Способ получения очищенного димера рибонуклеазы

Способ получения очищенного димера рибонуклеазы

Реферат

 

Использование: биотехнология и касается способа получения очищенного димера рибонуклеазы, который может быть использован для борьбы с вирусными и бактериальными инфекциями без цитотоксического воздействия, присущего обычно димеру рибонуклеазы. Сущность изобретения: способ включает стадии димеризации мономерной рибонуклеазы в присутствии суберимидатного соединяющего реагента, фильтрования недимеризованных мономеров и олигомеров из раствора димера применением ряда хроматографических этапов на ионообменных смолах, контроля хода реакции с помощью электрофореза на геле и сбора в качестве продукта очищенного димера рибонуклеазы. 20 з. п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к способам получения и очистки димера рибонуклеазы, которые могут использоваться для лечения вирусных и бактериальных инфекций.

Все возрастающее количество бактериальных и вирусных болезнетворных штаммов с устойчивостью к известным антибиотикам вызвало необходимость во введении для лечения человека и животных лекарств нового типа. Среди применяемых в настоящее время многих новых методов лечения и лекарств для лечения больных, пораженных различными заболеваниями, получило признание введение таким больным мономерных форм ферментов. В некоторых случаях это необходимо потому, что при некоторых симптомах заболевания наблюдается снижение активности ферментов. Ферменты относятся к каталитически активным белкам, при участии которых протекают все жизненно важные процессы в организме. В силу этого многие ферменты, как в индивидуальном состоянии, так и в определенных сочетаниях выделены из-за их физико-химического, физиологического или биологического действия.

К числу различных ферментов, для которых известно лечебное действие или которые снижают свою активность при определенных симптомах заболевания, относятся и рибонуклеазы. Рибонуклеазы образуют группу нуклеиновых ферментов, обычно обнаруживаемых во многих животных и растительных организмах. Изучение свойств рибонуклеазы и методов выделения этого фермента начали в середине 50-х годов Schmidt и McDonald. Среди многих открытий, связанных с этим ферментом, было и то, что раковая ткань характеризуется крайне сниженной активностью своих рибонуклеаз. В одном случае было обнаружено, что мышь с лейкозом обладает значительно пониженной активностью кислотной рибонуклеазы, наблюдаемой, в частности, в митохондриевых и микросомных фракциях, полученных из тканей селезенки животного. Исследования, подобные этим, указывают на то, что введение рибонуклеазы, возможно, удастся использовать для профилактики или для борьбы с симптомами, связанными с вирусной лейкемией.

К сожалению потенциальные возможности, которые могли бы быть использованы применением рибонуклеазы, не были реализованы, в первую очередь, вследствие сильного цитотоксического действия мономерной формы этого фермента. Например, в опытах с культивируемыми фибробластами цитотоксическое действие от введения мономерной формы рибонуклеазы наблюдалось даже при чрезвычайно низких ее дозировках. Очевидно, что необходимо создать способы максимального использования потенциальных возможностей рибонуклеазы при одновременном сведении к минимуму потенциально вредного цитотоксического действия мономерной формы этого фермента.

Недавно обнаружено, что из рибонуклеазы может быть приготовлена противовирусная или антибактериальная композиция, не обладающая цитотоксическим действием, если такую композицию готовят на димерной форме фермента. Применение композиций димера рибонуклеазы, как найдено, эффективно при лечении ряда инфекционных заболеваний, и в то же время не оказывает сильного цитотоксического действия, обычно связанного с мономером рибонуклеазы. Применение димеров рибонуклеазы в различных курсах лечения раскрыто в находящейся на одновременном рассмотрении заявке РСТ N 88/01785.

Хотя некоторые способы получения димерной формы рибонуклеазы из ее мономерной формы известны, важное значение имеет возможность получения больших количеств димерной формы недорогим и эффективным путем. Таким образом, крайне желательно создание системы получения и анализа больших количеств очищенного димера рибонуклеазы, содержащего минимальные количества таких примесей, как мономеры, мультимеры или другие загрязняющие вещества.

Согласно изобретению предлагаемый способ получения в качестве конечного продукта димера рибонуклеазы предусматривает стадии а) приготовления раствора рибонуклеазы добавлением мономерной рибонуклеазы к буферному раствору с установлением рН, по меньшей мере равным 9; b) добавления суберимидатного (содержащего имидат пробковой кислоты) связующего средства, такого как диметилсуберимидат с целью димеризации мономеров рибонуклеазы в растворе рибонуклеазы с поддерживанием в растворе рН 9 или выше; с) понижения рН примерно до 7 с целью прекращения реакции димеризации на данном уровне; d) очистки раствора димеризованной рибонуклеазы проведением первого этапа фильтрования, на котором раствор пропускают через ионообменную смолу и отбирают фракции, содержащие существенные количества димерной формы рибонуклеазы; е) проведения второго этапа фильтрования, на котором фракции, отобранные на первом этапе фильтрования, пропускают через ионообменную смолу; f) сбора в качестве конечного продукта второго этапа фильтрования димерной рибонуклеазы высокой степени чистоты.

Применением вышеприведенного способа можно приготовить в качестве конечного продукта большие количества димера рибонуклеазы, который будет чрезвычайно полезен для лечения различных вирусных и бактериальных заболеваний.

Фиг. 1 и 2 графически иллюстрируют характер элюирования при ионообменной хроматографии, проводимой в соответствии с предлагаемым изобретением.

При получении в соответствии с предлагаемым изобретением димерной формы рибонуклеазы в качестве исходных продуктов могут быть использованы любые доступные в настоящее время мономеры рибонуклеазы. Применяемые в предлагаемом изобретении мономеры рибонуклеазы получены от фирмы Серва Файн Биокемика, ГмбХ, Гейдельберг и имеют каталожный N 28260. Применяемые мономеры могут быть представлены рибонуклеазой А или любой другой из доступных рибонуклеаз. Мономеры рибонуклеазы готовят к реакции соединения их растворением при комнатной температуре в фосфатном буфере с получением раствора мономера рибонуклеазы. В качестве применяемого буфера рекомендуется 0,1 М буферный раствор дигидрата динатрийгидрофосфата, в котором растворяют мономер непрерывным перемешиванием раствора по меньшей мере 2 ч. Приемлемый буферный раствор получен растворением примерно 70 г дигидрата динатрийгидрофосфата примерно в 1000 мл Н₂О. Хотя точные количества реагентов и растворов, применяемых в способе предлагаемого изобретения, могут меняться, тем не менее реакцию димеризации предлагаемого изобретения осуществляют применением 40 60 г мономера рибонуклеазы, растворенных в 5 л раствора дигидрата динатрийгидрофосфата в качестве буфера. Кроме того, рекомендуется установить в растворе мономера значение рН по меньшей мере 9, наиболее предпочтительно около 10. Установление рН может быть проведено добавлением 0,1 н. NaOH.

Реакцию димеризации инициируют добавлением в качестве сшивающего средства суберимидата в определенном отношении к раствору мономера рибонуклеазы с установлением значения рН, равного по меньшей мере 9 или выше, предпочтительно 10 (0,2). В качестве соединяющего средства в предлагаемом изобретении рекомендуется применение диметилсуберимидата, но могут быть также использованы и другие суберимидатные соединяющие реагенты. К раствору мономера, приготовленного вышеописанным способом, рекомендуют добавлять 4-6 г диметилсуберимидата, который растворяется в пределах 1 мин. При непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки или иного устройства реакция димеризации при комнатной температуре (255^оС) протекает в течение 30 60 мин. Реакция может быть прекращена понижением рН до 7 (0,2), что может быть осуществлено добавлением 1 М раствора HCl. В этот момент рекомендуется концентрировать полученную смесь с помощью тангенциальной проточной системы, более подробно описанной ниже.

В различные моменты времени после начала реакции соединения рекомендуется отбирать из раствора образцы для анализа и анализировать их электрофорезом на геле. Исследования электрофорезом на геле показали, что, хотя мономерная форма фермента четко видна почти во всех анализируемых фракциях, полоса, соответствующая димерной форме рибонуклеазы, поддается обнаружению спустя примерно 10 мин после начала реакции. Полоса, соответствующая димерной форме фермента, четко видима спустя примерно 15 мин, и эта полоса становится все более значимой по мере протекания реакции. Кроме того, примерно через 30 мин после добавления сшивающего реагента можно наблюдать образование олигомерных форм фермента. Мономерная форма рибонуклеазы обладает относительной мол.м. 1500, а димерная форма вдвое большей.

Для получения больших количеств продукта, представляющего собой в основном очищенный димер рибонуклеазы, рекомендуется раствор димеризованной рибонуклеазы подвергать по меньшей мере двум этапам фильтрования с целью выделения димеров рибонуклеазы и удаления рибонуклеазы в мономерной или мульмерной форме. Удаленные недимеризованные мономеры рибонуклеазы в результате могут быть собраны, и их рекомендуется в предлагаемом изобретении рециркулировать с еще большим повышением эффективности получения димерной формы фермента.

Для отделения от раствора димеризованной рибонуклеазы олигомеров рекомендуется фильтрование раствора через ионообменную смолу. В рекомендуемом воплощении изобретения фильтрование проводят на колонке, заполненной ионообменной смолой Сефадекс. Колонка с Сефадексом имеет диаметр около 25 см и высоту примерно 120 см, и ее промывают примерно 60 л 50 мМ раствором гидрокарбоната аммония с рН 8,6. Такой карбонатный буфер готовят растворением 4 г гидрокарбоната аммония в 1000 мл воды. Полученный вышеописанным способом раствор рибонуклеазы переносят целиком на колонку и элюируют уравновешивающим буфером. Фракции раствора отбирают с помощью коллектора фракций, например, модели LKB 2211 Suprec при скорости истекания раствора около 80 мл в 1 мин. Характер элюирования регистриуют с помощью регистрирующего устройства, такого как записывающее устройство LKB 2210 при скорости измерения 0,5 мм/мин, а поглощение может быть определено при 280 нм на приборе LKB 2238 UVICOR SII.

Характер элюирования на этом этапе фильтрования обычно выражается тремя пиками: первый пик представляет мультимеры рибонуклеазы, второй пик представляет димеры и последний пик соответствует остающимся количествам мономерной формы фермента. В этот момент рекомендуется также анализировать отдельные отобранные фракции с помощью анализа электрофорезом на геле. Подобный анализ может быть осуществлен способом электрофореза на SDS-полиакриламидном геле (PAGE) по методике Thomas и др. РNAS 72, 2626 (1975). Согласно методике рекомендуется примерно 50 мкл каждой отобранной фракции смешивать примерно с 50 мкл буферного покрытия и нагревать примерно 10 мин при 95^оС. Затем примерно 25 мкл полученной смеси наносят на карман геля. И наконец примерно 4 ч при 20-35 мА ведут электрофорез с разделением различных форм фермента. Полосы белка становятся видимыми при окрашивании таким красителем, как Кумасси голубой R250 (Мерк).

С помощью такого способа электрофореза SDS-PAGE можно идентифицировать и отсортировать фракции, содержащие мономерные, димерные или олигомерные формы рибонуклеазы или их смеси. После выявления состава фракций те фракции, которые в основном содержат димерную форму, отделяют и объединяют. Объединенные фракции димера рекомендуется дополнительно сконцентрировать примерно до 800 мл с помощью тангенциальной проточной системы. Мембранная диафрагма тангенциальной проточной системы может быть вновь ополоснута приемлемым растворителем, в результате чего могут быть удержаны большие количества димера. Такой раствор рекомендуется лиофилизировать и его можно хранить при температуре около 4^оС до того момента, пока не будут проведены этапы дополнительной обработки. В идеальном случае лиофилизацию проводят загрузкой порций раствора примерно на 200 мл в круглодонную колбу на 500 мл и помещением в атмосфере жидкого азота в роторный испаритель. Колбы плотно закрывают и выдерживают 30 мин при -30^оС, после чего лиофилизуют.

Поскольку исходные продукты часто бывают дороги, особенно рекомендуется мономеры, отфильтрованные на предшествующих этапах фильтрования, возвращать в процесс димеризации предлагаемого изобретения. Это может быть осуществлено отбором фракций, в которых показано присутствие заметных количество мономерной рибонуклеазы, их концентрированием с помощью тангенциальной проточной системы и добавлением соединяющего реагента. Реакция соединения протекает так, как указано выше, и точно также рекомендуется проводить этап фильтрования. После лиофилизации рециркулированной рибонуклеазы вновь образованные димеры тщательно смешивают с димеризованным продуктом, полученным в первом цикле димеризации. Повышение выхода димерного продукта вплоть до 30% может быть достигнуто с помощью таких приемов рециркулирования.

Полученные вышеописанным способом растворы, содержащие в основном димер, подвергают дальнейшей очистке проведением второго этапа фильтрования с целью дальнейшего отделения димеров от мономеров и олигомеров и повышения чистоты конечного продукта. В этом случае рекомендуется лиофилизованную ферментную смесь пропускать через ионообменную смолу, например через колонку, заполненную Сефадексом G5OF. Кроме того, рекомендуется, чтобы колонка с ионообменной смолой имела рН около 5, что может быть достигнуто применением 0,2 М натрийацетатного буфера. Натрийацетатный буфер с рН 5 готовят растворением примерно 27 г тригидрата ацетата натрия в 1000 мл воды.

Отобранные фракции, соответствующие согласно определениям на первом этапе фильтрования второму пику, наносят на колонку с Сефадексом. На втором этапе фильтрования рекомендуется применять те же условия и материалы, что и на первом этапе. И вновь регистрируют характер элюирования и применяют для идентификации и выделения целевых фракций, собранных на втором этапе фильтрования. В данном случае характер элюирования проявляется в виде очень большого соответствующего димеру основного пика и только двух слабых вторичных пиков.

И вновь рекомендуется в отобpанных фракциях проводить анализ рибонуклеазных ферментов вышеприведенным способом SDS-PAGE. В результате такого анализа установлено, что фракции, соответствующие основному пику кривой элюирования, содержат в качестве продукта димер рибонуклеазы высокой степени чистоты. В этот момент фракции основного пика объединяют и рекомендуется их концентрирование с помощью тангенциальной проточной системы. Кроме того, в этот момент рекомендуется проведение процесса обессоливания пропусканием фракций через колонку с Сефадексом G 25. Для осуществления процесса обессоливания применяют колонку диаметром примерно 25 см и высотой 65 см, объемом 32 л, работающую при скорости потока в 15 л в 1 ч. Кроме того, применяют 50 мМ буфер гидрокарбоната аммония.

В этот момент продукт представляет собой композицию димера рибонуклеазы высокой степени чистоты. Однако для перевода лиофилизированного димера рибонуклеазы в фармацевтически приемлемую форму рекомендуется подвергнуть димеры операции по удалению эндотоксинов. Т.е. рекомендуется полученный вышеописанным способом очищенный димерный продукт подвергнуть дополнительному хроматографированию, например пропусканием через Детоксигель, обладающий высокой связывающей способностью по отношению к эндотоксинам. Примерная связующая способность по отношению к эндотоксинам Детоксигеля составляет примерно 2 мг/мл. Поскольку возможно неспецифическое связывание и с другими компонентами, такими как белковые димеры, максимальная регенерация димерного продукта может быть достигнута применением буферов в физиологическом интервале значений рН. Добавление 0,1-0,5 М солевого раствора (например NaCl) обеспечивает необходимый интервал значений рН, при котором достигается максимальный выход димера. Как правило, хроматографией раствора, содержащего 1500 Э. Е. /мл, на детоксификационной колонке содержание может быть снижено до менее чем 1 Э.Е./мл.

После удаления эндотоксинов из раствора димера рибонуклеазы раствор собирают, фильтруют в стерильных условиях и загружают для лиофилизации в стерильную круглодонную колбу. Содержание эндотоксинов в конечном препарате может быть определено с помощью диагностического набора, такого как "Коутест (R)" фирмы Каби-Витрум, Мюнхен. Анализ основан на активации пробы с лизатом амебоцитов (мечехвоста) (ЛА) эндотоксинами. Активированная ЛА отделяет от хромогенного субстрата (S-2423) желтый краситель п-нитроанилин, для которого с помощью спектрофотометра определяют затухание при 405 нм в качестве меры содержания эндотоксинов. При содержании эндотоксина ниже 0,1 нг/мг раствор димера загружают в круглодонную колбу и лиофилизуют.

Вышеприведенный процесс может быть повторен столь часто, насколько это возможно, до получения необходимого количества конечного диаметра рибонуклеазы. Отдельные партии димера после очистки могут быть стерилизованы или, если необходимо, дополнительно лиофилизованы, в результате чего будут получены однородные загрузки димера рибонуклеазы, который может быть в высшей степени полезным при лечении многих заболеваний вирусного или бактериального происхождения, таких как указанные в находящейся на одновременном рассмотрении заявке PCT/US 88/01785. Помимо противовирусного и антибактериального действия применение димеров рибонуклеазы может дать и другой лечебный эффект, например, при их использовании в качестве противовоспалительных и антигистаминных средств без потенциальной цитотоксичности, связанной с мономерной формой фермента. Предлагаемый способ особенно привлекателен тем, что в качестве продукта могут быть получены большие количества очищенного перспективного димера рибонуклеазы. Конкретные конечные димеры рибонуклеазы, полученные способом предлагаемого изобретения, могут быть подвергнуты анализу на их ферментивную активность действием на растворы рибонуклеиновой кислоты с регистрацией результатов с помощью спектрофотометра после внесения димера рибонуклеазы. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать димерный фермент высокой степени чистоты, а также определять его активность.

Нижеследующие примеры представлены с целью иллюстрации предлагаемого изобретения и ни в коей мере не предназначены для ограничения его объема.

П р и м е р 1. Получение димера рибонуклеазы.

В химическом стакане с крышкой, содержащем 5 л 0,1 М pаствоpа дигидрата динатрийгидрофосфата, и добавлением 0,1 н. NaOH устанавливают рН 10. Буферный раствор дигидрата динатрийгидрофосфата получают pаствоpением 70,98 г дигидрата динатрийгидрофосфата в 1000 мл воды. Затем при 25^оС (комнатная температура) добавляют в качестве сшивающего средства 5 г диметилсуберимидата (Сигма, N партии 29_F3687), который растворяется в течение 1 мин. Значение рН раствора непрерывно контролируют и поддерживают равным 10 добавлением 0,1 н. NaOH. С помощью магнитной мешалки раствор непрерывно перемешивают с продолжением реакции 45 мин при 25^оС. Реакцию прекращают понижением с помощью 1 М НСl значения рН примерно до 7.

В различные моменты времени после начала реакции соединения отбирают образцы для анализа, которые анализируют электрофорезом на геле. Мономеры, димеры и мультимеры разделяются на SDS-геле. Применяемая мономерная форма рибонуклеазы обладает относительной мол.м. равной 15000, а димерная форма вдвое большей. Анализ электрофорезом показал, что образование полосы димера наблюдается четко спустя 15 мин после добавления соединяющего реагента, и эта полоса становится все более интенсивнее по мере протекания реакции. Помимо этого спустя 30 мин образуются олигомерные формы рибонуклеазы.

Раствор димеризованной рибонуклеазы концентрируют до 800 мл в тангенциальной проточной системе (Миллипор). Система Миллипор включает фильтр "Фильтрон Аусшлюсс 10000d", противоизносную олефиновую мембрану на 7 бар и насос Вердер-80 Типа 20-30 60079. Давление на входе 2 бара и давление на выходе минимальное ниже 0,2 бар. Производительность системы 1 л в 1 ч. Устройство обладает мертвым объемом в 400 мл, поэтому после прекращения процесса концентрирования систему ополаскивают 400 мл, что приводит к повышению полного объема до 1200 мл.

Концентрированный раствор рибонуклеазы затем подвергают фильтрованию на Сефадексе G 50 F (Фармация) с целью отделения образовавшихся в ходе димеризации различных олигомеров. Для фильтрования колонку диаметром 25,2 см и высотой 120 см ополаскивают 60 л 50 мМ буферного раствора гидрокарбоната аммония с рН 8,6. 50 мМ буферный раствор гидрокарбоната аммония готовят растворением 3,95 г гидрокарбоната аммония в 1000 мл воды. Затем белковый раствор целиком (1200 мл) наносят в виде покрытия на слой геля и элюируют уравновешивающим буфером. Фракции объемом примерно 1000 мл отбирают с помощью отборника фракций (LKB 2211 Suprec) в течение приблизительно 15 мин, что соответствует скорости потока в 80 мл/мин. Характер элюирования регистрируют с помощью регистрирующего устройства ЛКБ 2210 при скорости регистрации 0,5 мм/мин, а поглощение определяют при 280 нм на приборе LKB 2238 UVICOR SII. Характер элюирования, как показано на фиг.1, выражается тремя пиками, первый из которых представляет мультимеры рибонуклеазы, второй указывает на димеры и последний пик соответствует мономерным формам фермента. На фиг.1 жирной линией представлен характер поглощения растворов рибонуклеазы при более чувствительном детектировании, чем в случае, представленном тонкой линией на графике.

Смесь рибонуклеаз в отдельных фракциях затем анализируют электрофорезом на SDS-PAGE по методике Thomas и др. PNAS 72, 2626 (1975). Согласно методике 50 мкл каждой фракции смешивают с 50 мкл покрывающего буфера и смесь нагревают 10 мин при 95^оС. Затем 25 мкл полученной смеси распределяют в кармане геля. В ходе анализа в качестве стандарта используют стандартную белковую смесь IV (Мерк), охватывающую мол.м. 12300, 30000, 45000, 66200 и 7600. Применяемый покрывающий буфер состоит из следующих компонентов: 0,72 г трис-НСl (0,06 М), 0,136 г ЭДТК (III) (5 мМ), 0,18 г глицерина (10%), 5 г SDS, устанавливают рН 7,2 (добавление 90 мл воды), 10 мл бета-меркаптоэтанола (10%).

Для проведения электрофореза на геле готовят 18%-ный разделяющий гель, на который наносят 3,9%-ный сбирающий гель. Раствор разделяющего геля для 18% акриламида состоит из следующих компонентов: 9 г акриламида, 0,045 г бисакриламида, 0,136 г трис-НСl с рН 8,8 (0,325 М), 0,03 г SDS, 200 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония, 20 мкл ТЕМЕD.

Раствор сбирающего геля для 3,9% акриламида состоит из следующих компонентов: 0,39 г акриламида, 10,4 мг бисакриламида, 0,125 г трис-НСl с рН 6,8, 10 мг SDS, 100 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕD.

SDS-PAGE получают следующим образом. Берут две стеклянные пластины размером 20 х 20 см, тщательно очищают и ополаскивают этанолом и помещают одну над другой. Двумя разделяющими полосками толщиной 1 мм (длина 20 см, ширина 1 см) обеспечивают пространство между пластинами, которое заполняют гелем. Разделяющие полоски крепят на левом и правом краях пластинок. Нижний край заделывают липкой лентой из текстиля и все три края закрепляют в зажимах. Края дополнительно герметизируют 1%-ным раствором агарозы. После затвердевания агарозы промежуточное пространство в вертикальном положении заполняют вышеприготовленным раствором разделительного геля примерно на 3 см ниже верхнего края стеклянной пластинки и пипеткой Пастера покрывают сверху слоем воды. В течение примерно 30 мин гель оказывается полимеризованным. Слой воды удаляют и край геля ополаскивают один раз вышеохарактеризованным раствором сборного геля.

Затем промежуточное пространство до самого края заполняют раствором сборного геля, после чего вводят гребенку сбора образцов из Тефлона таким образом, что нижний край кармана для образца выступает примерно на 1 см над передним краем слоя разделительного геля. Спустя примерно 15 мин сборный гель оказывается полимеризован, и гребенку удаляют. Затем снимают липкую ленту из текстиля и гель в вертикальном положении присоединяют к устройству для проведения электрофореза. Буферные камеры заполняют буфером для электрофореза (6 г трис-основания (0,05 М), 28,5 г глицина (0,38 М), 1 г SDS (0,1) и 1000 мл Н₂О) и карманы в геле ополаскивают один раз путем опрыскивания буфером. Образцы димера рибонуклеазы нагревают примерно 10 мин при 95^оС в буферном покрытии и им заполняют контейнер или область в кармане для испытуемого образца, соответствующего карману в геле.

Электрофорез ведут примерно 4 ч при 20 мА. Однако если хотят продлить электрофорез примерно на сутки, его проводят при пониженном токе в 6-8 мА. Движущийся фронт становится видимым пpи подмешивании в кроющий буферный раствор 0,02 бромфенола голубого. Электрофорез прекращают, когда движущийся фронт достигает верхнего края геля. Разделяющий гель отрезают, сушат примерно 30 мин в фиксирующем растворе и затем вновь обеспечивают в течение 2 ч в отбеливающем растворе, состоящем из 400 мл метанола, 140 мл уксусной кислоты и 2000 мл H₂O. Фиксирующий раствор готовят смешиванием 500 мл отбеливающего раствора с 12 мл раствора красителя, включающего 1 г Кумасси голубого (Р250, Мерк), 50 мл Н₂О и 50 мл метанола. Полосы белка делают видимыми окрашиванием вышеприведенным раствором красителя. Определение следов с применением метода SDS-PAGE показало постепенное увеличение в образцах количества димеризованной рибонуклеазы при непременном содержании в образцах также и мультимеров.

Все фракции, содержащие в основном димерную форму, объединяют и концентрируют до 800 мл в тангенциальной проточной системе (Миллипор). Мембранную диафрагму вновь ополаскивают 400 мл раствора, прошедшего через мембрану, так что в итоге сохраняется общий объем раствора димера в 1200 мл. Полученный раствор лиофилизуют и хранят при 4^оС до следующего этапа. Лиофилизацию проводят делением раствора порциями по 200 мл в круглодонных колбах на 500 мл. Колбы помещают в жидкий азот и вымораживают в роторном испарителе (Гейдольф VV60). Затем колбы плотно закрывают и выдерживают 30 мин при -30^оС. Наконец полученный продукт лиофилизуют использованием стандартных рабочих методик.

Перед следующим этапом процесса мономерную рибонуклеазу, отфильтрованную на первом этапе фильтрования, собирают и рециркулируют на димеризацию. Для этого отфильтрованные фракции, содержащие в основном рибонуклеазу в мономерной форме, объединяют и концентрируют до 4 л с помощью вышеупомянутой тангенциальной проточной системы. Затем мономерные фракции димеризуют с применением соединяющего реагента по вышеприведенной методике. После стадии соединения с применением рециркулированных мономеров по вышеприведенной методике осуществляют этап фильтрования по вышеприведенной методике с переводом рециркулированных мономеров в димерную форму. Продукты лиофилизации, полученные в первом процессе димеризации, объединяют с димерными продуктами лиофилизации, полученными из рециркулированных мономеров.

Объединенную смесь лиофилизованной рибонуклеазы, полученную в результате указанных операций, затем вновь хроматографируют на Сефадексе G50F с целью лучшего отделения димеров от мономеров и олигомеров. Хроматографию проводят использованием колонки с Сефадексом G50F (Фармация) и 0,2 М буферного раствора ацетата натрия с рН 5. 0,2 М буферный раствор ацетата натрия получают растворением 27,22 г тригидрата ацетата натрия в 1000 мл воды. Хроматографию проводят в тех условиях и с применением той же аппаратуры, что и на первом этапе фильтрования.

Достигнутый в этом случае характер элюирования представлен на фиг.2. На диаграмме жирной линией показано поглощение растворами рибонуклеазы при более чувствительном детектировании, чем в случае, показанном тонкой линией. В середине диаграммы при более чувствительном детектировании показан большой основной пик, соответствующий димеру, при котором имеются всего два слабых вторичных пика. SDS-PAGE анализ ферментов, отобранных из фракций пика, показал значительное накопление димеров в основном пике, если сравнивать с характером элюирования на первом этапе фильтрования.

Фракции основного пика объединяют и концентрируют с помощью вышеописанной тангенциальной проточной системы. Для обессоливания собранные фракции пропускают через колонку с Сефадексом G25. Диаметр колонки 25,2 см, высота 65 см, базовый объем 32 л, и колонка работает при скорости потока 15 л/ч. Все растворы рибонуклеазы основного пика второго этапа фильтрования (максимум 5 л) наносят на колонку с Сефадексом. Обессоливание осуществляют применением 50 мМ буферного раствора гидрокарбоната аммония. Цикл обессоливания длится 90 мин, в течение которых отбирают 5 л. Остальные продукты цикла отбрасывают. Регистрируют характер элюирования и в колбу Шотта на 5 л отбирают единственный пик. Следы образца очищенного конечного продукта откладывались на графике в условиях восстановления бета-меркаптоэтанолом и в невосстановленном виде, SDS-PAGE анализ очищенного конечного продукта показал присутствие только димерной формы рибонуклеазы.

Для перевода лиофилизованного белка в фармацевтически приемлемую форму необходимо из димерной рибонуклеазы удалить эндотоксины. Для этой цели очищенные димеры хроматографируют на колонке с Детоксигелем. Для достижения максимальной регенерации целевого димера рибонуклеазы необходимо применять буферные растворы со значением рН в физиологическом интервале. Этого достигают использованием солевых растворов. Растворы фермента наносят на колонку с Детоксигелем с удалением при этом вплоть до 1500 Э.Е./мл. Перед и после каждого цикла Детоксигель регенерируют 1% дезоксихолата с последующим тщательным ополаскиванием водой до тех пор, пока в промывных водах не перестанет обнаруживаться эндотоксин. Объем колонки 750 мл (диаметр 9,5 см, высота 14 см), и колонку уравновешивают 0,1 М раствором бикарбонатата аммония. Не содержащий эндотоксина буферный раствор смешивают со стерильной водой. Раствор рибонуклеазы в объеме 2 л наносят на слой геля и оставляют впитываться в гель. Затем блок элюируют уравновешивающим буфером и собирают в стерильные химические стаканы. Затем раствор направляют на лиофилизацию в стерильной круглодонной колбе.

Содержание эндотоксинов в препарате определяют с помощью диагностического набора под названием "Коутест (R)" фирмы Каби-Витрум, Мюнхен. Анализ основан на активации лизата амебоцитов (ЛА), эндотоксинами (лимулис-тест). Активированный ЛА отделяет от хромогенного субстрата (S-2423) желтый краситель п-нитроанилин, и изменение в окраске определяют спектрофотометром при 405 нм в качестве меры содержания эндотоксина. Полученную в качестве продукта очищенную димерную рибонуклеазу, содержащую менее 0,1 нг/мл эндотоксинов, загружают в круглодонные колбы и лиофилизуют. Полученный продукт представляет собой раствор лиофилизованного димера рибонуклеазы высокой степени чистоты, который может храниться, пока не потребуется для дальнейшего использования.

П р и м е р 2. Анализ ферментативной активности.

Ферментивная активность димерной рибонуклеазы, полученной способом предлагаемого изобретения, может быть определена методом определения активности, приведенным в работе Kunitz, J. Gen. Physiol 24, 15 (1940). Определение основано на том факте, что в результате влияния рибонуклеазы на рибонуклеиновую кислоту ее спектр поглощения в УФ-диапазоне смещается к коротковолновой границе. В интервале 290-305 нм концентрация нуклеиновой кислоты уменьшается в результате гидролиза под действием рибонуклеазы. В начальной фазе реакции это уменьшение происходит линейно, и может быть использовано в качестве меры ферментивной активности. В данном случае уменьшение количества нуклеиновой кислоты определяют при 300 нм.

Определение проводят при постоянной температуре 25^оС, при этом используют регулируемую кювету с тем, чтобы все растворы могли быть обработаны перед использованием в течение 5 мин при 25^оС. Показания снимают на спектрофотометре при 300 нм. Реакционный объем составляет 3 мл, и реакцию проводят в кювете на 3 мл при толщине слоя 1 см.

Реакционную смесь готовят использованием 1,5 мл раствора рибонуклеиновой кислоты, 0,05 0,5 мл испытуемых образцов, включая фракции рибонуклеазы, и воды, добавляемой до объема 10 мл. Раствор рибонуклеиновой кислоты готовят растворением 80 мг натриевой соли рибонуклеиновой кислоты (Боэрингер) в 50 мл ацетатного буфера. Ацетатным буфером является 0,1 М ацетатный буфер с рН 5, который получают смешиванием 0,57 мл ледяной уксусной кислоты примерно с 80 мл дистиллированной воды, установлением рН 5 добавлением 1 н. NAOH и доведением объема до 100 мл добавлением дистиллированной воды с последующим фильтрованием в стерильных условиях. Растворы испытуемого образца, включая димеры рибонуклеазы, получают растворением 5 мг образца димера рибонуклеазы в 5 мл дистиллированной воды и разбавлением таким образом, что определяемое значение находится в благоприятном интервале.

Растворы рибонуклеиновой кислоты и испытуемого образца смешивают в кювете и уменьшение нуклеиновой кислоты прослеживают примерно 20 мин применением спектрофотометра Спектроник 101 (Бош энд Ломб). Регистрируют характер поглощения, причем около 8 мин наблюдается линейный интервал. Реакцию продолжают при 25^оС до полного ее завершения, что происходит спустя примерно 3 ч. Затем растворы вновь анализируют для определения конечных величин и измерения повторяют дважды для получения усерединенных величин.

Для подсчета ферментивной активности необходимо определить затухание нуклеиновой кислоты в начале реакции (Е_о) и конечное затухание (Е_е) реакции в момент Е/мин линейного начального интервала. Разбавление испытуемого образца димера рибонуклеазы должно быть подобрано таким образом, что Е/мин не превышает 0,007. Контрольные величины получают на основе реакционной смеси, приготовленной из рибонуклеазы и воды, и их значения следует вычесть из определенных величин. Ферментивную единицу определяют как количество фермента, в присутствии которого в условиях реакции для субстрата с концентрацией 25% происходит 100%-ное в минуту уменьшение величины Е-Е_е. Наибольшее возможное значение затухания, наблюдаемое при 300 нм, равно Е-Е_о. Подсчет удельной активности фермента проводят согласно следующему отношению: Димерные рибонуклеазы предлагаемого изобретения показали значительную ферментативную активность.

Формула изобретения

1. Способ получения очищенного димера рибонуклеазы, предусматривающий приготовление раствора рибонуклеазы добавлением мономера рибонуклеазы к буферному раствору, димеризацию мономера рибонуклеазы посредством добавления к раствору суберимидатного сшивающего реагента, причем рН раствора поддерживают на требуемом уровне, а затем остановку реакции димеризации в данный момент посредством снижения рН, очистку полученного раствора димеризованной рибонуклеазы посредством жидкостной хроматографии, элюирование и сбор фракций, содержащих целевой продукт, отличающийся тем, что значение рН указанного буферного раствора устанавливают по меньшей мере равным 9, значение рН раствора рибонуклеазы во время реакции димеризации поддерживают на уровне по меньшей мере 9, реакцию димеризации останавливают в заданный момент снижением рН до примерно 7, а очистку проводят по меньшей мере в две стадии жидкостной хроматографии полученного раствора димерсодержащих фракций, которые предусматривают пропускание раствора по меньшей мере дважды через катионообменную колонку, за