Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента

Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента

Реферат

 

Использование: в медицине. Сущность пептиды ф-лы 1: R - Arg - X - Y - Z - R₁, где R= водород, ацетил, формил; X= пролин; Y= L - Ala, L - Asp, L - Val; Z= L - Val, L - Ala; R₁= H, OH, NH₂, NH(CH₃), NHCH(CH₃)₂, при определенных буквенных значениях и способы их получения или твердофазным способом с использованием в качестве подложки полимера или сополимера, включающего целлюлозу, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, полистирол и полистиролдивинилбензол, или в растворе путем постадийного или блочного присоединения аминокислот или пептидных фрагментов, содержащихся в ф-ле 1, а также иммуномодулирующая композиция, содержащая в качестве активного начала по крайней мере один пептид ф-лы 1 в эффективном количестве. 5 с. и 5 з. п. ф-лы, 8 ил, 5 табл.

Изобретение относится к синтетическим пептидам, способным стимулировать активность хелперов Т-клеток. Более конкретно, пептиды, полученные предлагаемым способом, представляют собой тетрапептиды, основанные на молекуле тиспленина.

Природные иммуномодулирующие протеины, тимопоиэтин и тиспленин (ранее называвшийся "спленин") были выделены из вилочковой железы и селезенки (соответственно бычьей и человечьей).

К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных подобным протеинам и синтезированным пептидам. В патенте США N 4190646 описан пентапептид тимопентин, который представляет собой зону активности (сайт) тимопоиэтина и содержит последовательность аминокислот аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-валин-тирозин, а также пептидные композиции, в которых различные группы замещены на амино и/или карбоксильные окончания указанного пентапептида. Как тимопоиэтин, так и тимопентин вызывают биологические изменения в двух линиях Т-клеток человека, GEM и MOL Т-4, что указывает на их роль в стимулировании биологической активности Т-клеток. Было обнаружено, что ни один из аналогов тимопентина, более коротких чем пентапептиды (т.е. пептиды, содержание 5 аминокислот в последовательности), не обладает активностью по отношению к GEM-клеткам.

В патенте США N 4428938 описаны некоторые пептиды, влияющие на иммунорегулирование. В число указанных пептидов входят перечисленные ниже тетрапептиды: аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-валин, аргинин-лизин-аспарагин-валин, аргинин-лизин-аланин-валин, аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-аланин, аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-изолейцин, аргинин-лизин-глютаминовая кислота-валин, пироглютамил-аргинин-лизин-аспара- гиновая кислота.

Указанный патент включает также соли, амиды, сложные эфиры низших алкилов и защищенные производные указанных последовательностей, а также способы использования указанных последовательностей для лечения иммунологических нарушений, вызванных недостаточностями, связанными с функционированием тимуса (вилочковой железы). Согласно указанному патенту данные пептиды испытывались на наличие активности в проводимом in vitro Е-розеточном тесте.

Те же авторы сообщили о синтезе подобных тетрапептидов в работе Кисфалуди с сотр. Noppe-Seyler's L. Physid. Сhem. B. D. 364, с. 933-940 (1983). В этой работе сообщается, что последовательность аргинин-аланин-аспарагиновая кислота-валин является очень активным аналогом в проводимом in vitro Е-розеточном тесте и что последовательности аргинин-аланин-аспарагиновая кислота-валин и аргинин-лизин-аланин-валин значительно уменьшают активность.

Согласно имеющемуся уровню техники имеется необходимость в дополнительных пептидах, которые обладают способностью стимулировать деятельность иммунной системы у человека в условиях различных случаев недостаточности Т-клеток.

В настоящем изобретении описан ряд аналогов пептида тиспленина, обладающих биологической активностью по отношению к MOL Т-4 линии клеток. В отличие от описанного выше тимопентина и его аналогов данные аналоги пептидов содержат менее 5 аминокислот, обладая при этом действием, аналогичным тиспленину, т. е. проявляя активность по отношению к хелперам Т-клеток MOL Т-4, также как это имеет место в случае пентапептидных аналогов тиспленина.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к новым тетрапептидам, отвечающим следующей общей формуле R-аргинин-Х-Y-Z-R₁, где R водород, ацетил, формил; Х пролин; Y L-аминокислота, принадлежащая к ряду, состоящему из аланина, аспарагиновой кислоты; Z L-аминокислота, принадлежащая к ряду, состоящему из валина или аланина, R₁ водород, гидроксил или группа NH₂, NH(CН₃), NHCH(CН₃)₂.

Указанные пептиды и содержащие их композиции неожиданно проявляют биологическую активность, свойственную человеческому тиспленину. Большое число указанных пептидов также отличается улучшенной способностью противостоять воздействию эндо- и экзопептидаз и трипсиноподобных ферментов в пищеварительном тракте и сыворотке. Таким образом, указанные пептиды обладают значительными преимуществами при лечении иммунной недостаточности. В частности, тетрапептиды согласно настоящему изобретению, для которых Х представляют собой пролин или -метилаланин, обладают неожиданной способностью противостоять разложению ферментами, например пептидазами сыворотки.

Еще один аспект настоящего изобретения включает способы получения пептидов и терапевтические композиции, содержащие указанные пептиды, а также способы использования указанных пептидов для лечения различных заболеваний, связанных с необходимостью иммунорегулирования.

Прочие аспекты и преимущества настоящего изобретения приведены далее.

На фиг.1 приведена иллюстрация циклического образования GMP в MOL Т-4 в виде графика в координатных осях: концентрация пептида (мкг/мл)-уровень циклического GMP (пг/мл); приводится также сравнение активности тимопентина (ТР-5) и пептидов согласно изобретению по отношению к контрольным образцам; на фиг.2 приведена графическая иллюстрация для циклического GMP в координатах: концентрация пептида (мкл/мл) уровень циклического GMP (пг/мл); приводится также сравнение активности тимопентина (ТР-5) и пептида ацетил-аргинин-пролин-валин-аланин-NH₂ cогласно настоящему изобретению.

Пептиды согласно настоящему изобретению в общем случае могут быть получены согласно известным способам. Удобно проводить синтез полипептидов согласно изобретению в соответствии со способом синтеза в твердой фазе, описанным Меррифилдом в J.А.С.S. 85, 2149-2154 (1963). Этот способ получил широкое распространение и является общим способом получения пептидов.

Синтез в твердой фазе осуществляют путем эстерификации Z-аминокислоты, защищенной по своей аминогруппе, с нерастворимым полимером смолы с образованием ковалентных связей; у части Z-аминокислоты удаляют аминозащитную группу, проводят реакцию с Y-аминокислотой, защищенной по своим аминогруппам, с присоединением Y-аминокислоты к Z-смоле, удаляют -аминозащитную группу из части Y-аминокислоты, производят реакцию с Х-аминокислотой, защищенной по своей аминогруппе, с присоединением Х-аминокислоты к Y-Z-смоле, удаляют аминозащитную группу из части Х-аминокислоты, производят реакцию с W-аминокислотой (аргинином), защищенной по своей аминогруппе, с присоединением W-аминокислоты к Х-Y-Z-смоле, удаляют аминозащитную группу у части W-аминокислоты; производят реакцию с N-R-замещенной V-аминокислотой, защищенной по своим аминогруппам, с присоединением N-R-замещенной V-аминокислоты к W-Х-Y-Z-смоле, расщепляют смолу и пептид при помощи кислоты (R₁=OН), аммония (R₁-NH₃) или соответствующего амина и удаляют все защитные группы.

Аминокислоты могут быть присоединены к любому подходящему полимеру в виде смолы. Смола должна содержать функциональную группу, через которую первая защищенная аминокислота может быть прочно присоединена посредством ковалентной связи. Для этой цели подходят различные полимеры, например целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат и полистирол. В число подходящих защитных групп, которые могут использоваться в такого рода синтезах, входят трет-бутоксикарбонильная (ВОС), бензильная (BZL), трет-амилоксикарбонильная (АOC), тозильная (ТОЗ), о-бромфенилметоксикарбонильная (BrBz), 2,6-дихлорбензильная (BzLCl₂) и фенилметоксикарбонильная (или СВ). Дополнительные примеры защитных групп приведены в указанном выше источнике, а также в книге Дж. Ф. В.Мак-Оми Защитные группы в органическом синтезе. Нью-Йорк, Пленум Пресс, 1973.

Общий способ получения пептидов согласно настоящему изобретению включает первоначальное присоединение защищенной С-терминальной аминокислоты к смоле. После указанного присоединения смолу фильтруют, промывают и удаляют защитную группу с альфа-аминогруппы С-терминальной аминокислоты. Удаление указанной защитной группы должно естественно протекать без разрыва связи между указанной аминокислотой и смолой. К полученному на смоле пептиду присоединяют предпоследнюю С-терминальную защищенную аминокислоту. Присоединение происходит в результате образования связи между свободной карбоксильной группой второй аминокислоты и аминогруппой первой аминокислоты, присоединенной к смоле. Подобная последовательность операций повторяется с последовательно присоединяемыми аминокислотами до тех пор, пока все аминокислоты не будут присоединены к смоле. Наконец защищенный пептид отщепляют от смолы и удаляют защитные группы, получая в результате целевой пептид. Методика отщепления, используемая для отделения пептида от смолы и для удаления защитных групп, известна специалистам в области синтеза пептидов приемом.

Кроме того, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть также синтезированы с использованием стандартного способа синтеза пептидов в растворе, который включает либо постадийно, либо блочное присоединение аминокислот или фрагментов пептида с использованием химических или ферментативных способов образования амидной связи.

Было обнаружено, что пептиды согласно настоящему изобретению обладают биологической активностью, аналогичной человеческому тиспленину. Эта биологическая активность проявляется прежде всего при измерении степени индуцирования образования циклического GMP в MOL Т-4-линии человеческих Т-клеток в сравнении с человеческим тиспленином и человеческим тимопентином. Индуцирование образования циклического GMP пептидом согласно настоящему изобретению в этих опытах указывает на наличие у пептида способности связываться с рецепторной зоной (сайтом) человеческого тиспленина в клетке и вызывать появление биологической активности, аналогичной активности человеческого тиспленина.

Многие из тетрапептидов согласно изобретению обладают также дополнительными и значительными преимуществами по сравнению с человеческим тиспленином. Многие пептиды согласно настоящему изобретению отличаются резистентностью к ферментативному разложению ферментами, содержащимися в пищеварительном тракте или в сыворотке. В результате они обладают продолжительным полупериодом жизни in vivo при введении посредством инъекции биологическому объекту. Другим преимуществом многих из этих пептидов является возможность их перорального введения. Сам по себе человеческий тиспленин имеет слишком большую молекулу и должен перевариваться в пищеварительно-кишечном тракте.

До проведения испытаний пептидов согласно настоящему изобретению невозможно было предугадать, что могут быть получены аналоги человеческого тиспленина, обладающие такой же биологической специфичностью, поскольку последовательность аргинин-лизин-аланин-валинтирозин, которая является человеческим аналогом бычьего пентапептида SP=S (аргинин-лизин-глютаминовая кислота-валин-тирозин), является неактивной по отношению к клеткам MOL Т-4.

Таким образом, открытие тетрапептида, являющегося аналогом человеческого тиспленина и проявляющего активность, аналогичную биологической активности целой молекулы человеческого тиспленина, является неожиданным.

Вследствие иммуномодуляторных характеристик пептидов согласно настоящему изобретению они являются полезными с терапевтической точки зрения средствами для лечения человека и, возможно, животных, поскольку у них имеется способность индуцировать дифференциирование и созревание Т-клеток, которые способны к вовлечению в процессы иммунного отклика организма. В результате пептиды согласно настоящему изобретению можно рассматривать в качестве средств, предназначенных для многих вариантов терапевтического использования.

Пептиды согласно настоящему изобретению можно рассматривать в качестве средств, способствующих созданию иммунитета тела пациента, поскольку они увеличивают или способствуют терапевтическому стимулированию клеточного иммунитета. Следовательно, они могут быть полезными при лечении заболеваний, которым свойственна хроническая инфекция, например инфекционных грибковых заболеваний или инфекций, связанных с микоплазмой, туберкулеза, проказы, острых и хронических вирусных инфекций и подобных им заболеваний.

Пептиды согласно настоящему изобретению или композиции, содержащие указанные пептиды или их соли кислот или оснований, могут использоваться во всех областях, в которых требуется достижение клеточного иммунитета, в особенности в тех случаях, когда имеет место иммунодефицит. Так, в тех случаях, когда существует избыточное продуцирование антител вследствие отсутствия баланса по Т-клеткам, пептиды согласно изобретению могут скорректировать это состояние посредством стимулирования функций Т-клеток. Таким образом, следует ожидать, что они могут найти использование в терапии при некоторых автоиммунных заболеваниях, при которых образуются нежелательные антитела, например в случае красной волчанки (эритемы), ревматических артритов и им подобных заболеваний.

В таком широком варианте применения пептиды согласно настоящему изобретению или содержащие их фармацевтические средства могут использоваться для регулирования иммунной системы пациента, человека или животного, который нуждается в подобном регулировании. Термин "регулирование", как он используется в описании настоящего изобретения, означает, что соединения согласно изобретению заставляют иммунную систему возвратиться из ненормального, болезненного состояния в нормальное, сбалансированное состояние. Хотя регулирование подобного типа может найти широкое применение для коррекции иммунологических дефицитов (например синдрома Ди-Джорджа), возможны также и другие варианты применения для корректировки условий, соответствующих избытку иммунологической активности (например, в случае автоиммунных заболеваний).

Следовательно, настоящее изобретение включает способы регуляции иммунной системы человека или животного при необходимости в данной регуляции, включающие введение указанному человеку или животному по меньшей мере одного из указанных пептидов в количестве, эффективном с точки зрения регуляции иммунной системы, а также фармацевтические композиции для осуществления указанных способов. Предпочтительно эффективное количество составляет от 1 мкг до 100 мг/кг массы тела.

Изобретение предусматривает также способ лечения состояний, имеющих место при относительном или полном иммунном дефиците иммунной системы пациента, в особенности с точки зрения функционирования хелперов Т-клеток; указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного с терапевтической точки зрения количества по меньшей мере одного из пептидов согласно настоящему изобретению.

В том смысле, в котором он употребляется в настоящем описании, термин "эффективное с терапевтической точки зрения количество" означает такое количество препарата, которое эффективно в отношении лечения указанных выше состояний. Настоящее изобретение предусматривает также способ индуцирования дифференциации и созревания Т-клеток, включающий введение пациенту эффективного с точки зрения указанного индуцирования количества по меньшей мере одного из пептидов согласно настоящему изобретению.

Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции, предназначенные для реализации этого способа. Для получения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению пептид согласно настоящему изобретению объединяют в качестве активного компонента с пригодным для фармацевтического применения носителем посредством тщательного смешивания в соответствии с обычными способами получения фармацевтических композиций. Носитель может находиться в самых различных формах, в зависимости от того способа, которым предусматривается введение препарата, например перорально, ректально, парэнтерально через нос или под язык.

При получении композиций в предпочтительной форме для перорального введения можно использовать любые обычные фармацевтические среды. В случае жидких композиций для перорального введения (например, суспензий, эликсиров и растворов) можно использовать среды, содержащие например воду, масла, спирты, отдушки, консерванты, красители и им подобные агенты. Такие носители как крахмал, сахар, разбавители, гранулирующие агенты, смазочные агенты, связующие агенты, дезинтегрирующие агенты и им подобные компоненты могут использоваться для получения твердых композиций для перорального применения (например, порошков, капсул и таблеток). Можно использовать также рецептуры для управляемого введения (рецептуры прологнированного действия). Вследствие легкости их введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные формы дозировок для перорального способа введения; очевидно, что в этом случае используют твердые фармацевтические носители. При желании таблетки могут быть покрыты сахаром или другим растворяющимся в кишечнике покрытием в соответствии с известными способами.

В случае продуктов для парэнтерального способа введения носитель обычно представляет собой стерильную воду, хотя такие композиции могут включать также и другие компоненты, например, способствующие растворению или обладающие свойствами консервантов. Могут быть получены также суспензии для инъекций; в этом случае можно использовать соответствующие жидкие носители, суспендирующие агенты и им подобные средства.

Как уже упоминалось, тетрапептиды согласно настоящему изобретению обычно активны при введении их в количествах, превышающих 1 мкг/кг массы тела, предпочтительно примерно от 0,001 до примерно 10 мг/кг массы тела. В общем случае дозировки в таких же пределах могут использоваться для лечения заболеваний, при которых наблюдается иммунная недостаточность. Большие количества (например, в пределах от примерно 10 до 100 мг/кг массы тела пациента) могут использоваться для подавления избыточной иммунной активности.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение, не ограничивая при этом пределов его применения. В примерах и в описании под частями понимаются массовые части, если не указано обратного. В примерах использованы следующие сокращения: ТFA (ТФУК) трифторуксусная кислота, НОАс(УК) уксусная кислота, СН₂Сl₂ хлористый метилен, СН₃СN ацетонитрил, (ДМФ) диметилформамид, Н₄OAc ацетат аммония, NH₄OН гидрат окиси аммония, н-PrOН н-пропанол, н-BuOН н-бутанол, pyr-пиридин, DCC (ДЦК) дициклогексилкарбодиимид, НOBt (ОБТ) 1-оксибензотриазол, DMAP (ДМАП) диметиламинопиридин, НF фтористый водород, ТСА (ТХУК)-трихлоруксусная кислота, ВНА (БГА) бензгидриламин и MeOН метанол.

П р и м е р 1. Синтез тетрапептида: ацетил-аргинин-пролин-аланин-валин-NH₂.

Указанный выше тетрапептид синтезируют с использованием способа твердофазного синтеза при постадийном связывании. Все аминокислоты защищены по -аминогруппе посредством трет-бутилоксикарбонильной группы. Тозил (ТОЗ) используются для защиты боковой цепи аргинина. Защищенные аминокислоты используются в избытке, соответствующем 2,5 эквивалента на I эквивалент замещения смолы. Все операции связывания осуществляют с использованием дициклогексилкарбодиимида и 1-оксибензотриазола в равном эквивалентном количестве по отношению к защищенной аминокислоте. Все аминокислоты растворяют в хлористом метилене, за исключением аргинина, который растворяют в диметилформамиде.

Промывку, снятие защиты и связывание проводят постадийно, в соответствии со следующей схемой, мин: 1. Хлористый метилен 2 3 2. 50% Трифторуксусной кислоты хлористый метилен 1 3 3. 50% Трифторуксусной кис- лоты хлористый метилен 1 30 4. Хлористый метилен 1 3 5. 40% Изопропанола хло- ристый метилен 2 3 6. Хлористый метилен 2 3 7. 10% диизопропилэтила- мина 2 10 8. Хлористый метилен 1 3 9. Аминокислота 1 3 10. 1-Оксибензотриазол 1 3 11. Дициклогексилкарбодии- мид 1 120 12. Хлористый метилен 2 3 13. 40% изопропанола хло- ристый метилен 2 3 14. Диметилформамид 1 3 15. Хлористый метилен 2 3 а) Синтез.

Защищенный пептид синтезируют с использованием синтезатора пептидов фирмы "Бекман", модель 990. Получаемая в результате смола с тетрапептидом соответствует 0,67 мег/г; синтез начинают с 5,0 г (3,35 ммоль) смолы. Получаемый при этом тетрапептид ацетилируют в результате обработки смолы в соответствии с приведенной ниже процедурой, мин: 1. Хлористый метилен 2 3 2. 50% трифторуксусной кислоты хлористый метилен 1 3 3. 50% трифторуксусной кис- лоты хлористый метилен 1 30 4. Хлористый метилен 1 3 5. 40% изопропанола хло- ристый метилен 2 3 6. Хлористый метилен 2 3 7. 10% диизопропилэтилами- на 2 10 8. Хлористый метилен 1 3 9. 50% уксусного ангидрида хлористый метилен, с катали- тическим количеством димети- ламинопиридина 1 120 10. Хлористый метилен 2 3 11. 40% изопропанола хло- ристый метилен 2 3 12. Диметилформамид 1 3 13. Хлористый метилен 2 3 Содержащую пептид смолу сушат при пониженном давлении после промывки 2 порциями этанола по 50 мл.

б) Расщепление НF.

Неочищенный тетрапептид получают в результате расщепления связи смола пептид посредством НF (25 мл) и анизола (25 мл) в течение 4 ч при 0^оС. НF удаляют при пониженном давлении. К смеси добавляют 150 мл диэтилового эфира, раствор перемешивают и переводят в стеклянный фильтр, после чего промывают дополнительно 3 порциями по 100 мл диэтилового эфира. Пептид экстрагируют из смолы посредством 10% уксусной кислоты (3 100 мл), а водный раствор лиофилизируют, получая 1,20 г продукта.

в) Очистка.

Продукт очищают методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ПВЖХ) при следующих условиях: Колонка "Ватман", Партисил М-20 10/50 ODS-3, образцы по 300 мг, используется изократная система 15% ацетонитрила/0,01 М ацетата аммония (значение рН доводится до 5 посредством уксусной кислоты), скорость потока 15 мл/мин, длина волны, используемая для детектирования, 2120 нм. Все фракции, содержащие чистый продукт, собирают. Органический растворитель отгоняют и лиофилизируют водный раствор, получая в результате 258 мг белого твердого продукта.

Аминокислотный анализ: пролин 1,00, аланин 1,00, валин 1,00, аргинин 1,00, 83% пептида. Тонкослойная хроматография (двуокись кремния 60/Аналтек): Rf (I) 0,50 (бутанол: уксусная кислота: вода 3 1 1) Rf (II) 0,59 (бутанол: пиридин: уксусная кислота вода 4:1:1:2) Rf (III) 0,29 (бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1).

П р и м е р 2. Синтез тетрапептида: ацетил-аргинин-пролин-валин-аланин- Н Тетрапептид получают с использованием пептидного синтезатора "Эпплайд Биосистемз-430А". Используют для этой цели стандартную циклическую процедуру I (вариант изготовления 1.40), посредством которой происходит связывание по одной аминокислоте единовременно, за исключением фрагмента трет-бутилоксикарбонил-тозил-аргинин, который связывается дважды. Для синтеза используют исходные продукты, приведенные в табл.1.

После того как трет-бутоксикарбонильные защитные группы аргинина удалены, а смола с пептидом подвергалась нейтрализации и промывке, соединение ацетилируют с использованием 10%-ного уксусного ангидрида в хлористом метилене (15 мл) в присутствии 4-диметиламинопиридина (20 мг). По истечении 60 мин пептид подвергают проверке на нингидринный тест, чтобы удостовериться в полноте ацетилирования. Смолу с пептидом промывают хлористым метиленом (3 порции по 15 мл) и сушат в вакууме (при комнатной температуре), получая 1,0 г продукта.

б) Расщепление НF: Пептид отщепляют от смолы с использованием 10 мл НF в присутствии 1,5 мл анизола. Смесь перемешивают при 0^оС в течение 1,5 ч, после чего НF удаляют при пониженном давлении. Смесь промывают диэтиловым эфиром (3 порции по 50 мл) и сушат на воздухе. Смесь смолы и пептида экстрагируют 25%-ным водным раствором уксусной кислоты (3 порции по 50 мл).

в) Очистка.

Водный фильтрат лиофилизируют, получая 240 мг неочищенного продукта. Этот продукт пропускают через ионообменную смолу "Амберлит IRA-68 (ацетатная форма) в воде. Фракции, содержащие пептид, объединяют и лиофилизируют, получая 200 мг продукта.

Пептид подвергают очистке на колонке фирмы "Ватман", Партисил 20-М 10 ODS-3 (22 мм х 50 см) с использованием в качестве растворителей для элюирования 15% ацетонитрила (0,1% трифторуксусной кислоты) и 0,1%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты (скорость 10,0 мл/мин). За процессом элюирования наблюдают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответствующие фракции собирают, объединяют и отгоняют из их растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде и лиофилизируют, повторяя процесс дважды, получая в результате 167 мг продукта с общим выходом 50% Аминокислотный анализ: аргинин 1,04, пролин 1,02, валин 1,00, аналин 1,01, 72% пептида.

Тонкослойная хроматография (пластинки с силикагелем CF-250 мкм): Rf (I) 0,37 (н-бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1) Rf (II) 0,15 (хлороформ: метанол: уксусная кислота 60:35:5) Rf (III) 0,48 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1).

П р и м е р 3. Синтез тетрапептида ацетил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NH₂.

а) Синтез.

Указанное соединение синтезируют с использованием стандартного способа синтеза в твердой фазе, применяя автоматический синтезатор фирмы "Бекман", модель 990. Синтез начинают с 5,0 г бензгидриламинной смолы (0,67 мэг/г). После завершения связывания трет-бутоксикарбонил-аргинин (тозила) трет-бутоксикарбонильную защитную группу удаляют посредством 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлористом метилене и ацетилируют смолу с пептидом посредством 50% -ного уксусного ангидрида в хлористом метилене в присутствии каталитического количества диметиламинопиридина. Смолу с пептидом промывают этанолом (2 50 мл) и сушат при пониженном давлении в течение ночи перед осуществлением расщепления посредством НF. Сухая смесь смолы и пептида весит 6,5 г.

б) Расщепление НF.

Неочищенный тетрапептид получают посредством расщепления 6,5 г смеси смолы с пептидом с использованием 25 мл НF и 25 мл анизола при 0^оС в течение 4 ч, HF отгоняют при пониженном давлении и добавляют диэтиловый эфир (150 мл) к по- лученной реакционной смеси. Неочищенный пептид в смеси со смолой переводят в стеклянный фильтр и промывают 3 порциями диэтилового эфира по 100 мл. Пептид экстрагируют 10% уксусной кислоты (2 100 мл) и полученный водный раствор лиофилизируют, получая 900 мг белого твердого вещества.

в) Очистка.

Неочищенный продукт (степень чистоты 98% по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии) обессаливают на колонке Сефадекс LН-20 (100 г носителя, 2,5 89 см), используя 10% уксусной кислоты в качестве элюента. После лиофилизации продукт представляет собой снегоподобный белый твердый продукт весом 800 мг.

Аминокислотный анализ: аргинин f 0,99, валин f 1,00, пролин 1,05, аспарагиновая кислота 1,01.

Тонкослойная хроматография (двуокись кремния-60/"Мерк", 250 г): RF (I) 0,51 (н-бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1) RF (II) 0,60 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1) Rf (III) 0,59 (н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода 4:1:1:2).

П р и м е р 4. Синтез N- -формил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валина а) Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил- -бензил-аспаратил-валина.

3,23 г N-трет-бутилоксикарбонил- -бензил-аспарагина и 3,97 г валин-бензилового эфира растворяют в 80 мл хлористого метилена. К раствору добавляют 1,74 мл диизопропилэтиламина и выдерживают раствор при 5^оС. Затем к смеси добавляют 2,06 г дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при 5^оС в течение 30 мин и затем еще 2 ч при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и экстрагируют фильтрат водой, 10%-ным раствором лимонной кислоты и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. После удаления растворителя получают масло, которое очищают методом хроматографирования на силикагеле-60 с применением смеси 97:3 хлористый метилен:хлороформ. Продукт в виде масла весит 3,46 г.

б) Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-пролил--бензил-аспаратил-валина.

После снятия защиты с 3,41 г указанного выше продукта посредством 60 мл смеси хлористый метилен-трифторуксусная кислота в течение 30 мин получают соль (трифторацетат) в виде масла. Свободный амин получают нейтрализацией насыщенным водным раствором карбоната натрия с экстракцией хлористым метиленом. Объем экстракта уменьшают посредством упаривания; затем к нему добавляют 1,05 г N-трет-бутилоксикарбонил-пролина. К смеси затем последовательно добавляют раствор 0,73 г 1-оксибензотриазола в 2 мл диметилформамида и 0,99 г дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают в течение 2,5 ч, после чего фильтруют. Фильтрат экстрагируют водой, 10%-ным раствором лимонной кислоты и дважды насыщенным раствором бикарбоната натрия. После сушки растворитель удаляют, получая масло. Продукт подвергают очистке хроматографированием на силикагеле-60 с использованием смеси 9:1 хлористый метилен:ацетонитрил. Фракции, содержащие основной компонент, дают 2,31 г бесцветного масла. ИК-спектр 1740, 1695 и 1675 см^-1.

в) Бензиловый эфир N- -формил-N2-нитроаргинилпролил- -бензил-аспаратил-валина.

К 2,23 г полученного ранее продукта добавляют 60 мл смеси трифторуксусной кислоты и хлористого метилена 1:2. Раствор перемешивают в течение 30 мин, после чего растворитель удаляют при пониженном давлении, получая в остатке воскообразный твердый продукт, который промывают петролейным эфиром. В 15 мл диметилформамида растворяют 0,72 г N- -формил-N²-нитроаргинина и 0,33 мл N-метилморфолина. Раствор охлаждают до -20^оС и добавляют к нему по каплям 0,40 г изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивают при температуре от -20 до -10^оС в течение 20 мин, после чего добавляют охлажденный раствор бензилового эфира пролил- -бензил-аспартил-валина (трифторацетат) в 20 мл диметилформамида и 0,33 мл N-метилморфолина. Смесь перемешивают при -15^оС в течение 20 мин, после чего баню для охлаждения убирают и продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 2 ч. Большую часть растворителя удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 50 мл хлористого метилена и экстрагируют водой, 10%-ным раствором лимонной кислоты и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушат и отгоняют растворитель, по- лучая в результате 2,08 г продукта.

Тонкослойная хроматография (силикагель GF): Rf (I) 0,56 (хлористый метилен: метанол= 9:1).

Rf (II) 0,72 (хлороформ: метанол: уксусная кислота 8:1:1).

г) N- -формил-аргинил-пролил-аспартил-валин.

Защиту снимают посредством гидрогенизации с передачей с использованием 30 мл 5% -ной муравьиной кислоты-формиата аммония на палладии. Реакционную смесь перемешивают в колбе, помещенной в баллон, в течение 18 ч. После фильтрования смеси через Целит растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде и лиофилизируют. Продукт подвергают очистке на колонке с ДЭАЭ-Сефадекс, 1,6 60 см. Элюирование начинают с использованием 0,02 М раствора бикарбоната аммония (рН 8,5), собирая фракции по 150 капель. После отбора 52 фракций начинают использовать градиентный раствор от 0,02 до 0,2 М бикарбоната аммония (более 2 л). Самый большой пик на хроматограмме элюированного продукта соответствует фракции 88. Фракции 75-100 объединяют и лиофилизируют, получая аморфное твердое вещество. Данные высокоэффективной жидкостной хроматографии: время удерживания 9,4 мин при 10% метанола 0,01 н. раствор ацетата аммония, рН 5 при скорости 1,5 мл/мин на колонке Бондпак-C₁₈.

Тонкослойная хроматография (силикагель-60): Rf (I) 0,16 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: 3:1:1).

Rf (II) 0,27 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: пиридин: 15:3:12:10).

Rf (III) 0,42 (этилацетат: пиридин: уксусная кислота: вода 5:5:1:3).

Аминокислотный анализ: аспарагин 0,99, пролин 0,97, валин 1,05, аргинин 1,00, 38% пептида.

П р и м е р 5. Синтез аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-изопропиламида.

В 40 мл хлористого метилена растворяют 2,25 г трет-бутоксикарбонил-пролин-(бензил) аспарагиновая кислота-валина. Раствор охлаждают в ледяной бане и добавляют 0,67 г 1-оксибензотриазола и 0,90 г дициклогексилкарбодиимида в 4 мл диметилформамида. После перемешивания в течение 10 мин добавляют раствор 0,30 г изопропиламина в 5 мл хлористого метилена. Смесь перемешивают на ледяной бане в течение 15 мин, а затем оставляют для нагрева до комнатной температуры. Через 3 ч осадок отфильтровывают. Фильтрат экстрагируют 10%-ным раствором лимонной кислоты, водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой высушивают на сульфате магния и удаляют растворитель при пониженном давлении. В результате получают грязно-белое твердое вещество весом 2,32 г. При кристаллизации из этилацетата -i- Pr₂O получают 1,64 г вещества, имеющего температуру плавления 179,5-181,5^оС.

К 0,84 г указанного выше вещества добавляют 50 мл 40%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. Раствор перемешивают в течение 30 мин, затем растворитель удаляют при пониженном давлении. К оставшемуся веществу добавляют диэтиловый эфир и получают твердое вещество трифторацетат пролин-(бензил) аспарагиновая кислота-валин-изопропиламида.

В 10 мл диметилформамида растворяют 0,93 г трет-бутилоксикарбонил-аргинина. Этот раствор охлаждают до -20^оС и добавляют 0,18 мл N-метилморфолина, а затем 0,22 г изобутилхлорформиата. Смесь перемешивают при -15^оС в течение 20 мин, затем добавляют 0,18 мл N-метилморфолина и охлажденный раствор вышеуказанной соли трифторацетата в 10 мл диметилформамида. Через 30 мин удаляют охлаждающую баню и продолжают перемешивание в течение 2 ч. Большую часть растворителя удаляют при пониженном давлении. К оставшемуся веществу добавляют этилацетат и воду. Слои разделяют и экстрагируют органический слой раствором лимонной кислоты и дважды насыщенным раствором бикарбоната натрия. После удаления растворителя остается бесцветное стекловидное вещество весом 1,44 г. Очистку вещества производят с использованием смеси 98:2 хлористый метилен: метанол. При элюировании первым выделяют указанное в заголовке вещество; выход чистой фракции составляет 0,53 г, а также получают 0,32 г вещества с небольшим содержанием примесей.

0,53 г очищенного защищенного