Способ получения алкалофильного штамма бацилл с пониженным уровнем внеклеточной щелочной протеазы, способ получения высокощелочной протеазы и мутантная форма высокощелочной протеазы

Способ получения алкалофильного штамма бацилл с пониженным уровнем внеклеточной щелочной протеазы, способ получения высокощелочной протеазы и мутантная форма высокощелочной протеазы

Реферат

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: из генома алкалофильного штамма бацилл (в частности, Вас. novo pb 92) изолируют фрагмент ДНК, содержащей ген щелочной протеазы и прилежащие к нему 5' - 3' - некодирующие области, встраивают его в подходящий вектор клонирования с получением рекомбинантной ДНК, из которой затем удаляют кодирующую часть гена; полученным вектором трансформируют клетки алкалофильного штамма дикого типа и отбирают трансформанты с дефектом по щелочной протеазе. Полученный таким образом штамм с пониженным уровнем внеклеточной щелочной протеазы используют в качестве штамма - реципиента при получении методом рекомбинантных ДНК мутантных форм высокощелочной протеазы со следующими аминокислотными заменами (по отношению к аминокислотной последовательности фермента дикого типа Вас. novo pb 92): Met₂₁₆ gln, Met₂₁₆Ser Ser₁₆₀ Asp, Asn₂₁₂ Asp, полученными путем сайтнаправленного мутагенеза в соответствующем структурном гене. 3 с. и. 3 з. п. ф-лы, 22 ил., 1 табл.

Предлагаемое изобретение касается способа производства мутантных протеинов с использованием технологии рекомбинантной ДНК. В частности, изобретение касается эффективного производства модифицированных белковой инженерией протеаз Bacillus с использованием гомологичного штамма-хозяина Bacillus, который лишен способности продуцировать соответствующую немодифицированную протеазу.

Бациллы широко используются для получения промышленно важных ферментов, таких как -амилазы, нейтральные протеазы и щелочные или сериновые протеазы (например, Дебабов. Промышленное использование бацилл. "Молекулярная биология бацилл", изд. Академия, Нью-Йорк, 1982).

Главное преимущество использования бацилл состоит в больших количествах секретируемого белка, исключении производства опасных веществ и их долгой истории безопасного промышленного применения. Некоторые виды бацилл поэтому были одобрены для производства белков, предназначенных для пищевых целей.

Palva (и др. "Gene" 19, 1982, 81-87) продемонстрировал возможность использования Bacillus subtilis в качестве хозяина для экспрессии гетерологичных протеинов путем осуществления экспрессии гена -амилазы от В.амyloliquefaciens в В.subtilis. Другие источники, описывающие экспрессию гетерологичного гена в В.subtilis, следующие: (например) Fahnestock и Fisher, J.Bacteriol. 165, 1986, 796-804, которые показали экспрессию гена Протеина А золотистого стафилококка, Schein и др. "Biotechnology", 4, 1986, 719-725, который раскрыл экспрессию человеческого интерферона-2, и Wang и др. "Gene" 69, 1988, 39-47, который показал экспрессию и секретирование -фактора (человеческого предсердного натриуретического).

Для обеспечения надлежащей секреции этих гетерологичных протеинов в первых двух источниках использовалась сигнальная последовательность -амилазы, и в последнем источнике сигнальная последовательность гена субтилизина (аргЕ) В.subtilis, которую встраивали в экспрессируемый ген.

Основной проблемой у штаммов Bacillus как хозяев-производителей рекомбинантных белков является то, что они продуцируют и секретируют множество протеаз, которые имеют тенденцию к деградированию продуцируемых гетерологичных протеинов, например, Old and Primrose, "Principles of Gene Maipulation", 3-е изд. 1985, 289, Blackwell, Oxford.

В заявке РСТ WO-89/04866 подчеркивается значение внеклеточных протеаз; около 90% протеолитической активности приписывается нейтральной металлопротеазе (npr) и сериновой протеазе (щелочная протеаза-арг)).

Различные решения предлагались для устранения этой проблемы деградации.

Kawamura and Doi. J.Bacteriol. 160, 1984, 442-444 раскрывают двойной мутант В.subtilis, у которого отсутствуют и внеклеточная нейтральная, и щелочная протеаза. Сначала B.subtilis DB 100 был сделан негативным по нейтральной протеазе путем переноса мутаций прг R2 и прг Е18 из В.subtilis Т18. Затем фрагмент 178вр, содержащий участок арг-гена, удаляли путем генной конверсии.

Fahnestock и Fisher, Appl. Environ. Microbiol. 53, 1987, 379-384, описывают конструирование арг-негативного штамма. В.subtilis, происходящего из nрr-негативного штамма. Эти авторы использовали плазмидный вектор, содержащий арг-ген, и интродуцировали саt-ген (передающий резистентность к хлорамфениколу) в качестве инактиватора и как способный к селекции маркер. Затем хромосомный арг-ген замещали этой конструкцией.

Обнаружили и секвенировали третий ген внеклеточной протеазы (ерг) из B. subtilis. Частичной делецией этого гена было показано, что он лишь маргинально участвует в активности внеклеточной протеазы.

При более тщательном изучении полученных штаммов оказалось, что ни один из вышеупомянутых штаммов В.subtilis не избегает полностью внеклеточной протеолитической активности. Поэтому все еще остается насущной потребность в улучшенных, не вырабатывающих протеаз штаммах B.subtilis, которые могут использоваться для получения гетерологичных белков. Эта потребность даже увеличивается, когда ставится задача осуществления экспрессии мутантных протеаз.

В нескольких публикациях описывается получение мутантных протеаз с использованием штаммов-хозяев Bacillus suvtilis, которые неспособны к экспрессии гена протеазы дикого типа, для исключения образования смеси мутантных протеаз с протеазами дикого типа.

В ЕР-А-О 246 678 (содержание которой соответствует заявке ЕР-А-О 130 756) раскрыт штамм B.subtilis, который неспособен к секреции ферментоактивного субтилизина или нейтральной протеазы, который, однако, экспрессирует гены гетерологичной протеазы, изолированные или извлеченные из В.amyloliquefaciens. Сайт-специфичный сатурационный мутагенез проводят на гене В.amyloligue faciens, а мутанты экспрессируют. Негативную базу штаммов-хозяев B. subtilis создают частично делецией одного из (или обоих) исходных генов протеаз или NTG-мутагенезом (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин). Далее подчеркивается, что описанный хозяин B.subtilis нормально спорулирует, и что не образующие спор мутанты являются неудовлетворительными для производства (рекомбинантных) белков.

В WO 86/01825 (Fahnestock и Fisher, цитируемые выше) описываются штаммы Bacillus, в частности B.subtilis, с пониженным уровнем внеклеточных протеаз. Ген щелочной протеазы инактивируется путем инсерции "ин витро" гена, кодирующего белок, который передает микроорганизму признак фенотипа.

Плазмидный вектор, содержащий инсерционно инактивированный ген протеазы, вводят в B.subtilis и инактивированным геном замещают природный хромосомный ген путем гомологической рекомбинации.

WO 88/08033 раскрывает аналоги субтилизина субтилизин Карлсберга, субтилизин DY, субтилизин BPN, арг-субтилизин из B.subtilis и субтилизин из B. mesentericus. Эти мутанты получают путем замены одной или более аминокислот в кальций-связывающем сайте или возле него отрицательно заряженными аминокислотами (напр. Asp или Glu). Мутанты экспрессируют в B.subtilis.

WO 89/04866 раскрывает штамм B.subtilis с низкой активностью секреции протеаз, который был создан введением SpoOH-мутации в арг-прг двойной мутант, с получением аспорогенного штамма. Полученный тройной мутант арг^-прг^-SpoOH^- проявляет очень низкую активность секреции протеаз.

Обсуждаемые выше источники описывают экспрессию гомологичных и гетерологичных генов в B.subtilis и конструирование протеазо-негативных штаммов B. subtilis. Оказалось, что протеазо-негативные штаммы, созданные частичной делецией гена протеазы или путем инсерции другого гена в ген протеазы, проявляют некоторые недостатки, например исходный (оригинальный) ген может быть реактивирован. Если ген, который является гомологичным инактивированному хромосомному гену, вводится в клетку (например, на плазмиде), то гомологическая рекомбинация может привести к реактивации этого гена; исходный ген, хотя и инактивированный, может привести к получению продуктов частичной экспрессии, когда область промотора еще активна. Это невыгодно вследствие снижения метаболической активности; введение нежелательных фенотипических признаков, например, резистентности к антибиотикам, которая зависит от инсерцированного гена; нестабильность плазмид из-за наличия гомологии между геномной последовательностью и частью плазмиды.

Поэтому желательно исключить все последовательности с возможной гомологией между хромосомой и плазмидой.

У B.Subtilis имеются также и другие недостатки при получении с ее помощью щелочных протеаз или других ферментов.

Хотя Wells и др. Nucl. Acids. Res. 11, 1983, 7911-7925, показали, что экспрессия субтилизина BP N' В.Аmyloliquefaciens в В.Subtilis возможна с ее собственными транскрипционными сигналами, Jacobs и др. Nucl. Acids Res. 13, 1985, 8913-8926, показали, что такая стратегия не всегда применима. Продемонстрировано, что область 5' гена субтилизина Карлсберга, извлеченного из B. licheniformis, не содержит функциональных сигналов для транскрипции в В.Subtilis. Для достижения значительного производства было необходимо инсерцировать промотор B.Subtilis перед геном, о котором идет речь. Предполагают также, что не только процесс транскрипции, но также и процессы трансляции, секреции и созревания могут оказаться менее эффективными у гетерологичных хозяев из-за несовершенной последовательности Shine Dalgarno, или даже из-за несовместимости генного продукта с гетерологичным хозяином.

Описанных выше проблем экспрессии можно избежать, если продукт синтезируется в гомологичном штамме В.Subtilis с установленными высокопроизводительными способностями и высокой эффективностью, которая приводит к высоким уровням производства.

Предлагаемое изобретение представляет собой получения протеаз, отличающихся по меньшей мере на одну аминокислоту от протеаз дикого типа, который предусматривает использование гомологичного алкалофильного штамма Bacillus в качестве хозяина экспрессии, при этом указанный штамм неспособен продуцировать протеазу дикого типа.

По одному аспекту предлагаемого изобретения хромосомный ген высокощелочной протеазы исключается из хромосомы, при этом полученный протеазонегативный штамм может быть использован в качестве хозяина для экспрессии гомологичных или гетерологичных протеаз.

По другому аспекту изобретения хромосомный ген высокощелочной протеазы заменяется мутантной копией этого гена.

Обеспечиваются также методы конструирования этих новых трансформированных штаммов, используемые для этого векторы и способ получения мутантных протеаз.

По предпочтительному варианту выполнения продуцируют протеазы, показывающие близкую гомологию с протеазами, исходно продуцируемыми соответствующим штаммом.

Предпочтительными штаммами являются новые виды Bacillus РВ92, а также их производные и близкие им штаммы, трансформированные геном, кодирующим мутантную протеазу. Указанный ген показывает по меньшей мере 30%-ную, предпочтительно 50% -ную и более предпочтительно 80%-ную гомологию с геном дикого типа Bacillus РВ92, кодирующим сериновую протеазу. Этот ген предпочтительно извлекают (производят) из гена дикого типа алкалофильного штамма Bacillus. Особенно предпочтительными штаммами являются аспорогенные алколофильные виды рода Bacillus.

На фиг. 1 показано строение плазмиды рМ58 содержащей части 5' и 3' боковых областей гена щелочной протеазы из нового вида Bacillus РВ92.

На фиг. 2 схематически показано введение температурно-чувствительного источника репликации из плазмы рЕ194 neo-1 в плазмиду рМ58 с получением плазмиды рЕМ58 .

На фиг. 3 показано введение путем гомологической рекомбинации плазмиды рЕ58 в 5' боковую область протеазного гена штамма Bacillus РВ110.

На фиг. 4 дана упрощенная карта рестрикции, показывающая области, окружающие изъятый ген протеазы после нелегитимной ("незаконной") рекомбинации. Получены два штамма РВТ 125 и РВТ126.

Фиг. 5,6 показывают нуклеотидную последовательность Hind III-фрагментов РВТ125 (фиг.5) и РВТ126 (фиг.6).

Фиг.7 схематически представляет введение гена протеазы в М13 мр.18.

На фиг. 8-14 показана нуклеотидная последовательность плазмиды рВНА-1.

Фиг.15 показывают введение гена штамма Baciilus РВТ 110 в плазмиду рВНА-1.

На фиг. 16 показана переориентация FI ori, содержащей ВамНI-фрагмент рВНАI-MXL-дающей плазмиды рВНАR-MXL.

На фиг. 17 показано субклонирование 3'-последовательности высокощелочной протеазы в плазмиду рВНАR-MXL, дающую плазмиду рВНАRB-MXL.

Фиг. 18 показывает делецию последовательности Е.соli из плазмиды рВНВ-MXL М216Q, дающей плазмиду рНАRB-MXL М216Q.

Фиг. 19 показывает переориентацию гена резистентности к неомицину в плазмиду рЕ194 neo-3, дающую плазмиду рЕ194 neo-1.

Фиг. 20 схематически показывает введение чувствительного к температуре источника репликации из плазмиды рЕ194 neo-3 в плазмиду рЕN₃O, дающую плазмиду рВНВ-MXL М216Q.

Фиг. 21 схематически показывает строение штамма Bacillus РЕР111.

И фиг. 22 схематически показывает строение штамма Bacillus РЕР211.

Сериновые протеазы, которые продуцируются штаммами рода Bacillus, обычно называют щелочными протеазами. Протеазы, используемые по настоящему изобретению, извлечены на алкалофильных бацилл и поэтому будут далее называться высокощелочными протеазами.

Для производства высокощелочных протеаз в качестве клеточных хозяев предпочтительно используют алкалофильные штаммы Bacillus. Для широкомасштабного производства необходимы промышленные штаммы. Они происходят из организмов, которые могут быть выделены из почвы или доступны из депозитариев или других источников, и получены генетической модификацией таких штаммов Bacillus. Промышленные штаммы Bacillus определены в ЕР-А-О 134 048. Они характеризуются своей резистентностью к генетическому обмену, такому как инфекция фага или трансформация. Эти штаммы стабильны и могут (или не могут) образовывать споры. Они обычно являются прототрофными и модифицированными для обеспечения высокого выхода эндогенных белковых продуктов, таких как альфа-амилаза и различные протеазы. Выход эндогенного белкового продукта, полученного промышленным способом производства, может достигать по меньшей мере 5 г/л (0,5 вес./об.). Промышленные штаммы также секретируют ДНазы, что приводит к деградации ДНК в среде, обеспечиваемой для защиты против генетического обмена.

В качестве штамма-хозяина предпочтительно использовать штамм, из которого изначально изолирован протеазный ген, поскольку только в этом случае можно быть уверенным в том, что все необходимые для экспрессии сигналы функционируют.

Дополнительным преимуществом использования алкалофильных бацилл в качестве продуцирующих штаммов является минимальный риск загрязнения другими микроорганизмами вследствие щелочного рН при ферментации.

Согласно предлагаемому изобретению раскрыт способ делеции гена, кодирующего бацилльную протеазу, из генома таким образом, что реверс (возврат) становится невозможным. Указанная делеция может быть частичной (поскольку оставленные в хромосоме последовательности являются слишком короткими для гомологичной рекомбинации с плазмидным геном, кодирующим протеазу), однако более предпочтительно ген изымается полностью. Протеазо-негативный штамм, полученный этим способом, используют для производства гомологичных мутантных протеаз после введения вектора экспрессии, несущего ген, кодирующий эту мутантную протеазу. Однако при этом понимается, что такой протеазо-негативный штамм может быть также с выгодой использован для экспрессии других белков, как гомологичных, так и гетерологичных. В этом контексте полагают, что экспрессия мутантных протеаз с использованием в качестве клетки-хозяина клеток, из которых был выделен ген дикого типа, является гомологичной экспрессией.

Было обнаружено, что при использовании продуцирующего промышленную протеазу штамма Bacillus в качестве хозяина для продуцирования мутантов этой протеазы высокая эффективность производства исходной (оригинальной) протеазы передается в отношении мутантной протеазы. Это приводит к неожиданно замечательной эффективности производства по сравнению с лабораторными штаммами. Одна хромосомная копия мутированного гена дает при экспрессии и секреции в промышленном штамме выход, даже больший, чем 50 плазмидных копий, содержащих мутированный ген, по сравнению с лабораторным штаммом.

В другом аспекте настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что аспорогенные бациллы могут использоваться для получения высокого уровня экспрессии гена протеазы.

Настоящее изобретение также показывает (таблица 7),что для получения высокого производства высокощелочной протеазы, извлеченной из Bacillus РВ92 вида Subtilis, предпочтительно осуществить инсерцию промотора, который активен у B.Subtilis перед этим геном. Если в В.Subtilis продуцируются ферменты, извлеченные из других бацилл, то может быть необходима инсерция промотора, активного у В.Subtilis или других экспрессионных сигналов, что потребует еще одной стадии способа.

Бациллы, продуцирующие высокощелочную протеазу, плохо расклассифицированы таксономически, и на них ссылаются в общем виде как на алкалоцильные штаммы Bacillus. Для настоящего изобретения определяют алкалофильные бациллы как штаммы Bacillus, которые растут в условиях щелочной среды при рН 9-11 (K. Horikoshi и Т.Akiba, 1982, "Alkalophilic miсroorganisms", изд. Шпрингер, Нью-Йорк). Щелочные протеазы, продуцируемые такими бациллами, также называются высокощелочными протеазами. Примеры штаммов Bacillus, способных к развитию в щелочном рН, описываются, например, в патенте США 3.723.250 доп. 30.502 и 4.480.037. Примером алкалофильного штамма-хозяина рода Bacillus является новый вид РВ92, раскрытый между прочим в патенте США дор. 30.602. Производные этих алкалофильных штаммов Bacillus, которые были усовершенствованы для производства протеазы, применяются для получения их протеаз в промышленном масштабе (ЕР-А-О 284 126). Эти продукты имеют различное промышленное применение, например, в качестве добавок в стиральные моющие средства. Примерами таких продуктов являются Махасаl^R (GiSt-brocade^S/IBIS), Savinase^R(NOVO), Esperase^R (NOVO).

Мутанты этих продуктов описаны в WO 89/06279, где указывается, что они извлекаются из штаммов Baсillus lentus, а также в опубликованной позже патентной заявке ЕР-А-О 328 229.

Согласно предпочтительному выполнению настоящего изобретения обеспечиваются трансформированные штаммы Bacillus, которые продуцируют мутанты, описанные в ЕР-А-О 328 229 и WO 89/06279, предпочтительно в промышленном масштабе.

Согласно настоящему изобретению для использования пригоден штамм Bacillus, в частности алкалофильный Bacillus, предпочтительный вид Bacillus РВ92. Другой предпочтительной группой штаммов Bacillus являются аспорогенные мутанты, из которых наиболее предпочтительны РВТ110 и его производные.

Трансформация алкалофильных штаммов Bacillus предпочтительно предусматривает использование протопластов указанных штаммов. Однако обычный метод протопласт-трансформации, как он описан S.Chang и S.M.Cohen, Molec. Gen.Genet, 168, 1979, 111-115, не действует в отношении алкалофильных штаммов Bacillus. Методы, необходимые для этих штаммов, раскрыты в ЕР-А-О 283 075, который включается в описание в виде ссылки.

Экспрессия мутантных генов протеаз в гомологичных хозяев требует замены и/или инактивации гена дикого типа. Могут быть использованы следующие методы.

А) Один из методов предусматривает клонирование этого гена или его части, его модифицирование сайт-направленным мутагенезом и реинтродукцию этого (частичного) гена в клетку на плазмиде. С помощью гомологической рекомбинации этот ген может быть введен в хромосому. Это приводит к ситуации, когда ген дикого типа и мутантный ген расположены тандемно. После второй рекомбинации в хромосоме остается модифицированная последовательность, достигая таким образом эффективное интродуцирование мутации в хромосомный ген. (фиг. 21).

В) По другому методу копию хромосомного гена инактивируют делецией. Если в качестве стратегии выбрана делеция этого гена, то фрагмент хромосомного гена, подвергаемого делеции, предпочтительно представляет собой полную кодирующую область. После инактивации мутантную копию инактивированного гена вносят в клетку на клонирующем векторе.

С) По другому методу осуществляют мутагенез копии хромосомного гена. В принципе можно получить (специфичные) мутации "ин виво" после трансформации бактерии мутагенными олигонуклеотидами. Такой метод успешно использовался на дрожжах, как описано Moerschell и др. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 1988, 524-528.

Если такой метод осуществляют на гомологичном, предпочтительно на гомологичном алкалофильном штамме Bacillus, то это выполнение настоящего изобретения.

Настоящее изобретение касается штаммов Bacillus, которые известны как эффективные продуценты протеазы. По одному из предпочтительных методов из хромосомы удаляют делецией всю область, кодирующую высокощелочную протеазу. В этом выполнении используют вектор, содержащий ген щелочной протеазы, включающий его 5' и 3' области. Ген протеазы удаляют из вектора "ин витро", оставляя позади 5' и 3' боковые последовательности. Этот вектор вносят в алкалофильный штамм Bacillus. Вектор встраивается в хромосому посредством гомологической рекомбинации в боковой области. Аутрекомбинация и растворение приводят к получение штамма Bacillus, у которого изъят протеазный ген. В качестве этого вектора предпочтительно используют плазмиду. Чтобы сделать возможной селекцию, в плазмиду вводят способный к селекции маркер, предпочтительно с резистентностью к антибиотикам, например к неомицину. Предпочтительно, этот вектор может быть селективно интегрирован в хромосому, что может быть достигнуто путем введения способного к индукции источника репликации, например температурно-чувствительного источника как один из рЕ194. Указанную плазмиду вводят в гомологичного клеточного хозяина. В условиях высокой температуры плазмида неспособна к репликации, так что хромосомные интегранты могут быть подвергнуты селекции. Селекцию интегрантов проводят при высоких температурах в присутствии подходящего антибиотика (например, неомицина). Отделение плазмиды от хозяйской хромосомы может сохранить фланкирующие области в хромосоме с удалением при этом кодирующей области. Наконец, полученный селектированный мутант теряет ген способного к селекции маркера (является чувствительным к неомицину) и становится протеазо-негативным. Окончательную хромосомную конфигурацию определяют рестрикционным анализом и блоттингом (Southern). В WO 88/06623 пространно описываются возможные механизмы интеграции. Ген протеазы, модифицированный сайт-направленным мутагенезом, теперь вводится в протеазо-негативную клетку на подходящем экспрессионном векторе. Должно быть обращено внимание на то, чтобы плазмида несла короткие последовательности, гомологичные хромосоме, или вообще не содержала их, чтобы избежать нестабильности плазмиды.

Вместо экспрессирования мутантного гена протеазы из вектора возможно также интегрировать мутантный ген протеазы в хромосому протеазо-негативного штамма. Это может быть достигнуто оставлением боковых областей протеазного гена, граничащих с мутантным протеазным геном в плазмиде. Введение такой плазмиды может стимулировать гомологическую рекомбинацию в боковых областях с введением при этом мутантного протеазногоо гена в хромосому протеазо-негативного штамма. Это особенно выгодно, если плазмида оказывается нестабильной. Настоящее изобретение также показывает, что количества полученного рекомбинантного мутанта или протеазы дикого типа сравнимы или даже выше, когда в геном интегрируется одна копия гена, чем если имеется несколько копий гена, кодируемого плазмидой.

По еще одному выполнению хромосомный ген высокощелочной протеазы заменяется мутантным геном посредством гомологической рекомбинации, без предварительного изолирования протеазо-негативного штамма.

Протеаза экспрессируется и может быть выделена как из клеток, так и из среды, когда секретируется белок. После ее выделения протеаза может быть очищена и включена в состав моющего средства. Поскольку по описанной системе производства ген дикого типа полностью изъят, то приготовляемая мутантная протеаза полностью свободна от протеазы дикого типа.

Плазмида рМ58, сконструированная, как описано в ЕР-А-О 284 126, содержит ген высокощелочной протеазы. Для получения инактивированной плазмиды кодирующую область протеазного гена удаляют двойным перевариванием Ball/HpaI. Температурно-чувствительный источник репликации из рЕ194 neo-I вводится в последующем. Конструкцию рЕМ58 вводят в штамм РПТ110 Bacillus.

Интеграция по так называемому механизму типа СамарвеII имела место в 5' боковой области протеазного гена, с получением протеазо-позитивного штамма, несущего целый плазмидный вектор в протеазном месте своей хромосомы (фиг.3).

Последующая селекция протеазо-негативных производных этого штамма выявила два штамма РВТ125 и РВТ126, которые потеряли протеазный ген и неомициновый маркер. Дальнейший анализ показал, что на этом втором этапе произошла нелегитимная рекомбинация.

Поскольку полученные штаммы Bacillus не проявили обнаружимой протеазной активности, их можно было использовать для экспрессии измененных протеазных генов. Ясно, что штаммы РВТ125 и РВТ126 являются только примерами. В случае, когда нелегитимная рекомбинация дает разные результаты, будет важным определить, полный ли ген был изъят. Для получения более специфичных штаммов могут быть созданы гомологичные рекомбинанты.

Данные в заявке примеры в основном описывают два специфичных выполнения изобретения. Одно из них это производство кодируемой плазмидой мутантной протеазы из протеазо-негативного штамма. Другое выполнение предусматривает производство мутантной протеазы, при котором мутантный ген вводится в геном путем генного обмена. Сразу же будет понятно специалисту, что возможны и другие варианты выполнения, например хромосомная интеграция в протеазно-негативный штамм, а также копии мутантного гена на плазмиде и интегрирование в хромосому более чем одной копии мутантного гена, тандемно расположенного или в различных положениях в хромосоме. Следующие примеры предлагаются с целью иллюстрации, но не сужения объема изобретения.

Экспериментальный раздел.

П р и м е р 1.

Создание инактивированной плазмиды рЕМ58 .

Плазмиду рМ58 ЕР-А-О 284 126) переваривают рестрикционными ферментами Ball и Hpal. Большой фрагмент, содержащий часть боковой последовательности протеазного гена, очищают (Maniatis, Molecular Cloning; A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) и лигируют. Лигационную смесь трансформируют (Spizizen и др. J.Bacteriol. 81, 1961, 741-746) в Bacillus subtilis DB104 (Kawamura и Dоi. J.Bacteriol, 160, 1984, 442-444) и подвергают селекции на резистентные к неомицину и протеазо-негативные трансформанты на минимальных чашках, содержащих 0,4% казеина и 20 мкг/мл неомицина.

Плазмиду рМ58 изолируют и характеризуют рестрикционным феpментным анализом. Как показано в таблице, плазмида рМ58 содержит боковые последовательности гена высокощелочной протеазы, ген, кодирующий резистентность к неомицину, и Bacillus-источник репликации.

Чтобы сконструировать интеграционную плазмиду, содержащую температурно-чувствительный источник репликации, рМ58 переваривают рестрикционными ферментами Xbal и Bgl II. Фрагмент, содержащий боковые последовательности высокощелочной протеазы, очищают и лигируют к (очищенному) Xbal/Bgl II фрагменту рЕ194 neo-1 (ЕР-А-О 284 126), содержащему температурно-чувствительный источник репликации, извлеченный из рЕ194 (Jordanescu и др. Plasmid I, 1978, 468-479) после того, как указанный фрагмент был очищен и предварительно описан. Лигационную смесь трансформируют в B.Subtilis DB104 и подвергают селекции на резистентность к неомицину (описано выше). Плазмиду рЕМ58 изолируют и характеризуют (фиг.2). Эта плазмида содержит ген резистентности к неомицину, температурно-чувствительный источник репликации из рЕ194 и боковые последовательности гена щелочной протеазы.

Эту плазмиду рЕМ58 используют для трансформирования штамма РВТ110 Bacillus.

П р и м е р 2.

Создание протеазо-негативного алкалофильного штамма Bacillus.

А. Протопластовая трансформация Bacillus РВТ110 плазмидной рЕМ58 .

Штамм РВТ110 Bacillus является мутантом нового вида РВ92 Bacillus (патент США доп. 30.602) и получен классическими (UV) процедурами мутации. Этот штамм трансформируют плазмидой рЕМ58 подобно методу, описанному в ЕР-А-О 284 126. Перед экспериментами по интеграции проверяют рестрикционным ферментным анализом, содержат ли трансформанты соответствующую плазмиду.

В. Интеграция рЕМ58 в хромосому Bacillus РВТ110.

Интеграцию рЕМ58 в хромосому штамма Bacillus РВТ110 осуществляют, как описано в ЕР-А-О 284 126. Селекция интегрантов происходит при концентрации неомицина 1 мкг/мл. Генетическую организацию интегранта определяют рестрикционным ферментным анализом с последующим Southern-блоттингом и гибридизационным анализом (она показана на фиг. 3). Оказывается, что интеграция рЕМ58 происходит посредством механизма типа Самрве II гомологической рекомбинацией в 5' боковой области гена щелочной протеазы, с получением штамма РВТ110-1NТ5 Bacillus.

С. Селекция протеазо-негативных штаммов.

Штамм РВТ110-1NT5 Bacillus инокулируют в 100 мл триптического соевого бульона (ТСБ), содержащего 1 мкг/мл неомицина, и инкубируют в течение 24 ч при 50^оС.

Через 24 ч 0,1 мл полученной культуры инокулируют в 500 мл емкость шейкера, содержащую 100 мл РВТ минимальной среды: К₂НРО₄ 17,42 г/л; глютамата 13,36 г/л; цитрата натрия Н₂О 2 г/л; FeSO₄ 7H₂O 0,05 г/л; ZnSO₄7H₂O 1 мг/л; MnSO₄H₂O 1 мг/л; СаСl₂ 2H₂O 10 мг/л; MgSO₄ 7H₂O 0,2 г/л; СuSO₄ 5H₂O 0,5 мг/л; Н₃ВО₃ 0,5 мг/л; Na₂ MoO₄ 2H₂O 0,5 мг/л; СоСl₂ 6H₂O 0,5 мг/л; биотина 0,5 мг/л и сахарозы 20 г/л (рН=8,0, стерилизуют 20 мин при 120^оС). После стерилизации добавляют 1 мг/л триамина.

Эту культуру инкубируют в течение 4 дней при 37^оС. Через 4 дня 1 мл культуры разводят в 100 мл той же среды и инкубируют в течение 4 дней. Через 4 дня культуру помещают на чашки с РВТ минимальной средой, содержащей дополнительно 0,4% казеина и 15 г/л агара. Колонии, вокруг которых не обнаруживалось протеазного кольца, считают протеазно-негативными, и проверяют на отсутствие гена, кодирующего РВТ 110 щелочную протеазу.

D. Определение характеристик протеазо-негативных штаммов Штаммы, которые не давали обнаружимого кольца на казеиновых чешечных средах, описанных в предыдущем разделе, были прежде всего проверены на присутствие неомицин-чувствительного и аспорогенного фенотипа. Два штамма, Bacillus РВТ125 и РВТ126, которые содержат протеазо-негативный и аспорогенный фенотип, проверяли на производство протеазы в шейкерах емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды для получения протеаз, как описано в патенте США доп. 30.602. Ни один из штаммов не продуцировал обнаружимых количеств протеазы.

Генетическую организацию этих двух штаммов определяли рестрикционным ферментным анализом и хромосомным блоттингом, она показана на фиг. 4. Происходила не гомологическая, а нелегитимная рекомбинация, приведшая к получению двух штаммов с полностью изъятыми генами протеазы и резистентности к неомицину. Однако небольшой плазмидный фрагмент, как оказалось, остался в хромосоме после делеции протеазного гена. Последовательность этого фрагмента определяли следующим образом. Хромосомные Hind III фрагменты штаммов РВТ125 и РВТ126, содержащие плазмидо-хромосомные соединения, лигировали в фаговый вектор М13 мр18 (Мессинг и др. NuCl, bujids. Res. 9, 1981, 303-321) и трансфецировали в E.coli TM101 согласно процедуре, описанной Cohen и др. Рroc.Natl. Acad. Sci. USA 69, 1972, 2110-2114. После размножения фага в Е.coli TM101 изолировали SS ДНК (Heidecker и др. Gene 10, 1980, 69-73).

Последовательность инсерцированных участков определяли с использованием метода, описанного Sanger и др. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74, 1977, 6463.

П р и м е р 3.

Создание векторов для производства протеазы и мутации.

А. Субклонирование гена протеазы РВ92 в фаге М13 мр18.

Плазмиду рМ58 переваривают Нраl и Ball. После очистки фрагмента ДНК, содержащего ген протеазы (Маниатис, 1982), этот фрагмент лигируют в фаг М13 и мр18, который переваривают Smal. Проводят трансфекцию лигационной смеси в Е. coli TM101 (Cohen и др.). После размножения фага в Е.coli ТM101 изолируют ds ДНК по методу, описанному Biruboim и Doly (Nucl. Acids.Res. 7, 1979, 1513-1523). Инсерт и его ориентацию проверяют рестрикционным ферментным анализом. Вектор, используемый для дальнейших опытов по субклонированию, показан в фиг.6 (вектор мр18-МХL).

В. Субклонирование гена протеазы РВ92 в плазмиде рВНА1.

Фиг.8-14 показывают неуклеотидную последовательность плазмиды рВНА1. Эта плазмида извлечена из системы двойного вектора рМа/с5-8, описанной Stanssens etol (Nucl. Acids. Res. 17, 1989, 4441-4454), в которую вставлен дополнительный промотор. Плазмида ВНАI состоит из следующих фрагментов: 11-105: бактериофаг FD, терминатор, 121-215: бактериофаг FD, терминатор, 221-307: часть плазмиды рВR322 (а именно позиции 2069-2153), 313-768: бактериофаг F1, источник репликации (а именно позиции 5482-5943), 772-2571: часть плазмиды рВR322, а именно источник репликации и ген -лактамазы, 2572-2685: транспозон Тn903, полный геном, 2719-2772: триптофановый терминатор (двойной), 2773-3729: транспозон Tn9, ген хлорамфеникол-ацетил-трансферазы (cat). Нуклеотиды в позициях 3005(А), 3038(С), 3302(А) и 3409(А) отличаются от последовательности, кодирующей саt дикого типа. Мутации введены с целью исключения сайтов Ncol, Ball, EcoP1 и Pvu 11, 3730-3804: сложный клонирующий сайт, 3807-7264: часть плазмиды pVB110 (а именно ген репликационной функции и резистентности к канамицину, фрагмент EcoR1-PvuII) (Mc Kenziе и др. Plasmid 15, 1986, 93-103 и Plasmid 17, 1987, 83-85), 7267-7331: сложный клонирующий сайт.

Эти фрагменты были скомбинированы с использованием известной технологии клонирования, например, наполнение в липких концах по Кленову, клонирование адаптера и т.д. Все данные были получены из Genbank^R National Nuсleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA.

Плазмида рМс5-8 депонирована под номером DSM 4566.

Перед мутационными процедурами двойную векторную систему рВНА/C-1 модифицировали для получения двойной векторной системы рВНАRB-MXL (рВНСRB- MXL следующим образом.

1. Вектор мр18-МХL переваривали Крn1 и Hind 11. Фрагмент ДНК, содержащий протеазный ген, очищали и лигировали в рВНАI, которую переваривали EcoR V и Kpn1. Лигационную смесь трансформировали в Е.соli TM101 (Маниатис, 1982) и помещали на LC чашки, содержащие 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта (Дифко), 8 г/л NaCl, 25 мг/л тимина, 1 г/л MgSO₄ 7H₂O, 100 мкг/л ампициллина и 20 мкг/л неомицина, с рН 7,0. Плазмидную ДНК трансформантов изолировали (БарнБойм, описано выше) и характеризовали рестрикционным ферментным анализом. Таким путем был изолирован рВНАI-МХL (фиг.15).

2. Чтобы секвенировать мутации, введенные в ген протеазы доступным набором нуклеотидов, было необходимо реверсировать ориентацию F1-источника в сравнении с протеазным геном. Это было осуществлено следующим образом: плазмиду рВНАI-MXL переваривали ВамНI и снова лигировали. Лигационную смесь трансформировали в Е. соli WK6 (Маниатис) и проводили селекцию на неомицин или ампициллин-резистентность на LC⁺ чашках, содержащих 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта Дифко, 8г/л NaCl, 25 мг/л тимина, 1 г/л MgSO₄ 7H₂O, 100 мкг/л ампициллина и 20 мкг/л неомицина с рН 7,0. Плазмидную ДНК трансформантов изолировали (Бирнбойм, описано выше) и характеризовали рестрикционным ферментным анализом. Таким путем изолировали рВНАR-MXL, который отличается от рВНА-MXL в том, что ориентация последовательности Е.соli реверсирована (фиг. 16).

3. Для введения дополнительных боковых последовательностей в плазмиду рВНАR-MXL были проведены следующие переваривания. Плазмиду рМ58 переваривали SphI и Hind III. Плазмиду рВНАR-MXL (фиг.17) переваривали SphI и Hind III. Очищали б