Способ получения специфической сальмонеллезной поливалентной н-сыворотки для ускоренного выявления сальмонелл в пищевых продуктах, кормах, объектах окружающей среды и клиническом материале

Способ получения специфической сальмонеллезной поливалентной н-сыворотки для ускоренного выявления сальмонелл в пищевых продуктах, кормах, объектах окружающей среды и клиническом материале

Реферат

 

Использование: микробиология, диагностика, сальмонелла, диагностическая сыворотка. Сущность изобретения: отбирают штаммы сальмонелл, охватывающие широкий спектр H - антигенов и с минимальным содержанием О - антигенов. Из 18 отобранных штаммов готовят антиген, представляющий собой изолированные жгутики. Полученным антигеном гипериммунизируют кроликов двумя циклами и получают родоспецифическую поливалентную H - сыворотку с титром 1:3200 - 1: 12800 при рабочем разведении 1:320. Сыворотка позволяет выявлять сальмонеллы в количестве одна клетка на 50 г исследуемого продукта, а также в смешанной культуре без дополнительного биохимического тестирования. Индикация сальмонелл осуществляется в реакции агглютинации. 6 табл.

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и касается быстрого и достоверного выявления сальмонелл в пищевых продуктах, кормах, объектах окружающей среды, медицине.

Повышение уровня требований к качеству продуктов пищевой, кормовой промышленности, экологическому состоянию окружающей среды, а также задачи здравоохранения требуют создания быстрых и надежных методов обнаружения санитарно-показательных и патогенных бактерий, в частности, сальмонелл.

Известны способы определения присутствия сальмонелл в пищевых продуктах и кормах ("Изделия колбасные и продукты из мяса" ГОСТ 9958-81; "Мука кормовая животного происхождения" ГОСТ 25311-82; Общее руководство по методам обнаружения сальмонелл Международной организации по стандартизации ISO 6579-4381 E; Food a. Drug Administration "Bacteriological Anabytical Manual" D.C.AOAC 6th Ed/1984, Chapter VII/.

Все эти методы построены по общему принципу: посев испытуемого материала в неселективную жидкую среду предобогащения и инкубации при температуре +37^oC в течение 18 22 часов; пересев в селективную жидкую среду и инкубации при +37^oC в течение 18 24 часов; пересев на плотные селективные среды и выращивание посевов при +37^oC в течение 24 48 часов; выделение бактериальных изолятов на селективной дифференциально-диагностической плотной среде и выращивание их при +37^oC в течение 18 22 часов. Идентификацию выделенных культур проводят по биохимическим тестам с серологическим исследованием с помощью недостаточно специфичных О-сывороток.

Таким образом, наименьшая длительность анализа с положительным результатом (определения присутствия сальмонелл) составляет 4 6 суток. Длительность анализа является основным недостатком указанных методов, не позволяющим дать своевременную санитарно-гигиеническую оценку исследуемому объекту.

Известны иммунофлюоресцентные методы индикации сальмонелл в пищевых продуктах и кормах, отличающиеся более коротким сроком исследования и высокой чувствительностью (Food a. Drug Administration, 1978. Bacteriological Manual for foods, 5th cd AOAC/.

Недостатком их является большая трудоемкость и существенное количество (иногда до 80%) ложно-положительных результатов (Fhomason, B.M. 1981, J. Food Prot. 44:381 384).

Это связано с тем, что применяемая поливалентная ОН-сыворотка неспецифична и может давать ложно-положительные результаты, обусловленные общими О-антигенами сальмонелл, шигелл, эшерихий, цитробактера, клебсиелл и других бактерий семейства кишечных ("Энтеробактерий", под ред. В.И.Покровского, М. 1985 г. ). К неправильным результатам исследования может также привести сам методический прием оценки результатов по длительному (свыше часа) анализу предметных стекол под микроскопом. Это является трудоемким и утомительным процессом, что может вызвать искажение оценки даже у опытного исследователя.

Для повышения специфичности иммунофлюоресцентного метода было предложено использовать вместо поливалентной ОН-сыворотки специфический сальмонеллезный IG-иммуноглобулин (Fhomason B.M. "Current status of immunofluorescent methodology for salmonellae", J. Food Prot. 1981 V44, s. 381 384).

Однако, повышение специфичности препарата не сняло уже описанных выше сложностей и трудоемкости иммунофлюоресцентного метода индикации сальмонелл.

Описано применение поливалентной Н-сыворотки для техники иммуноиммобилизации сальмонелл с целью их быстрого выявления (Swaminathan B. Denner J.M. et al. "Rapid Detection of salmonellae in foods, by membrane filter-disc immunoimmobilization Technique". J. of Food Science, 1978, v43, N 5, p. 1444 1447).

Этот метод позволяет определить присутствие сальмонелл за 24 32 часа.

Недостатком метода является ограниченное время годности дисков с поливалентной Н-антисывороткой и использование дорогостоящих компонентов в составе селективной среды культивирования. Не всегда доступны специальные бактериальные мембранные фильтры (типа Millipore Filter), используемые в анализе.

Разработаны методы прямого иммуноферментного обнаружения сальмонелл в пищевых и кормовых продуктах с использованием поликлональных антител (J.M. Anderson, P.A. Hartman. Appl. En.v. Microb. 1985, 49(5), p. 1127 1127). Метод достаточно чувствителен и позволяет одновременно исследовать 32 образца на одной микротитровальной пластинке. Недостатком метода является применение дорогостоящих реактивов и длительности исследования (3 рабочих дня).

Известен иммунодиффузионный метод обнаружения сальмонелл в продуктах "Salmonella 1 2 Fest" с использованием поликлональных антител ("On site test for early detection of Salmonella, "Prepared Food, 1988, v157, N 5, p. 257), одобренный АОАС для всех видов продуктов в качестве стандартного метода. Он позволяет получить надежный отрицательный результат через 38 40 часов. Установлено 96,1% совпадения результатов определения сальмонелл со стандартными бктериологическими методами (Flowers R.S. Klaff M.J. "Smmunodiffusion method for detection of mofile Salmonella in foods", J. Assoc, offic. Anal. Chem. 1989, 72, N 2, p. 303 311).

Недостатками метода являются удлинение срока исследования в случае обнаружения сальмонелл на 1 2 суток, а также возможность обнаружения только подвижных штаммов сальмонелл. Между тем известно, что в продуктах и кормах, особенно в подвергавшихся предварительной высокотемпературной обработке, подвижность сальмонелл может быть снижена. Встречаются также неподвижные серовары (S. gallinarum-pullorum) или неподвижные мутанты обычно подвижных сероваров ("Энтеробактерии" под ред. В.И. Покровского, М. 1985, стр. 127). К недостаткам метода также относится необходимость в специальной стеклянной посуде для проведения анализа.

Известен метод выявления сальмонелл на основе Н-специфичного G-иммуноглобулина (Minnich S. A. et al. "Enzime immunoassay for deteсtion of Salmonellae in foods", Appl. a. Environ. Microbiology"/. 1982, v.43, N 4, 877 883. Недостатком метода является сложность приготовления диагностического серологического препарата, применение для его получения дорогостоящих реактивов и необходимость выделения чистых культур сальмонелл, что удлиняет сроки исследования.

Наиболее близок к заявляемому способу метод "обогатительной серологии" (Sperber W.H. Deibel R.H. "Accelerated procedure for Salmonella detection in dried food and feeds involving only broth culture and serological reactions, "Appl. Microbiol. 1969 v17, p. 533 539/.

Индикация сальмонелл в соответствии с этим методом осуществляется за 52 часа. Метод включает: выращивание пробы на неселективной среде предобогащения (при +37^oC в течение 18 часов); пересев в селективную среду обогащения (выращивание посева при +37^oC 24 часа); вторичное элективное обогащение (при +37^oC 6 8 часов) и серологическое тестирование (2 часа). Метод исключает выделение чистой культуры (стадия плотных сред) и биохимическое тестирование. Серологическое тестирование проводят со среды вторичного обогащения методом реакции преципитации в пробирке с поливалентной Н-сывороткой (Spicer-Edwards-Test). Поливалентная H-сыворотка была получена отбором штаммов сальмонелл, содержащих H-антигены 1, 2, 3, 4 L complex, Z₆, poly-D, poly-F, и иммунизацией экспериментальных животных. Авторами показано, что метод по чувствительности сравним с традиционным, но более быстрый, менее трудоемкий и более дешевый, поскольку исключает стадию выращивания на плотных средах. Недостатком метода является неполный набор H-антител в комплексной сыворотке и невозможность индицировать некоторые серовары сальмонелл из-за отсутствия соответствующих специфических антител в комплексной H-сыворотке; например, S. agona (группа B), S. quinhou (группа X), S. gallinarum-pullorum и др. Другим недостатком метода является то, что в условиях значительных бактериальных загрязнений исследуемых проб вторичное подращивание на элективной среде может привести к вытеснению сальмонелл посторонней микрофлорой, что делает невозможной их серологическую индикацию. Кроме того, недоступность для многих лабораторий специфического диагностического препарата Sricer-Edwards-Test ограничивает возможности применения этого метода.

На основании изложенного задача настоящего исследования заключалась в разработке способа получения высокоспецифической чувствительной H-поливалентной сыворотки для ускоренной индикации сальмонелл в пищевых продуктах, кормах, объектах окружающей среды и медицине.

Сущность предлагаемого способа заключается в отборе штаммов сальмонелл, охватывающих широкий спектр H-антигенов и содержащих минимальный спектр менее специфичных О-антигенов; выделении из специально подобранных штаммов полиантигена, представляющего собой изолированные жгутики сальмонелл при удалении О-антигенов разрушением микробных тел; проведении гипериммунизации экспериментальных животных (кроликов) двумя циклами для повышения специфичности сывороток; получении конечного продукта сальмонеллезной родоспецифической поливалентной Н-сыворотки для обнаружения бактерий рода Сальмонелла в реакции агглютинации (РА) с чистой и смешанной культурой сальмонелл.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемого способа заключается в следующем: получение высокоспецифичной сальмонеллезной поливалентной Н-сыворотки, содержащей 31 Н-антиген I и II фазы при практическом отсутствии или минимальном содержании менее специфичных О-антигенов; такой набор Н-антигенов I и II фазы позволяет охватить практически все штаммы сальмонелл, имеющие жгутики, и избавиться от основного недостатка прототипа неполной антигенной формулы Spicer-Edwards-Test; получение сыворотки с конечным титром 1:3200 1:12800 и рабочим титром 1: 320, что значительно превосходит по активности титр используемых в настоящее время О-сывороток (титр 1:40); возможность индикации сальмонелл в чистой и смешанной культуре с плотных и жидких накопительных сред за счет высокой чувствительности предлагаемой сыворотки; повышение достоверности анализа по сравнению с серологическим тестированием, основанном на менее специфичных О-сыворотках; сокращение срока анализа с 6 7 суток до 1 2 суток за счет устранения этапа выделения чистой культуры и биохимического тестирования и возможности индикации сальмонелл в накопительной среде.

При разработке формулы полиантигена было учтено, что в антигенной формуле прототипа (Sperber W.H. Deibel R.H. 1969) были представлены в основном H-антигены II фазы (1, 2, 3, 4), которая чаще слабо выражены у "диких" штаммов сальмонелл, выделенных из окружающей среды. Для того чтобы в предлагаемом полиантигене было представлено максимальное количество H-антигенов I фазы, а также для того чтобы максимально снизить количество О-антигенов, был проведен анализ, в результате которого были отобраны 18 штаммов сальмонелл, в которых были представлены почти все H-антигены I и II фазы, а О-антигены были ограничены лишь 7 рецепторами группы B по схеме Кауфмана-Уайта (таблица I) и несколькими штаммами редких О-групп. Однако антигенная нагрузка вакцины было очень велика. С целью ее снижения был проведен новый анализ полиантигена, в результате которого оказалось возможным исключить из формулы Н-антиген II фазы 5, поскольку он идентичен Н-антигену 1,5 бактерий рода Цитобактер ("Энтеробактерии", М. 1985, стр. 168). Подавляющее большинство сальмонелл за редким исключением (S. gallinarum-pullorum) могут быть идентифицированы с помощью представленных в полиантигене 31 H-рецепторов.

Таким образом, при широком наборе Н-антигенов, спектр О-антигенов был ограничен семью рецепторами (1, 4, 5, 12, 17, 38 и 61). Кроме того, содержание О-антигена было снижено путем использования технологии получения Н-антигенов (А.С. Зуев, ЖМЭИ, 1967, N 1, 34 38).

Известно, что О-антиген расположен в клеточной стенке бактерий, Н-антиген в жгутиках. Предлагаемый полиантиген представляет собой изолированные жгутики, а О-антигены содержатся лишь в растворимом виде, так как микробные тела удалены по методу А.С. Зуева (ЖМЭИ, 1967, N 1, стр. 34 38).

Учитывая большую антигенную нагрузку вакцины, для иммунизации было использовано пятикратное разведение полиантигена.

Известно, что многоцикловая гипериммунизация приводит к снижению специфичности сывороток, поэтому для повышения специфичности поливалентной Н-сыворотки гипериммунизацию экспериментальных животных (кроликов) ограничили двумя циклами. Применяли общепринятую схему иммунизации: внутривенно в возрастающих объемах с 0,3 до 3,0 мл с 4 5 дневными интервалами и кровопусканием на 7-й день после последней инъекции. Адсорбцию сывороток проводили сухими микробными адсорбентами.

Активность полученной сыворотки была проверена в пробирочной реакции агглютинации с 54 культурами рода сальмонелла, которые не были включены в состав антигена. Титр сыворотки со всеми культурами был от 1:3200 до 1: 12800.

Специфичность сыворотки проверяли в pA на стекле с О-формами бактерий сальмонелла или кипячеными культурами, содержащими сопутствующие О-антигены, а также для определения межродовой специфичности с культурами рода Shigella (таблица N 2).

Приведенные результаты показывают, что получена активная Н-сыворотка, содержащая в небольшом количестве О-антитела. Для их удаления была проведена адсорбция сопутствующих О-антител сухими микробными адсорбентами. Рабочее разведение сыворотки до 1:320 позволило полностью избавиться от О-антител; сыворотки были лиофилизированы.

Таким образом, была получена поливалентная Н-сыворотка для индикации бактерий рода сальмонелл, значительно превосходящая по активности (титр 1: 320) используемые в настоящее время поливалентные О-сыворотки (титр 1:40) и позволяющая выявлять сальмонеллы в смешанной культуре. Специфичность предлагаемой Н-сыворотки позволяет делать заключение о присутствии сальмонелл без биохимического тестирования выделенных культур.

Чувствительность pA, применяемой для индикации сальмонелл, может быть повышена увеличением активности сыворотки (см. таблицу 3).

По результатам таблицы 3 видно, что поливалентная Н-сыворотка позволяет выявить бактерии в меньшей концентрации, чем стандартной сывороткой (О-сывороткой) ABCDE.

Выполнение анализа по ускоренному выявлению сальмонелл осуществляется следующим образом: испытуемая проба с соблюдением правил стерильности помещается в среду предобогащения (например, по прописи ISO 6579-1381E, Annex B, B-1, стр. 9) в соотношении пробы и среды 1:5. Посев помещается в термостат +37^oC и инкубируется в течение 6 часов. Из среды предобогащения бактериологической петлей производится высев на чашки с плотными селективными средами (висмут-сульфитным агаром BCA и эозин-метиленовым синим агаром - средой Левина). Чашки с посевами инкубируют в термостате при +37^oC в течение 24 часов. Одновременно с пересевом на плотные среды из колб со средой предобогащения производится высев 10 мл содержимого в колбу со 100 мл жидкой селективно-накопительной среды с хлористым магнием (по прописи "Энтеробактерии" под ред. В.И.Покровского, М. 1985, стр. 260). Посевы на жидких средах (предобогащения и магниевой) выращивают при +37^oC и встряхивании с частотой 150 170 об/мин в течение 18 20 часов. Затем производится пересев бактериологической петлей на плотные селективные среды BCA и Левина и выращивание при +37^oC в термостате в течение 24 часов.

Из посева в колбу со средой предобогащения, культивировавшегося при +37^oC и одновременном встряхивании в течение 26 часов, производится повторный высев 10 мл в 100 мл среды с хлористым магнием, который культивируют при +37^oC и встряхивании с частотой 150 170 об/мин в течение 6 часов. Затем из этой среды производят высевы на плотные селективные среды BCA и Левина, которые инкубируют в термостате при +37^oC в течение 22 24 часов. Пересевы с плотных селективных сред BCA и Левина, выращенные при +37^oC в течение 24 часов, изучали по общепринятым методам ("Энтеробактерии", М. 1985, стр. 32). Колонии, подозрительные на сальмонеллы, подвергали изучению в реакции агглютинации (pA) на предметном стекле с поливалентной сальмонеллезной Н-сывороткой. Нижеприведенные примеры показывают возможности получения специфической сальмонеллезной поливалентной Н-сыворотки.

Пример 1.

Из культур производственного музея ЛенНИИВС, полученных из коллекции ТИСК им. Тарасевича, были отобраны 18 штаммов сальмонелл, содержащих 31 Н-антиген I и II фазы (см. таблицу 1). Из них были получены Н-антигены, представляющие собой изолированные жгутики после удаления микробных тел. В качестве консерванта использовали формалин в конечной концентрации 0,3% Для получения полиантигена отдельные антигены свели в один в равных количествах.

Продуцентами иммунных сывороток служили кролики. Иммунизацию осуществляли по схеме: в два цикла внутривенно в возрастающих объемах с 0,3 до 3,0 мл с 4 5 дневными интервалами и кровопусканием на 7-й день после последней инъекции. Адсорбцию сывороток проводили сухими микробными адсорбентами. Сыворотки разведены до 1:320 и лиофилизированы.

Специфичность сыворотки проверена в pA на стекле с суточными агаровыми культурами сальмонелл, не использованных при получении полиантигена.

Результаты представлены в таблице 4.

Таким образом, предлагаемая поливалентная Н-сыворотка позволяет одномоментно выявлять различные серовары сальмонелл. Ее преимущество по сравнению с существующими поливалентными О-сыворотками, помимо высокой специфичности также и в том, что при скринговом выделении сальмонелл можно ограничиться постановкой только одной pA вместо двух, как это принято в рутинных анализах.

Пример 2.

Проверка активности предлагаемой поливалентной Н-сыворотки, полученной по способу, описанному в примере 1, была проведена в пробирочной pA с различными коллекционными сероварами сальмонелл. Результаты проверки приведены в таблице N 5.

Таким образом, предлагаемая адсорбированная сыворотка по активности примерно равна разведенной нативной. Титр цельной сыворотки 1:3200 1:12800, что значительно повышает ее чувствительность по сравнению с используемым в настоящее время поливалентными О-сыворотками (титр 1:40) и позволяет выявлять сальмонеллы в смешанной культуре с накопительных и плотных сред. Это сокращает длительность анализа до 1 2 суток вместо 6 7 при использовании традиционных диагностических сывороток по способу прототипа.

Нижеследующие сведения подтверждают использование сыворотки, получаемой по предлагаемому способу, для ускоренного выявления сальмонелл в кормах, пищевых продуктах, объектах окружающей среды и медицине.

Ввиду отсутствия возможности применения валютного препарата Spicer-Edwards-Test (США), принятого нами в качестве прототипа, все представленные ниже примеры выявления сальмонелл основаны на сравнении заявляемой диагностической поливалентной Н-сыворотки с традиционными препаратами (ГОСТ 28178-89 и Международной организации стандартизации ISO 6579-1381 E).

Пример 3.

Образец кормовой добавки эприна, полученной на основе этанола с использованием штамма-продуцента Candida utilis, подвергнут параллельному анализу на присутствие сальмонелл: ускоренным методом и ISO.

В соответствии с ускоренным методом образец в количестве 50 г засеян в 250 мл среды предобогащения. Культивирование проводили в водяной бане при +37^oC и встряхивании с частотой 170 об/мин в течение 6 часов. Далее осуществлен пересев на чашки Петри со средами BCA и Левина. Посевы культивировали 18 20 часов при +37^oC. При просмотре чашек на среде BCA обнаружены типичные колонии, подозрительные на сальмонеллы. Колонии изучены в pA с поливалентной H-сывороткой. РА положительна на ++++. Заключение о присутствии сальмонелл в испытуемой пробе сделано через 24 часа от начала исследования.

Одновременно с посевами по ускоренному методу выполнен контрольный посев 50г эприна в колбу со средой предобогащения по методу ISO. Посев инкубировали в термостате при +37^oC в течение 18 часов. Затем сделан высев 10 мл из среды предобогащения в 100 мл среды с хлористым магнием. Посев инкубировали в термостате при +37^oC в течение 20 часов. Сделан пересев на плотные селективные среды BCA и Левина. Посевы инкубировали в термостате при +37^oC в течение 22 часов. Колонии, подозрительные на сальмонеллы, были отсеяны на скошенный столбик дифференциальной комбинированной среды с лактозой, глюкозой и мочевиной (КДСМ) и помещены в термостат при +37^oC на 24 часа. После учета биохимических свойств и постановки pA с поливалентной О-сывороткой ABCDE и монорецепторными O- и H-сыворотками сделано заключение о присутствии сальмонелл в исследуемой пробе. Общий срок исследования составил 86 часов.

Таким образом, применение ускоренного метода индикации сальмонелл с использованием поливалентной Н-сыворотки позволило сократить (в 3,5 раза) срок исследования с сохранением достоверности результата, т.е. анализ был выполнен за 24 часа вместо 86 часов в соответствии со стандартным методом.

Пример 4.

26 образцов белково-витаминного концентрата на основе парафинов нефти (паприна) изучены на присутствие сальмонелл параллельно двумя методами - ускоренным и ISO по примеру 1. Установлено 100% совпадение результатов: сальмонеллы выделены двумя методами в 17 партиях паприна; установлено отсутствие сальмонелл в 9 партиях паприна двумя методами.

Таким образом, подтверждена сопоставимость результатов ускоренного метода с использованием Н-сыворотки с общепринятым при сокращении времени анализа в 3,5 раза.

Пример 5.

Определено присутствие сальмонелл в кормовых добавках, полученных культивированием дрожжей на различных субстратах (н-парафины нефти, этанол, метанол, природный газ), а также в пробах на различных технологических стадиях производства. Исследовали различные жидкостные технологические потоки (технологическую воду, отработанную культуральную жидкость, оборотную и сточные воды и т.д.), а также смывы и соскобы с технологического оборудования (упаковочных машин, пневмотранспорта и т.д.).

Исследования проводили параллельно: ускоренным методом с использованием предлагаемой сыворотки и методом ГОСТ 28178-89 ("Дрожжи кормовые. Методы исследования").

Срок исследования ускоренным методом составил 48 часов. Общий срок исследования методом ГОСТ, а (аналогично примеру 3) 5 6 суток.

Результаты исследования приведены в таблице 6.

Из данных таблицы следует, что в 100% данные ускоренного метода индикации сальмонелл соответствовали данным действующего ГОСТ, а 28178-89.

Пример 6.

Определяли присутствие сальмонелл в образце кормовой добавки из дрожжей на н-парафинах нефти (паприн). Исследование проводили параллельно ускоренным методом и методом ISO. В соответствии с ускоренным методом 50 г паприна было высеяно в 250 мл среды предобогащения. Дальнейший ход исследования в соответствии с примером 3.

Вследствие очень небольшого количества сальмонелл в исследуемой пробе, подозрительные на сальмонеллы колонии в количестве 3 были выделены только на плотных средах, высеянных с жидкой селективной среды после 30-часового культивирования. Принадлежность их к роду сальмонелл была подтверждена в pA с поливалентной Н-сывороткой. При этом общая длительность исследования составила: 24 часа (на среде предобогащения) + 6 часов (на среде с хлористым магнием) + 20 часов (рост на плотных средах) 50 часов. Длительность анализа методом ISO составила: 24 часа (на среде предобогащения) + 24 часа (на селективной селенитовой среде) + 20 часов (рост на плотных средах) + 20 часов (выделение чистой культуры на среде КДСМ) + 20 часов (изучение биохимических свойств в коротком пестром ряду) 4, 5 суток.

Пример 7.

Ускоренным методом определяли присутствие сальмонелл в образце кормовой добавки дрожжей, выращенных на природном газе (гаприн). В соответствии с ускоренным методом выполнен посев 50 г пробы партии гаприна в жидкую среду предобогащения. Дальнейший ход исследования в соответствии с описанием в примере 3. Через 46 часов от начала исследования на чашках с плотными селективными средами обнаружены колонии, подозрительные на сальмонеллы. При постановке pA с Н-поливалентной сывороткой результат реакции был отрицательным. Подозрительные колонии были отвиты на КДСМ и через 18 часов выращивания в термостате при +37^oC обнаружили типичные для сальмонелл биохимические свойства. Была поставлена pA на стекле со стандартными сальмонеллезными поливалентными сыворотками ABCDE групп и редких групп. РА с сывороткой редких групп дала положительный результат. Для подтверждения принадлежности выделенных культур к роду сальмонелла проведено дополнительное определение биохимических свойств культур.

Культуры сальмонелл, не агглютинирующиеся поливалентной Н-сывороткой, составляли не более 5 10% от общего числа положительных анализов. При этом срок исследования ускоренным методом удлинялся до 80 часов (3 3,5 суток). Срок исследования таких культур стандартным бактериологическим методом составил 5 6 суток.

Пример 8.

Определено присутствие сальмонелл в биологически очищенных промышленных сточных водах микробиологического производства, используемых для технологических целей. 500 мл пробы засеяны в 50 мл концентрированной селективной среды с хлористым магнием ("Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов", М. 1981 стр. 12). Колба с посевом выращена при +37^oC и встряхивании с частотой 150 об/мин в течение 6 часов. Бактериологической петлей сделан высев на плотные селективные среды BCA и Левина, которые инкубировали при +37^oC в течение 22 часов. На среде BCA обнаружен рост типичных сальмонеллезных колоний. Колонии изучены в pA с поливалентной сальмонеллезной Н-сывороткой. РА положительна. Сделано заключение о присутствии сальмонелл в испытуемой пробе.

Длительность исследования: 6 часов (выращивание в жидкой селективно-накопительной среде) + 22 часа (выращивание на плотной селективной среде) + 2 часа (постановка pA с поливалентной H-сывороткой плотной среды) 29 часов.

Длительность исследования общепринятым методом составила: 20 часов (выращивание в жидкой селективно-накопительной среде) + 20 часов (выращивание на плотной селективной среде) + 20 часов (выращивание в пробирках с дифференциально-диагностическими средами) + 1 час (постановка pA с поливалентными сальмонеллезными сыворотками) 61 час.

Пример 9.

Определено присутствие сальмонелл в зернистой икре. Исследование проводили параллельно двумя методами ISO и ускоренным. Ход исследования двумя методами по примеру 3. Результат анализа: в 50 г образца партии зернистой икры при исследовании двумя методами сальмонеллы не обнаружены. Результат определения ускоренным методом получен через 2 суток от начала исследования. Результат определения стандартным международным методом получен через 5 суток.

Пример 10.

Определено присутствие сальмонелл в партии мясо-костной муки из тушек норки. Исследование проводили параллельно предложенным методом и методом ГОСТ 25311-82 "Мука кормовая животного происхождения". Исследование ускоренным методом проводили аналогично изложенному по примеру 3. Исследование по методу ГОСТ 25311-82 осуществляли путем помещения навески 50 г пробы в 200 мл среды предобогащения (пептонной воды). Через 18 часов инкубации при +37^oC проводили посев 10 мл из пептонной воды в 50 мл среды Киллиана. После 18 часов термостатирования при +37^oC из среды Киллиана производили высев бактериологической петлей на плотные дифференциально-диагностические среды (BCA и среду Плоскарева). Засеянные чашки со средами поместили в термостат при +37^oC на 24 48 часов. На среде BCA через 48 часов обнаружен рост металлических колоний с серым центром. Колонии отвиты на среду КДСМ и помещены в термостат при +37^oC на 20 часов. При учете характера роста на КДСМ обнаружен грубый плотный рост культуры, ферментирующей лактозу и не продуцирующей сероводород, дающий феномен аутоагглютинации в физиологическом растворе.

В исследуемом образце партии мясо-костной муки из тушек норки сальмонеллы не были обнаружены. Результат исследования с помощью предлагаемой сыворотки получен через 48 часов, методом ГОСТ 25311-82 через 104 часа.

Пример 11.

Штамм S. enteritidis, выделенный от больного, выращен на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 20 часов. Бактериологической петлей сделан пересев в 5 мл среды с хлористым магнием. Посев выращен при +37^oC в течение 4 часов. С бульонной культурой поставлена pA с поливалентной Н-сывороткой и стандартной О-сывороткой ABCDE-групп.

Резуьтат pA с поливалентной Н-сывороткой положителен, с сывороткой ABCDE отрицателен.

Таким образом, активность поливалентной Н-сыворотки, получаемой по предлагаемому способу, позволяет выявлять присутствие сальмонелл в жидкой селективно-накопительной среде. Активность стандартной сыворотки ABCDE-групп была недоступна для выявления сальмонелл через 4 часа культивирования в жидкой среде.

На основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый способ получения специфической сальмонеллезной поливалентной Н-сыворотки является перспективным для выполнения анализов по ускоренному выявлению сальмонелл, так как обладает рядом преимуществ по сравнению со стандартными способами получения иммунодиагностических препаратов: позволяет получить высокоспецифичную Н-поливалентную сыворотку, содержащую 31 Н-антиген I и II фазы при практическом отсутствии или минимальном содержании менее специфичных О-антигенов. Формула предлагаемого полиантигена охватывает большинство штаммов рода сальмонелла, что исправляет недостаток прототипа, при исключении неспецифичного 1,5 антигена II фазы; позволяет получить сыворотку с конечным титром 1:3200 12800 и рабочим титром 1:320, что значительно превосходит по активности титр используемых в настоящее время диагностических сывороток (1:40); позволяет проводить серологическую индикацию как с чистой, так и смешанной культурой сальмонелл; повышает достоверность анализа и не дает ложноположительных результатов по сравнению с традиционными поливалентными О-сыворотками ABCDE и редких групп; позволяет сократить срок анализа с 6 7 суток до 1 2 суток, так как устраняется необходимость в выделении чистой культуры и биохимическом тестировании.

Заявляемая сыворотка испытана при выполнении анализов на обнаружение сальмонелл на заводах по производству кормовых дрожжей (в готовом продукте, на стадиях производства, объектах окружающей среды) с положительным результатом. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7

Формула изобретения

Способ получения специфической сальмонеллезной поливалентной Н-сыворотки для ускоренного выявления сальмонелл в пищевых продуктах, кормах, объектах окружащей среды и клиническом материале, включающий отбор штаммов бактерий рода сальмонелла с широким спектром Н-антигенов и минимальным содержанием О-антигенов, изготовление из отобранных штаммов антигенов с последующей гипериммунизацией кроликов-продуцентов и получением целевого продукта, отличающийся тем, что осуществляют отбор 18 штаммов сальмонелл, содержащих 31 Н-антиген I и II фазы, гипериммунизацию кроликов проводят двумя циклами и получают целевой продукт с титром Н-антител 1:3200 1:12800 при рабочем разведении 1:320.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9