Производные 5-амино-4-оксигексановой кислоты и способ их получения

Производные 5-амино-4-оксигексановой кислоты и способ их получения

Реферат

 

Использование: в медицине и биохимии. Сущность: производные 5-амино-4-оксигексановой кислоты ф-лы I: R₁-B₁-NH-CH(CH₂R₂)-CH(OH)-CH₂ -CH(CH₂R₃)-CO-A₁-A₂-N(R₄,R₅) с определенными буквенными значениями, способ их получения и производные 5-амино-4-оксигексановой кислоты, проявляющие активность при подавлении АSP-протеазы из ВИЧ-1. 3 табл.

Изобретение относится к негидролизующимся аналогам расщепляемых аспартатпротеазами пептидов, а именно к производным 5-амино-4-оксигексановой кислоты, проявляющим активность при подавлении -протеазы из ВИЧ-1, и способу их получения.

СПИД, как известно в настоящее время, представляет собой вызываемое ретровирусом ВИЧ ("вирус иммунодефицита человека") заболевание иммунной системы. Это заболевание, по оценкам ВОЗ, поразило около 10 миллионов людей и распространяется все далее. Заболевание практически всегда приводит к смерти пациента. Для терапии, сверх прежних ограниченных возможностей для облегчения симптомов СПИД и известных предохранительных возможностей, представляют особый интерес поиски препаратов, которые сами препятствуют размножению вируса, не повреждая интактных клеток и тканей пациентов.

Интересными являются соединения, которые блокируют размножение вируса тем, что они препятствуют объединению инфекционных вирусных частиц.

ВИЧ-1 и ВИЧ-2, смотря по обстоятельствам, в своем геноме имеют область, которая кодирует "gag-протеазу". Эта "gag-протеаза" ответственна за правильное протеолетическое расщепление протеинов-предшественников, которые происходят из кодирующих "Group Specific Antigens" (gag) отрезков генома. При этом высвобождаются структурные протеины вирусного ядра, по-английски "Со е". Сама "gag-протеаза" является составной частью кодированного отрезком pol-генома ВИЧ-1 и ВИЧ-2 протеина-предшественника, который также содержит отрезки "реверсивной транскриптазы" и "интегразы" и расщепляется по всей вероятности аутопротеолитически. "Gag-протеаза" расщепляет основной протеин ядра ("Маjor Core Protein") р24 ВИЧ-1 и ВИЧ-2, предпочтительно N-терминальный, пролиновых остатков, например, в двухвалентных радикалах Phe-Pro, Leu-Pro или Tyr-Pro. Речь идет о протеазе с каталитически активным аспартатным остатком в активном центре, так называемой аспартатпротеазе.

На основании центральной роли "gag-протеазы" при процессировании указанных "Со е-протеинов" ("протеинов центральной части"), исходят из того, что эффективное ингибирование этого фермента ин виво препятствует соединению зрелых вибрионов, так что соответствующие ингибиторы могут использоваться терапевтически.

Предпосылкой для терапевтической эффективности ин виво является достижение хорошей возможности биопользования, например, высокого уровня в крови, чтобы таким образом достичь в инфицированных клетках достаточно высоких концентраций.

Уже синтезирован ряд "gag-протеаз" ингибиторов, которые содержат центральные группы, представляющие собой непротеолитически расщепляемые пептид-изоэфиры. До сих пор, несмотря на интенсивные изыскания, еще не удалось найти пригодных для применения на людях ингибиторов аспартатпротеазы для борьбы со СПИДом для большей части инфицированных. В этом случае решающими являются прежде всего фармакодинамические проблемы.

Целью изобретения является изыскание новых ингибиторов ВИЧ-1 аспартатпротеазы.

Согласно изобретению предлагаются производные 5-амино-4-оксигексановой кислоты общей формулы: где R₁ означает водород, низший алкоксикарбонил, бензофураноил, пиридилкарбонил, морфолинилкарбонил, тетрагидроизохинолилкарбонил, морфолиносульфонил или N-(пиридилметил)-N-метиламинокарбонил, В₁ означает связь или двухвалентный радикал -аминокислоты валил, N-конец которой соединен с R₁, a С-конец с аминогруппой на атоме углерода, несущем R₂CH₂, R₂ и R₃ независимо друг от друга означают циклогексил или фенил, причем последний может быть незамещенным или замещенным в п-положении галогеном, трифторметилом, циано или низшей алкоксигруппой, A₁ и A₂ вместе обозначают двухвалентный радикал дипептида, выбранного из группы Val-Phe, Val-Cha, Val-(п-F)Phe, Val-(п-СН₃Phe, Val-Gly, Ile-Gly, Val-Val, Ile-Phe и Val-Tyr, N-конец которого соединен с группой -С= O, а С-конец с группой NR₄R₅ и R₄ и R₅ вместе с связанным атомом азота означают тиоморфолино- или морфолиногруппу или защищенные низшим алканоилом на гидроксигруппе производные этих соединений.

В описании изобретения используемое при определении групп или остатков, например низший алкоксил, низший алкоксикарбонил, выражение "низший" обозначает, что если не указано ничего другого, эти группы содержат вплоть до (включительно) 7 и предпочтительно 4 С-атомов.

В случае необходимости имеющиеся асимметрические С-атомы в заместителях R₁, B₁, R₂, R₃, A₁ и/или A₂, могут быть в (R), (S) или (R, S)-конфигурации. Таким образом, предлагаемые соединения могут быть в виде смесей изомеров или в виде чистых изомеров, в особенности в виде смесей диастереомеров, энантиомерных пар или чистых энантиомеров.

Используемые в описании изобретения общие выражения и обозначения имеют предпочтительно нижеследующие значения, причем указанные выше и ниже остатки могут применяться в любых комбинациях или в виде отдельных остатков вместо общих определений: Низший алкоксикарбонил R₁ содержит предпочтительно разветвленный низший алкильный остаток, в особенности втор. или трет.-низший алкильный остаток, и представляет собой, например, бутоксикарбонил, как трет.-бутоксикарбонил или изобутоксикарбонил. Особенно предпочтителен трет.-бутоксикарбонил.

Пиридилкарбонил представляет собой, например, пиридил-3-карбонил, морфолинилкарбонил, например морфолинокарбонил; бензофураноил-, например это 3-бензофураноил, тетрагидроизохинолинокарбонил-, например тетрагидроизохинолил-3-карбонил, предпочтительно тетрагидроизохинолил-3-карбонил.

Соединение формулы I, где R₁ обозначает морфолиносульфонил, а остальные остатки имеют выше указанные значения, особенно предпочтительны.

N-(пиридилметил)-N-метиламинокарбонил представляет собой, например, N-(2-пиридилметил)-N-метиламинокарбонил. Соединения формулы I, где R₁ обозначает N-(пиридилметил)-N-метиламинокарбонил, а прочие остатки имеют выше указанные значения, при определении соединений формулы I особенно предпочтительны.

Двухвалентный радикал B₁ a-аминокислоты, который на N-конце связан с R₁, а на С-конце связан с аминогруппой несущего R₂-CH₂-атома углерода, предпочтительно валин (Val) находится в D-, L- или (D,L)-, предпочтительно в L-форме, и в особенности соединен с остатками R₁, выбираемыми из /низший алкокси/-карбонила, например трет.-бутоксикарбонил, или гетероциклилкарбонила, как морфолинокарбонил.

Если B₁ обозначает связь, то R₁ прямо связан с аминным азотом, связывающим атом углерода несущего остатка R₂-CH₂- в формуле I.

Особенно предпочтительными являются такие комбинации R₂ и R₃, при которых по крайней мере один из остатков R₂ или R₃ является фенилом, который замещен остатком, выбираемым из галогена, в частности фтора, трифторметила, и цианогруппы, причем предпочтителен заместитель выбранный из фтора или цианогруппы.

Еще более предпочтительным является R₂, выбранный из фенила, 4-метоксифенила, 4-фторфенила, циклогексила и 4-трифторметилфенила, в то время как R₃ выбран из фенила, 4-метоксифенила, циклогексила, 4-фторфенила, 4-трифторфенила и 4-цианфенила.

В первую очередь R₂ выбирается из фенила, 4-фторфенила и циклогексила, в то время как R₃ выбирается из фенила, циклогексила, 4-фторфенила и 4-цианфенила.

В самую первую очередь предпочтительны комбинации: R₂ фенил и R₃ фенил; R₂ циклогексил и R₃ 4 цианофенил; R₂ циклогексил и R₃ 4-фторфенил; R₂ и R₃, смотря по обстоятельствам, циклогексил. Альтернативно или дополнительно к этому также главным образом предпочтительны комбинации: R₂ фенил и R₃ 4-фторфенил; R₂ фенил и R₃ 4 цианофенил; R₂ 4-фторфенил и R₃ 4-трифторметилфенил; R₂ 4-трифторметилфенил и R₃ фенил; R₂ 4-трифторметилфенил и R₃ 4-фторфенил; R₂ 4-трифторметилфенил и R₃ 4-трифторметилфенил.

Гидроксильная группа в соединениях формулы I на атоме углерода, который является соседним с атомом углерода, несущим остаток R₂CH₂-, может быть свободной или в защищенной форме, причем в качестве защитных для гидроксильных групп принимают во внимание низший алканоилокси, как ацетилокси.

Образованный из A₁ и A₂ двухвалентный радикал дипептида, центральная пептидная связь которого восстановлена и N-конец связан с группой -С=O, а С-конец связан с группой NR₄R₅, состоит предпочтительно из двух вышеуказанных гидрофобных a--аминокислот, в особенности из N-концевого аминокислотного радикала, выбираемого из Gly (восст.), Val (восст.) и Ile (восст.), и С-концевой аминокислоты, выбираемой из глицина, фенилаланина, тирозина, n-фторфенилаланина, n-метоксифенилаланина.

Указанные значения A₁ и A₂, которые вместе образуют двухвалентный радикал дипептида формулы, выбраны из группы Val-Phe, Ile-Phe, Val-Cha, Val-Gly, Val-(n-F-Phe), Val-(n-CH₃O-Phe)- Val-Tyr, Ile-Gly или Val-Val, где аминокислоты находятся в (D)- или (L)-, в особенности (L)-форме, за исключением (L)-Val-Phe, где Phe находится в (L)- или (D)-форме.

Предпочтительная форма осуществления изобретения относится к таким соединениям формулы I, где B₁, обозначает связь B₁ и A₂, смотря по обстоятельствам, обозначают один из указанных двухвалентных радикалов --аминокислоты или вместе обозначают один из указанных двухвалентных радикалов дипептида с восстановленной центральной амидной связью.

Предпочтительны соединения, где R₄ и R₅ образуют вместе со связывающим атомом азота незамещенную морфолиногруппу.

Таким образом, предпочтительными являются соединения формулы I, в которых R₁ обозначают водород, трет.-бутоксикарбонил, пиридин-3-карбонил, морфолинокарбонил, 3-бензофураноил или 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбонил, B₁ означает связь, R₂ и R₃ независимо друг от друга означают фенил или циклогексил, причем фенил незамещен или может быть замещен в п-положении радикалом, выбранным из группы метокси, фтор, трифторметил и циано, A₁ и A₂ вместе обозначают двухвалентный радикал дипептида, выбранного из группы Val-Phe, Val-Cha, Val-(пр-F)Phe, Val-(пр-CH₃O)Phe, Val-Gly, Ile-Gly, Val-Val, Ile-Phe и Val-Tyr, N-конец которого соединен с группой -С=O, а С-конец с группой NR₄R₅, и R₄ и R₅ вместе со связанным со связанным атомом азота означают тиоморфолино или морфолино.

Наиболее предпочтительным является соединение формулы I, в котором R₁ означает трет.-бутоксикарбонил, R₂ и R₃ соответственно фенил, A₁ и A₂ двухвалентный радикал дипептида (L)-Val-(L)-Phe, N-конец которого соединен с группой -С=O, а С-конец с группой NR₄R₅ a R₄ и R₅ вместе со связанным атомом азота означают морфолино.

Также предпочтительным является соединение формулы I Boc-Phe[C](пр-CH₃O)Phe-(L)-Val-(L)-Phe-морфолино-4-иламид, в котором R₁ означает трет.-бутоксикарбонил, R₂ фенил, R₃ - п-метоксифенил, A₁ и A₂ вместе означают радикал пептида (L)-Val-(L)-Phe, N-конец которого связан с группой -С=O, а С-конец соединен с группой NR₄R₅, a R₄ и R₅ вместе со связанным атомом азота означают морфолино.

Особенно важно соединение формулы I, где R₁ обозначает трет.-бутоксикарбонил, B₁ обозначает связь; R₂ циклогексил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ фенилаланин и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Также особенно важно соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, B₁ cвязь; R₂ циклогексил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ п-фторфенилаланин и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Также особенно важно соединение формулы I, где R₁ обозначает трет.-бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ циклогексил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ п-метоксифенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота означают морфолино.

Также еще особенно важным является соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ циклогексил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ циклогексилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Также особенно важным является соединение формулы I, где R₁ обозначает трет. -бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ циклогексил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ фенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают тиоморфолино.

Также особенно важно соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ циклогексил; R₃ п-фторфенил; A₁ изолейцин; A₂ фенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Особенно важным также является соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ фенил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ фенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Также особенно важным является соединение формулы I, где R₁ обозначает трет. -бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ п-фторфенил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ фенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Особенно важным еще является соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, B₁ связь; R₂ п-фторфенил; R₃ п-фторфенил; A₁ валин; A₂ п-фторфенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Особенно важным также является соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, B₁ связь; R₃ п-цианофенил; A₁ валин; A₂ фенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обозначают морфолино.

Также особенно важным является соединение формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил. B₁ связь; R₂ и R₃ фенил; A₁ валин; A₂ фенилаланин; и R₄ и R₅ вместе со связывающим атомом азота обеспечивают тиоморфолино.

Соединения предлагаемого изобретения обладают ингибирующим действием в отношении ретровирусных аспартатпротеаз, в особенности подавляющими gag-протеазы действиями. В первую очередь они ингибируют в нижеописанном тесте в концентрации 10^-6-10⁹ М действие gag-протеазы ВИЧ-1 и поэтому являются пригодными средствами против вызываемых этими или родственными ретровирусами заболеваний, такими как СПИД.

I. Способность соединений формулы ингибировать протеолитическую активность, например, ВИЧ-1-протеазы, можно продемонстрировать, например, согласно описанному J. Hansen и др. The EMBO Journal 7, 1785 1791 (1988) cпособу. При этом подавление действия ВИЧ-1 протеазы измеряется на субстрате, который представляет собой экспримированный в E. coli слитый протеин из gag-протеина-предшественника и MS-2. Субстрат и продукты его расщепления разделяют путем полиакриламидного гель-электрофореза и проявляют путем иммуноблокирования с моноклональными антителами против MS-2.

В еще более просто осуществляемом тесте, который позволяет иметь точные количественные показатели, в качестве субстрата для gag-протеазы используют синтетический пептид, который соответствует одному из мест расщепления gag-протеина-предшественника. Этот субстрат и продукты его расщепления можно измерять путем жидкостной хроматографии высокого давления (НРLC). Например, в качестве субстрата для рекомбинантно ВИЧ-1-протеазы (получение согласно Billich S. и др. J. Biol. Chem, 263 (34), 18905 17908. 1990) используют синтетический хромофорный пептид (например, HKARVL/NO₂/FEANles (Bachem, Швейцария)) или Икозаптид, как RRSNQVSNYPIBQNIQGRR (получен путем пептидного синтеза известными способами), который соответствует одному из мест расщепления gag-протеина-предшественника. Этот субстрат и продукты его расщепления могут измеряться путем жидкостной хроматографии высокого давления (НРLO).

Для этой цели испытуемый ингибитор формулы I растворяют в диметилсульфоксиде; ферментный тест осуществляют тем, что пригодные разбавления ингибитора в 20 мМ -морфолиноэтансульфокислоты, (МES)-буфер, рН 6,0 добавляют к смеси для анализа из 67,2 mM вышеуказанного хлороформного пептида в 0,3 М ацетата натрия, 0,1 М NaCl, pH 7,4; или 122 M вышеуказанного Икозапептида в 20 мМ МЕS-буфера, рН 6,0; количество смеси составляет 100 мкм. Реакция инициируется за счет добавки в первом случае 2 мкл, во втором случае 10 мкл ВИЧ-1-протеазы и в первом случае спустя 15 мин инкубации при 37^oС реакцию останавливают путем добавления 100 мкл 0,3 М НСlO₄, во втором случае спустя час инкубации при 37^oC реакцию останавливают путем добавления 10 мкл 0,3 М НСlO₄. Продукты реакции после центрифугирования пробы в течение 5 мин при 10000 х g в 100 мкл (реакционная смесь с хлороформным пептидом), соответственно, 20 мкл (смесь с Икозапептидом) полученной надосадочной жидкости и после внесения в НРLC-колонку 125 х 4,6 мм с Нуклеозилом.

C18-5 (Macherey and Nagel, Duren) и элюирования определяют количественно руководствуясь высотой пика продукта расщепления при 280 нм (смесь с хлороформным пептидом) или при 215 нм (смесь с Икозапептидом); градиент: 100 EI. 1 > 50 EI.1/50 EI.2/E1.1: 10 ацетонитрила, 90 воды, 0,1 трифторукусусной кислоты (ТФК); EI1.2: 75 ацетонитрила, 25 воды, 0,08 ТФК в течение 15 мин; скорость пропускания 1 мл в минуту (EI. элюент).

При этом для соединений формулы I предпочтительно определяются IC₅₀-значения (IC₅₀ такая концентрация, которая снижает активность ВИЧ-1-протеазы по сравнению с контролем без ингибитора на 50) примерно 10^-6-10^-9 М, в особенности 10^-7-10^-8 M.

II. В другом тесте было показано, что соединения изобретения защищают клетки, которые обычным путем инфицируются ВИЧ, от такой инфекции или по меньшей мере замедляют такую инфекцию. При этом человеческую Т-клетку-лейкемии линии М-Т (Science, 229, 563. 1985), ВИЧ-1 или c ВИЧ-1 в присутствии одного из предлагаемых в изобретении соединений и спустя несколько дней оценивают на жизнеспособность таким образом обработанные клетки.

Для этой цели МТ-2 клетки в RPMI 1640-среде (Gibco, Швейцария; RPMI 1640 содержит смесь аминокислот без L-Gbn), которая дополнена 10 активированной при нагревании зародышевой телячьей сыворотки, 1-глютамином, Hepec (2-[4-(2-оксиэтил)-1-пиперазино] -этансульфокислота) и стандартным антибиотиком, выдерживают при 37^oC в увлажненном воздухе с 5 СО₂ 5 мкл соответствующего тест-соединения в культуральной среде и 100 мкл ВИЧ-1 в культуральной среде и 100 мкл ВИЧ-1 в культуральной среде (800 ТСID 50/мл) (ТСIL 50 инфекционная доза клеточной культуры 50 доза, которая инфицирует 50 МТ-2-клеток) вносят в 4 х 10³ экспоненциально растущих МТ-2-клеток в 50 мкл культуральной среды на углубление на планшетах для микротитра с 96-ю отверстиями. Параллельные смеси на другом планшете для микротитра с клетками и тест-соединением содержат 100 мкл культуральной среды без вируса. После инкубации в течение 4-х дней определяют в 10 мкл надосадочной жидкости клеток активность реверсной транскриптазы (РТ). РТ-активность определяется в 50 мМ Трис (a, a, a-трис(оксиметил)-метиламин, ультрачистый, Merck, ФРГ), pH 7,8; 75 мМ КСl, 2 мМ дитиотреитола, 5 мМ MgCl₂; 0,05 Nonedet P-40 (детергент; Сигма, Швейцария); 50 мкг/мл полиадениловой кислоты (Фармация, Швейцария); 1,6 мкг/мл dT (12 18) (Сигма, Швейцария). Смесь отфильтровывают через 0,45 Acrodisc-фильтр (Gelleman Science Inc. Ann. Arbor) и хранят при -20^oC. К аликвотам этого раствора добавляют 0,1 (по объему) /альфа-³²P/dTTP для достижения радиоактивной конечной активности 10 Ci/мл. 10 мкл культуральной надосадочной жидкости переносят на новый планшет с 96-ю отверстиями для микротитра и туда же добавляют 30 мкл указанного RT-"коктейля". После смешения планшет инкубируют в течение 1,5 3 ч при 37^oC. 5 мкл этой реакционной смеси переносят на ватман DEE81 (Ватман). Высушенные фильтры промывают три раза по 5 мин с помощью 300 мМ NaCl/25 мМ три-/цитрата натрия/ и 1 раз с помощью 95-ного этанола и снова высушивают на воздухе. Оценку осуществляют в Matrix Packard 96 well coumter (Паккард). ЭД₉₀-значения рассчитывают и в качестве самой низкой концентрации соответствующего тест-соединения определяют такую, которая снижает RT-активность на 90 по сравнению с необработанными клеточными смесями тест-веществам. RT-активность при этом является мерой размножения ВИЧ-1.

Предлагаемые согласно изобретению соединения при этом показывают ЭД₉₀ примерно 10^-5-10^-8 M, предпочтительно примерно 10^-7-10^-8 М.

Соединения изобретения проявляют предпочтительные фармакокинетические свойства и можно ожидать, что они ин виво оказывают указанные ингибирующие действия. Так, например, уровень в крови при внутривенном или интраперитональном введении мышам 20 мг/кг соединения формулы I спустя 10 мин после введения равен 4 мкг/мл крови и выше. Далее, при пероральном введении 120 мг/кг соединения формулы I концентрация спустя 90 мин примерно такая же высокая или выше, чем вышеупомянутая ЭД₉₀.

Определение уровня в крови осуществляют, например, следующим образом: исследуемые соединения растворяют в органическом растворителе, как диметилсульфоксид (ДМСО). Раствор оксипропил-b-циклодекстрина (20 вес./объем) в воде добавляют вплоть до получения желательной концентрации биологически активного вещества (например, 2 мг/мл для парентерального введения, 12 мг/мл для орального введения) при одновременном установлении концентрации 5 ДМСО (по объему). Соединения, которые в этих условиях нерастворимы, при парентеральном введении вводятся только интраперитонально; растворимые соединения дополнительно внутривенно. После введения соединений (например, 20 мг/кг внутривенно или интраперитонально, или 120 мг/кг перорально) в различные моменты времени, например спустя 10 мин при парентеральном введении или спустя 90 мин при пероральном введении, отбирают кровь. На момент времени используют кровь трех мышей и либо для каждой мыши по отдельности, либо из трех объединенных проб крови трех мышей, после добавки растворителя, например ацетонитрила, и последующего центрифугирования, получают надосадочную жидкость. Концентрация биологически активного вещества определяется с помощью НРLC, например на колонке с Nucleosil 5C₁₈ длиной 120 мм и диаметром 4,6 мм с помощью смеси или 60 ацетонитрил (40 вода) 0,05 трифторуксусная кислота (по объему), или 50 ацетонитрил (40 вода) 0,05 трифторуксусная кислота (по объему) в качестве элюирующего средства при скорости истечения 1 мл/мин и детектировании и определении количества при 200 нм.

Другим объектом данного изобретения является способ получения соединения формулы I, заключающийся в том, что карбоновую кислоту формулы: или ее реакционноспособное производное, где R₁ обозначает водород (низший алкокси)-карбонил, бензофураноил, пиридилкарбонил, морфолинилкарбонил, тетрагидроизохинолилкарбонил, морфолиносульфонил или N-(пиридилметил)-N-метиламинокарбонил; B₁ обозначает связь или двухвалентный радикал -аминокислоты валин, N-конец которой связан с R₁, a C-конец с аминогруппой на атоме углерода, несущем R₂CH₂-; R₂ и R₃ независимо друг от друга обозначают фенил или циклогексил, причем фенил может быть замещен в п-положении заместителем, выбранным из низшего алкоксила, галогена, трифторметила и цианогруппы, конденсирует с амино-соединением формулы: или его реакционно-способным производным, где A₁ и A₂ вместе образуют двухвалентный радикал дипептида формулы: Val-Phe, Val-Cha, Val-(п-F)Phe, Val-(пCH₃O)Phe, Val-Gly, Ile-Gly, Val-Val, Ile-Phe и Val-Tyr, который N-концом связан с группой -С=O, а С-концом с группой NR₄R₅, и R₄ и R₅ вместе со связующим атомом азота обозначают тиоморфолино или морфолино, причем свободные функциональные группы в исходных соединениях формул VI и VII, за исключением участвующих в реакции, в случае необходимости находятся в защищенной форме и при желании отщепляют имеющиеся защитные группы.

Соединения формулы I или их производные с защищенной гидроксильной группой и соли таких соединений по меньшей мере с одной солеобразующей группой могут быть получены и другими известными способами, например: a) для получения соединений формулы: где R₁ имеет указанные для соединений формулы I значения R₁ кроме водорода; гидроксильная группа на атоме углерода, который является соседним к атому углерода, несущему остаток R₂-CH₂-, свободная или находится в защищенной форме, а остальные остатки имеют указанные для соединений формулы I значения, карбоновую кислоту формулы: R'₁ OH (II); или реакционно-способное производное этой кислоты, где R'₁ имеет те же значения, что и R₁ в соединении I, кроме водорода, конденсируют с аминосоединением формулы: или его реакционно-способным производным, где остатки имеют указанные для соединений формулы I значения, причем в исходных соединениях формул II и III свободные функциональные группы, за исключением принимающих участие в реакции, находятся в защищенной, в случае необходимости, форме, и в желательном случае имеющие защитные группы отщепляют, или б) для получения соединений формулы: где B'₁ обозначает такие же остатки, как и B₁ в соединениях формулы I, кроме связи; гидроксильная группа на С-атоме, который является соседним к атому углерода, несущему остаток R₂-CH₂-, свободная или находится в защищенной форме, а остальные остатки имеют указанные для соединений формулы I значения, карбоновую кислоту формулы: R₁-B'₁-OH (IV), или ее реакционно-способное производное этой формулы, где R₁ имеет указанные для соединений формулы I значения, и B'₁ имеет прежде всего указанные последними значения, конденсируют с аминосоединением формулы: или его реакционноспособным производным, где остатки имеют указанные для соединений формулы I значения, причем свободные функциональные группы в исходных материалах формул IV и V, за исключением принимающих участие в реакции, в случае необходимости находятся в защищенной форме, и в желательном случае отщепляют имеющиеся защитные группы; или в) для получения соединений формулы: где A'₁ и A'₂ имеют значения A₁ и A₂ в соединениях формулы I, причем A'₁, однако, не обозначает никакой связи и пептидная связь между A'₁ и A'₂ находится не в восстановленной форме; гидроксильная группа на С-атоме, который является соседним к несущему остаток R₂-CH₂-атому углерода, свободна или находится в защищенной форме, а прочие остатки имеют указанные для соединений формулы I значения, карбоновую кислоту формулы: или ее реакционноспособное производное, где остатки имеют указанные значения, конденсируют с аминосоединением формулы: или его реакционноспособным производным, где остатки имеют указанные выше значения, причем свободные функциональные группы в исходных материалах формул VIII и IX, за исключением участвующих в реакции, находятся в защищенной форме, и в желательном случае имеющиеся защитные группы отщепляют, или г) карбоновую кислоту формулы: или ее реакционноспособное производное, где остатки имеют указанные для соединений формулы I значения, конденсируют с аминосоединением формулы: или его реакционноспособным производным, причем остатки имеют указанные для соединений формулы I значения; причем свободные функциональные группы в исходных материалах формул Х и XI, за исключением участвующих в реакции, в случае необходимости находятся в защищенной форме, и в желательном случае имеющиеся защитные группы отщепляют; или д) в соединении формулы I, где заместители имеют вышеуказанные значения, с тем условием, что в соответствующем соединении формулы I по меньшей мере одна функциональная группа защищена защитными группами, отщепляют имеющиеся защитные группы; и/или при желании полученное по одному из представленных способов а) и б) соединение формулы I по меньшей мере с одной солеобразующей группой переводят в его соль и/или полученную соль переводят в свободное соединение или в другую соль и/или в случае необходимости полученные смеси изомеров соединений формулы I разделяют и/или предлагаемое согласно изобретению соединение формулы I превращают в другое, согласно изобретению, соединение формулы I.

Вышеприведенные способы описываются подробнее ниже.

Способ а) (Получение амидной связи).

В исходных материалах формул II и III функциональные группы, за исключением групп, которые должны принимать участие в реакции или не реагируют в реакционных условиях, независимо друг от друга защищены защитными группами.

К защитным группам для функциональных групп в исходных материалах, взаимодействия которых нужно избегать, в особенно карбокси-, амино- и окси-группы, относятся в особенности такие защитные группы, которые обычно применяются при синтезе пептидных соединений, а также цефалоспоринов, пенициллинов, и производные нуклеиновых кислот и сахаров. Эти защитные группы могут иметься уже в предыдущих стадиях и должны защищать соответствующие функциональные группы от нежелательных побочных реакций, как ацилирования, этерификации до простых и сложных эфиров, окисления, сольволиза и т. д. В определенных случаях, кроме того, защитные группы вызывают селективное, например стереоселективное, протекание взаимодействий. Характерным для защитных групп является то, что они легко, т. е. без нежелательных побочных реакций, отщепляются, например, сольволизом, восстановлением, фотолизом или ферментативно, например, в физиологических условиях. Защитные группы, однако, также могут иметься в целевых веществах. Соединения формулы I с защищенными функциональными группами могут обладать более высокой метаболической стабильностью или, иначе, улучшенными фармакологическими свойствами, чем соответствующие соединения со свободными функциональными группами. Соответствующие соединения с защищенными группами, например с защищенными гидроксильными группами, могут представлять собой также "Рrodergs", которые ин виво активируются за счет ферментативного расщепления, например, благодаря эстеразам.

Защита функциональных групп такими защитными группами, сами защитные группы, а также реакции их отщепления описаны, например, в стандартных работах, как J. F. W. McOmie. "Prorective Groups in Organic Chemistry" Plenum Press. Лондон и Нью-Йорк. 1973; в Th. W. Greene "Protectice Groups in Organic Synthesis". Wiley. Нью-Йорк. 1981; в "The Pepdides" т. 3 (E. Gross и J. Meienhofer, Herausg), Academic Press. Лондон и Нью-Йорк, 1981; в "Методах органической химии". Губен-Вейль, 4-е изд. т. 15/1 изд. Georg Thime Штутгарт, 1974, в Н.-D. Jakubre и Н. Jescheit "Aminosauren, Peptide, Proteice" изд. Сhemie Weinheim, Deerfield Basel 1982; и в Jochen Lehmann "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate изд. Georg Thieme. Штутгарт, 1974.

Карбоксильная группа, например, защищается в виде сложноэфирной группы, которая при мягких условиях селективно расщепляется. Для защиты карбоксильная группа в первую очередь этерифицируется до сложноэфирной благодаря низшей алкильной группе, которая в 1-положении низшей алкильной группы разветвлена или в 1- или 2-положении низшей алкильной группы замещена пригодными заместителями.

Защищенная карбоксильная группа, которая этерифицирована до сложноэфирной за счет низшей алкильной группы, представляет собой, например, метоксикарбонил или этоксикарбонил.

Защищенная карбоксильная группа, которая этерифицирована до сложноэфирной за счет низшей алкильной группы, которая в 1-положении низшей алкильной группы разветвлена, представляет собой, например, трет.-(низший алкокси)-карбонил, например трет,-бутоксикарбонил.

Защищенная карбоксильная группа, которая этерифицирована до сложноэфирной за счет низшей алкильной группы, которая в 1- или 2-положении низшей алкильной группы замещена пригодными заместителями и представляет собой, например, арилметоксикарбонил с одним или двумя арильными остатками, где арил обозначает незамещенный или моно-, ди- или тризамещенный, например, низшим алкилом, например трет.-(низшим алкилом), как трет.-бутил, низшим алкоксилом, например, метокси; гидроксилом; галогеном, например, хлором, и/или нитрогруппой фенил; например, бензилоксикарбонил; замещенный указанными заместителями бензилоксикарбонил; например, 4-нитробензилоксикарбонил или 4-метоксибензилоксикарбонил, дифенилметоксикарбонил или замещенный указанными заместителями дифенилметоксикарбонил, например, ди-(4-метоксифенил)-метоксикарбонил; далее этерифицированный до сложного эфира низшей алкильной группой карбоксил, причем низшая алкильная группа в 1- или 2-положении замещена пригодными заместителями, как 1-низший алкокси-низший алкоксикарбонил, например метоксиметоксикарбонил, 1-метоксиэтоксикарбонил или 1-этоксиэтоксикарбонил, 1-(низший алкилтио)-(низший алкокси)-карбонил, например 1-метилтиометоксикарбонил или 1-этилтиоэтоксикарбонил, ароилметоксикарбонил, где арильная группа представляет собой в случае необходимости замещенный, например, галогеном, как бром, бензоил, например, фенацилоксикарбонил, 2-галоген-(низший алкокси)-карбонил, например 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, 2-бромэтоксикарбонил или 2-иодэтоксикарбонил, а также 2-(тризамещенный силил)-низший алкокси-/карбонил, где заместители, независимо друг от друга, обозначают, каждый, в случае необходимости замещенный, например низшим алкилом, низшим алкоксилом, арилом, галогеном и/или нитрогруппой, алифатический, аралифатический, циклоалифатический или ароматический углеводородный остаток, например, в случае необходимости замещенный как указано выше низший алкил, фенил-(низший алкил), циклоалкил или фенил, например 2-три-(низший алкил)-силил-(низший алкокси)-карбонил, как 2-три-(низший алкил)-силилэтоксикарбонил, например 2-триметилсилилэтоксикарбонил или 2-(ди-н-бутил-метил-силил)-этоксикарбонил или 2-триарилсилилэтоксикарбонил, как трифенилсилилэтоксикарбонил.

Карбоксильная группа может быть также защищена в виде органической силилоксикарбонильной группы. Органическая силилоксикарбонильная группа, например, представляет собой три-(низший алкил)-силилоксикарбонильную группу, например триметилсилилоксикарбонил. Атом кремния силилоксикарбонильной группы также может быть замещен двумя низшими алкильными группами, например метильными группами, и амино- или карбоксигруппой второй молекулы формулы I. Соединения с такими защитными группами можно получать, например, с помощью диметилхлорсилана в качестве силилирующего средства.

Карбоксильная группа защищается также в форме внутреннего сложного эфира с находящейся на пригодном расстоянии, например в --положении, к карбоксильной группе в молекуле гидроксильной группой, т. е. в форме лактона, предпочтительно --лактона.

Защищенная карбоксильная группа предпочтительно представляет собой трет. -(низший алкокси)-карбонил, например трет.-бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил, 4-нитробензилоксикарбонил, 9-флуоренилкарбонил или дифенилметоксикарбонил, или защищенную в форме лактона, в особенности --лактона, карбоксильную группу.

Защищенная аминогруппа защищена защитной для аминогруппы группой, например, в форме ациламино-, арилметиламино-, этерифицированной до простого эфира меркаптоамино-, 2-ацил-(н