующие свойства: субстратная специфичность: гидролизует лактозу и паранитрофенилгалактозид (ПНФГ); молекулярная масса: 83000 1000 дальтон (при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле ПААГ); изоэлектрическая точка; 5,0 0,1 (при определении методом изоэлектрофокусирования с использованием пластин Ampholine Paglate, рН 3,5-9,5 производства фирмы LКВ, Швеция, каталожный N 1804-101); рН оптимум; 5,8 1,0 (в 50-мМ фосфат-цитратном буфере ФЦБ при 75^оС, субстрат ПНФГ; диапазон рН-стабильности: при рН 5,0-6,0 (50 мМ ФЦБ) при 75^оС 60 мин, субстрат ПНФГ при рН 4,5 остаточная активность 80% при рН 6,6 остаточная активность 50% термостабильность в ФЦБ, рН 5,8, субстрат ПНФГ; 75^оС в течение 8 ч 100% активности остается 80^оС в течение 1 ч 80% активности остается 85^оС в течение 1 ч 65% активности остается константа Михаэлиса: 29 3 мМ (субстрат лактоза) 1,12 0,1 мМ (субстрат ПНФГ) ингибиторы: галактоза (в концентрации 5% в фосфат-цитратном буфере).

На фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды рUT1 с указанием расположения сайтов рестрикции эндонуклеаз и гена бета-галактозидазы; жирной линией обозначен фрагмент ДНК 5,7 т.п.н. Clostridium thermohydrosulfuricum, где сплошным показано расположение гена бета-галактозидазы. Тонкой линией обозначена ДНК плазмиды рUC19. Стрелкой обозначен ген устойчивости к ампициллину (Ap^r); на фиг. 2 электрофореграмма препарата термостабильной бета-галактозидазы, очищенного согласно приведенной схемы с указанием молекулярного веса белка; на фиг. 3 зависимость активности термостабильной -галактозидазы, выделенной из клеток штамма E.coli TG1 (pUT1) от рН; на фиг. 4 то же, от температуры.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUT1, детерминирующей синтез бета-галактозидазы.

Тотальную ДНК С.thermohydrosulfuricum sp. выделяли из 1 г замороженной биомассы, которую ресуспендировали в 16 мл буфера (50 мМ трис-НСl, рН 8,0, 50 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТА, 0,1% додецилсульфат натрия (ДНС)), содержащего 2 мг/мл проназы, инкубировали 60 мин при 60^оС, затем дважды экстрагировали фенолом и переосаждали двумя объемами этанола. 10 мкг выделенной ДНК обрабатывали 2 ед. рестриктазы Sau3A при 37^оС в общем объеме реакционной смеси 100 мкл, содержащей 10 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ MgCl и 1 mМ дитиотрейтола (ДТТ). Через временные интервалы 30 с, 5 мин и 30 мин отбирали пробы и анализировали в агарозном геле (0,7%). Одновременно 2 мгк плазмиды рUC19 обрабатывали 5 ед. рестриктазы BamH1 в течение 60 мин при 37^оС в 20 мкл того же буфера. Реакции останавливали прогревом проб 10 мин при 65^оС. От рестриктазы освобождались экстракцией равным объемом фенола и затем хлороформа с последующим осаждением ДНК этанолом. Осадок растворяли в 20 мкл воды.

Для лигирования смешивали 20 мкл ДНК С.thermohydrosulfuricum sp. обработанной рестриктазой Sau3A в течение 5 мин, с 20 мкл линеаpизованной по BamHI сайту ДНК pUC19 и c 30 мкл буфера, содержащего 150 мМ трис-НСl, рН 7,9, 20 mM MgCl, 50 mM ДТТ, 0,2 мМ аденозинтрифосфата (АТФ) и 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), добавляли 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубировали 16 ч при 10^оС. В результате получали набор рекомбинантных плазмид на основе вектора рUC19, содержащих фрагменты генома С.thermohydrosulfuricum sp. в том числе гены, детерминирующие синтез термостабильной бета-галактозидазы.

П р и м е р 2. Получение штамма продуцента термостабильной бета-галактозидазы.

Для трансформации одну колонию клеток штамма Еscherichia coli TG1 засевали в 5 мл L-бульона (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl) и выращивали с аэрацией в течение ночи при 37^оС. Полученную ночную культуру разводили в 200 раз теплым L-бульоном и подращивали 2 ч в тех же условиях. После этого клетки охлаждали до 0^оС, осаждали центрифугированием при 5000 об/мин, осадок ресуспендировали в равном объеме ледяного стерильного 0,1 М раствора СаСl и инкубировали 30 мин при 0^оС. Затем клетки снова осаждали и ресуспендировали в 1/20 начального объема того же раствора.

К 1,5 мл полученных таким образом компетентных клеток добавляли 150 мкл лигированной ДНК, инкубировали 30 мин при 0^оС, затем 2 мин при 42^оС, добавляли 15 мл L-бульона и инкубировали с аэрацией 1 ч при 37^оС. Различные объемы полученной смеси высевали на чашки с агаризованной L-средой (L-бульон с добавлением 1,5% агара), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, которые инкубировали 16 ч при 37^оС до появления колоний трансформантов.

Для отбора клонов, обладающих бета-галактозидазной активностью, трансформационную смесь высевали таким образом, чтобы получить на чашке 500-700 колоний трансформантов. С помощью бархата колонии реплицировали на новые чашки с той же средой.

Реплики заливали 0,5% агаром, содержащим буфер (60 мМ Na₂HPO₄x7H₂O, 40 mM NaH₂PO x 2H₂O, 10 mM KCl, 1mM MgSO₄ x х 7H₂O, 50 mM бета-меркаптоэтанол, рН 7,0), 0,004% раствора 5-бромо-4-хлоро-3-индоксил-бета-Д-галактозида (Sigma, 2% в диметилсульфоксиде) и инкубировали 6 ч при 65^оС. Под действием бета-галактозидазы происходит отщепление галактозы от молекулы красителя, в результате чего колония, производящая термостабильную бета-галактозидазу, окрашивается в голубой цвет. При анализе 10 рекомбинантных колоний было отобрано 2 клона, давшие положительный ответ в тесте и содержащие рекомбинантные плазмиды размером примерно 9 т.п.н. Был отобран клон E.coli TG1 c наибольшей активностью, он содержал плазмиду, обозначенную нами как pUT1 величиной 8,4 т.п.н. Таким образом был получен штамм E.coli TG1 (pUT1), продуцирующий термостабильную бета-галактозидазу.

П р и м е р 3. Определение бета-галактозидазной активности в лизатах клеток штамма E.coli TG1 (pUT1).

20 мл ночной культуры E.coli TG1 (pUT1), выросшей в L-бульоне с ампициллином (100 мг/мл), осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки промывали 50 мл фосфат-цитратного буфера (ФЦБ, 0,05 М, рН 6,2), ресуспендировали в первоначальном объеме того же буфера, лизировали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 20000 об/мин в течение 20 мин.

В полученных лизатах определяли активность -галактозидазы по способности гидролизовать паранитро-фенил--D-галактозид (ПНФГ) с образованием паранитрофенила (ПНФ) и галактозы. За единицу активности принимали количество мкМ ПНФ, образующегося аз 1 мин.

Для определения активности к 0,4 мл 0,04 М раствора ПНФГ добавляли 0,1 мл раствора фермента и инкубировали реакционную смесь при 75^оС в течение 15 мин. Останавливали реакцию добавлением 1,0 мл раствора гидрокарбоната натрия (1 М).

Концентрацию ПНФ определяли спектрометрически при 400 нм.

Активность термостабильной -галактозидазы в экстрактах из клеток E.coli TG1 (pUT1) cоставила 4-5 ед/mg белка при 75^оС, рН 6,0.

Количество белка в лизатах клеток E.coli TG1 (pUT1) определяли с помощью модифицированной реакции Лоури.

П р и м е р 4. Схема очистки термостабильной бета-галактозидазы и получение препарата фермента.

Клетки E.coli TG1 (pUT1), выращенные в течение 16-18 ч при 37^оС с интенсивной аэрацией, осаждали центрифугированием, промывали физиологическим раствором, ресуспендировали в 1/10 первоначального объема в ФЦБ, рН 6,2. Клетки разрушали ультразвуком. Клеточный лизат прогревали при 70^оС в течение 30 мин, дебрис удаляли центрифугированием при 20000 об/мин в течение 10 мин. Белки фракционировали с использованием сульфата аммония (NH₄)SO₄, отбирали фракции между 30 и 50% Собранный белок подвергали гель-фильтрации на колонке с носителем TOYOPEARL HW-60 Fine, ФЦБ 0,05 М, рН 7,0. Ионообменную хроматографию препарата проводили на колонке с носителем Q Sepharose Fast Flow, используя ФЦБ 0,05 М, рН 7,0. Фермент элюировали с колонки градиентом NaCl (0 0,5 М в ФЦБ, рН 7,0).

Степень чистоты препарата оценивали по результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. Она составляет 95% от общего белка.

По данным электрофореза в ПААГ, молекулярная масса термостабильной бета-галактозидазы составляет 83000 Д.

Активность очищенного препарата бета-галактозидазы составляла 800 ед/мг белка на ПНФГ и 400 ед/мг белка на лактозе.

Константа Михаэлиса (определенная по методу Эйзенталя-Корниш-Боудена и методу Хейнса) полученного препарата термостабильной бета-галактозидазы на лактозе составляла 29 мМ (в диапазоне концентраций лактозы 1-80 мМ), на ПНФГ 1,12 мМ (в диапазоне концентраций ПНФГ 0,5-30 мМ) при температуре 75^оС, рН 5,7.

Изоэлектрическая точка термостабильной бета-галактозидазы равна 5,0.

Температурный оптимум термостабильной бета-галактозидазы составляет 75 80^оС; при 85^оС сохраняется 35% активности в течение 1 ч.

Оптимальные значения рН 5,7 6,0 (ФЦБ, 75 С) на субстрате ПНФГ.

Для выявления температурного и рН-оптимума определение активности фермента проводили при различных температурах, по оптимальной величине рН (6,0) или при различных значениях рН, но оптимальной температуре (75^оС) соответственно.

Ингибирующим действием на активность термостабильной бета-галактозидазы обладает галактоза в концентрации 5% в ФЦБ; ионы Са++ и Mg++ и в концентрации 5 10 мМ не оказывали ингибирующего действия на активность бета-галактозидазы, ионы Mn++ (10 мМ) оказывали небольшое активирующее действие (125% активности) (условия те же). Дитиотрейтол и меркаптоэтанол в концентрации 5 10 мМ не ингибировали бета-галактозидазу.

Формула изобретения

1. Плазмида pVT1 размером 8,4 т.п.н. определяющая синтез термостабильной b -галактозидазы, содержащая ДНК плазмиды-вектора pVC19 размером 2,7 т.п.н. включающая ген устойчивости к ампициллину; ДНК хромосомы Clostridium thermohydrosulfuricum sp. размером 5,7 т.п.н. включающая ген термостабильной b -галактозидазы с собственными регулярными элементами; уникальные сайты рестрикции эндонуклеаз Bc III, salGI, XbaI, KpnI, SmaI, Bsu15; три фрагмента с размерами 3,5 т.п.н. 3 т.п.н. 1,9 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой Hind III; два фрагмента с размерами 7,4 т.п.н. и 1 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой Hinc II; два фрагмента с размерами 7,1 т. п. н. и 1,3 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой Pst I; два фрагмента с размерами 6,6 т.п.н. и 1,8 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой Sph II; два фрагмента с размерами 6,6 т.п.н. и 1,8 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой EcoRV; два фрагмента с размерами 4,4 т.п.н. и 4 т.п.н. образующихся при расщеплении рестриктазой NdeI; 2. Термостабильная b -галактозидаза, выделенная из бактерий Escherichia coli TG1, трансформированных плазмидой pVT1, и имеющая следующие свойства: субстратная специфичность: гидролизует лактозу и паранитрофенилгалактозид (ПНФГ); мол.м. 83000 1000 дальтон (при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле ПААГ); изоэлектрическая точка 5,0 0,1 (при определении методом изоэлектрофокусирования с использованием пластин Ampholine Paglate рН 3,5 - 9,5); рН -оптимум: 5,8 1,0 [в 50-мМ фосфат-цитратном буфере (ФЦБ) при 75^oС, субстрат ПНФГ] диапазон рН-стабильности: рН 5 6 (50 мМ ФЦБ при 75^oС в течение 60 мин, субстрат ПНФГ; при рН 4,5 остаточная активность 80% при рН 6,6 остаточная активность 50% термостабильность: в ФЦБ, рН 5,8, субстрат ПНФГ: 75^oС: в течение 8 ч остается 100% активности, 80^oС: в течение 1 ч остается 80% активности, 85^oС: в течение 1 ч остается 65% активности; константа Михаэлиса: (29 3) мМ (субстрат лактоза), (1,12 0,1) мМ (субстрат ПНФГ); ингибиторы: галактоза (в концентрации 5% в фосфат-цитратном буфере).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4