Биосовместимый гидрогель

Биосовместимый гидрогель

Реферат

 

Биосовместимый гидрогель предназначен для исправления косметических или функциональных дефектов, (например, грудных желез, голосовых связок, пениса и т. д. путем их эндопротезирования), для создания внутритканевых депо лекарственных препаратов пролонгированного действия, для использования в качестве электропроводных иммерсионных сред и для пожизненного тампонирования каверн. Он содержит полимер на основе акриламида, полученный с использованием инициатора радикальной полимеризации в апирогенной воде в качестве дисперсионной среды. Для повышения упругости, формоустойчивости и стабильности массивных имплантатов и, соответственно, лечебной или косметической эффективности преимущественно при эндопротезировании гидрогель содержит поперечно сшитый полиакриламид, полученный с использованием биосовместимого сшивающего агента, преимущественно метилен-бис-акриламида, и предпочтительно с использованием в качестве инициатора полимеризации смеси персульфата аммония и тетраметилэтилендиамина. Предпочтительная концентрация указанного полимера в гидрогеле - от 3,5 до 9 мас.%. 5 табл., 2 ил., 4 з.п.ф.

Изобретение относится к рецептурам биосовместимых гидрогелей медицинского назначения, которые могут быть использованы: в процессах эндопротезирования путем целенаправленных инъекций для исправления преимущественно тех дефектов человеческого организма, которые обусловлены травматическими, врожденными или возрастными искажениями формы и размеров или потерей устойчивости формы некоторых органов, состоящих из мягких тканей, например, в косметологической практике для коррекции формы и размеров лица и других частей тела и, особенно, для маммопластики (предпочтительно при а- и гипоплазии молочных желез, в оториноларингологической практике для лечения голосового аппарата путем коррекции формы и размеров голосовых связок, в мужской сексологии (в случаях стабильно слабой эрекции) для повышения потенции путем заполнения пещеристых тел пениса упругой средой; в процессах эндопротезирования, совмещенных с кожной пластикой, путем предварительного изготовления заготовок протезов отливкой в формы и имплантации этих заготовок с оперативным доступом к ложу протеза; в процессах длительного медикаментозного лечения (например, абсцессов или опухолей) для создания депо лекарственных препаратов пролонгированного действия внутри или вблизи пораженных органов; для тампонирования полостей, возникших вследствие заболеваний (например, туберкулезных каверн) или травм различной этиологии; в качестве физиологически нейтральной электропроводной иммерсионной среды между кожей пациента и электродами, в процессах длительного контроля электрофизиологических параметров организма (например, непрерывного контроля сердечной или мозговой деятельности), в процессах электрофоретического введения лекарств в качестве основы преимущественно лекарственных мазей с использованием воды как дисперсионной среды.

Потребность в исправлении косметических и функциональных дефектов указанных и им подобных типов ныне стала массовой и нередко обусловлена только желаниями пациентов. Также массовыми являются потребности в электрофизиологической диагностике, в медикаментозном лечении с созданием депо лекарственных препаратов и в щадящем физиологически эффективном тампонировании каверн различной этиологии.

Поэтому к биосовместимым материалам указанного назначения предъявляется ряд трудно сочетаемых требований. К важнейшим из них относятся: длительное (наиболее желательно пожизненное) сохранение формы и размеров эндопротезированного органа независимо от возраста, в котором была проведена коррекция; максимально возможная биосовместимость характеризуемая, в частности, исключением канцерогенности, отсутствием аллергических реакций (желательно даже кратковременных, возникающих непосредственно после введения избранного материала внутрь организма или наложения его на кожу и, особенно, слизистые оболочки), отсутствием грубого капсулирования или отторжения эндопротеза, тампона или депо для лекарственного препарата и свободным протеканием метаболических процессов в зоне, заполненной биосовместимым материалом; минимальная травматичность и длительность введения биосовместимого материала, особенно при эндопротезировании с использованием больших (до 1 л) доз.

Раздельное выполнение указанных требований или некоторых из их комбинаций не представляет существенных затруднений.

Например, достаточно стойкий клинический эффект может быть достигнут при использовании в качестве биосовместимого материала для эндопротезирования гортани фторопластовой (тефлоновой) пасты на основе глицерина Глицерин, как известно, обладает большей вязкостью, чем вода, и потому паста при хранении оказывается достаточто стабильной. При инъекциях же глицерин служит эффективной смазкой.

Однако в силу неограниченной растворимости в воде и водосодержащих жидкостях организма глицерин быстро (от нескольких часов до суток) выводится из зоны эндопротезирования. В дальнейшем не исключено и постепенное механическое выведение из нее микрочастиц тефлона с током лимфы и крови. Это приводит к уменьшению объема эндопротеза и существенному снижению эффективности лечения. Поэтому несмотря на биохимическую инертность тефлона эндопротезирование с его использованием приходится периодически повторять.

Кроме того, твердые частицы тефлона механически раздражают ткани, контактирующие с эндопротезом, что практически во всех случаях вначале вызывает выраженную асептическую воспалительную реакцию, а иногда стеноз гортани с потребностью в ургентной трахеотомии.

Поэтому для указанных нужд более целесообразно использование гелеобразующих биосовместимых материалов.

Действительно, минимальная травматичность и длительность эндопротезирования при отсутствии канцерогенности и минимуме аллергических реакций достигаются при использовании водного раствора высокоочищенного деградированного по степени полимеризации бычьего коллагена, который после инъекций внутри корректируемого по форме и размерам органа образует при температуре менее 37^oС упругий устойчивый к механической деформации гидрогель.

Однако будучи белком, коллаген за сравнительно короткое время (обычно менее полугода) полностью рассасывается в организме пациента. Поэтому он пригоден для эндопротезирования преимущественно в тех случаях, когда допустимо полное замещение эндопротеза соединительной тканью или когда пациенту по медицинским показаниям необходим именно временный эндопротез.

Раствор бычьего коллагена из-за рассасывания и способности к внутритканевой и межтканевой миграции малопригоден для депонирования лекарственных препаратов, а из-за ферментативной неустойчивости и низкой электропроводности практически неприменим для использования в качестве иммерсионной среды.

В связи с изложенным более перспективными следует признать гелеобразующие биосовместимые материалы на основе синтетических полимеров.

Так, известно применение для нужд эндопротезирования биосовместимого гелеобразующего материала в виде гидрофильных полигликолей сложных эфиров метакриловой кислоты (Kresa L. Rems T. Wichterle O, Hydron gel implantat in vocal cord // Otolaryngol. Head Neck Surg. 1988, V. 98, No 3, pp. 242-245).

Требуемую дозу такого материала в сухом виде имплантируют через разрез в зоне коррекции косметического или функционального дефекта и операционную рану ушивают. Далее материал набухает, поглощая воду из прилегающих тканей, и обеспечивает локальное увеличение объема корректируемого органа, например, голосовой связки.

Указанный биосовместимый материал биохимически весьма стабилен.

Однако стойкий лечебный эффект при его применении достигается ценой травматичных хирургических вмешательств, сопровождающихся отеками и асептическими воспалениями; его использование для формирования внутритканевых депо лекарственных препаратов весьма затруднительно, а создание на его основе электропроводных иммерсионных сред практически нецелесообразно.

Соответственно, для эндопротезирования и других указанных нужд наиболее перспективны жидкие готовые к употреблению и допускающие введение путем инъекций биосовместимые гелеобразующие материалы.

Примером может служить биосовместимый гелеобразующий материал в виде раствора не растворимого непосредственно в воде поперечно несшитого (non-crosslinked) полимера или сополимера акрилонитрила, поливинилацетата, линейного или слаборазветвленного полимера и сополимера 2-гидроксиэтилакрилата и метилакрилата, полимера n-винилиминокарбонила в диметилсульфоксиде или ином полярном свободно смешивающемся с водой органическом растворителе (Stoy V. Chvapil M. Патент США N 4631188, 1986). В качестве добавочных мономеров при получении сополимеров предусмотрено использование акриламида (в том числе N-замещенного), акрилгидразида (в том числе, N-замещенного), акриловой кислоты и ее солей, глутаримида и винилсульфона, а в качестве полярных свободно смешивающихся с водой растворителей глицерин и его моно- или диацетаты, метанол, этанол, пропанол и изопропанол, диметилформамид, гликоли и т.д.

Этот материал эффективен при коррекции незначительных косметических или функциональных дефектов, в частности, при эндопротезировании губ и других деталей лица, уже упоминавшихся голосовых связок и т.п.

Однако при тампонировании значительных по объему каверн или коррекции эндопротезами формы и размеров молочных желез может потребоваться до 1 л указанного материала. В таких случаях количество введенного вместе с гелеобразующим полимером органического растворителя оказывается существенно выше физиологически допустимого минимума, следствием чего может быть эритема, а в некоторых случаях и аллергический шок. Наряду с этим из-за линейной структуры используемого гелеобразующего полимера отмечается и слабая формоустойчивость эндопротезов, которая оказывается тем хуже, чем больше их объем.

Поэтому наиболее желательно использование готовых гидрогелей, не содержащих аллергенов.

Из их числа к предлагаемому наиболее близок биосовместимый гидрогель, содержащий 3,0 мас. полимера на основе акриламида, полученного с использованием инициатора радикальной полимеризации (в частности, персульфата аммония) в дисперсионной среде в виде апирогенной бидистиллированной воды (авт.свид. СССР N 1697756).

Этот гидрогель практически полностью биосовместим с тканями и средами человеческого организма во всех указанных аспектах и потому может без выраженных негативных биохимических и биологических последствий применяться в значительных (до 1 л) объемах. Он образует в зоне введения (эндопротезирования, тампонирования и т.д.) структуру, свободно проницаемую не только для воды, ионов, кислорода, но и низкомолекулярных метаболитов. Имплантаты из описанного гидрогеля довольно быстро (к пятому-шестому месяцам) прорастают собственной молодой волокнистой соединительной тканью реципиента. Такой исход особенно желателен при (микро)аллопластике голосового аппарата.

Однако описанный гидрогель имеет низкую вязкость и, соответственно, низкую упругость и высокую подвижность. Вода в нем слабо связана с макромолекулами полиакриламида и быстро выводится из имплантатов, что приводит к их заметной усадке и к существенному ухудшению косметического или лечебного эффекта. Поэтому при объемном (например, интрамаммарном) эндопротезировании, тампонировании каверн и при создании долговременных внутритканевых депо лекарственных препаратов устойчивость имплантатов к внешним деформирующим нагрузкам и к усадке оказывается тем ниже,чем больше их первоначальный объем.

Описанный гидрогель из-за высокой текучести недостаточно эффективен и при наружном применении в качестве электропроводной иммерсионной среды.

Целью изобретения является создание путем усовершенствования состава полиакриламида такого биосовместимого гидрогеля, который обеспечивал бы более высокую упругость, формоустойчивость и стабильность массивных имплантатов и, соответственно, больший лечебный или косметический эффект преимущественно при эндопротезировании.

Это достигается тем, что биосовместимый гидрогель, содержащий полимер на основе акриламида, полученный с использованием инициатора радикальной полимеризации в апирогенной воде в качестве дисперсионной среды содержит поперечно сшитый полиакриламид, полученный с использованием биосовместимого сшивающего агента.

Предложенный гидрогель, оставаясь проницаемым для воды, ионов, кислорода и низкомолекулярных метаболитов и пригодным для инъекционного введения, обладает более регулярной и лучше связывающей воду структурой, что позволяет получать массивные высокоупругие и формоустойчивые имплантаты (например: интрамаммарные эндопротезы, опорные стержни в пещеристых телах пениса, тампоны в легочных кавернах), медленно ( в течение нескольких лет) прорастающие нежной хорошо васкуляризированной соединительной тканью. Вследствие указанных структурных, биохимических и анатомофизиологических преимуществ существенно возрастает и косметический и/или лечебный эффект эндопротезирования и тампонирования и стойкость такого эффекта во времени.

Первое дополнительное отличие состоит в том, что биосовместимый гидрогель содержит поперечно сшитый полиакриламид, полученный с использованием метилен-бис-акриламида в качестве сшивающего агента и смеси персульфата аммония и тетраметилэтилендиамина в качестве инициатора полимеризации. Метилен-бис-акриламид является аналогом основного мономера (акриламида) по составу и по биосовместимости, а использование указанной смеси инициаторов полимеризации создает благоприятные условия для довольно регулярной сшивки цепных макромолекул полиакриламида в упругую и допускающую инъекционное введение гидрогеля пространственную сетку.

Второе дополнительное отличие состоит в том, что биосовместимый гидрогель содержит 3,5-9,0 мас. указанного поперечно сшитого полиакриламида. В этом интервале концентраций достигается максимум лечебного или косметического эффекта при инъекционном эндопротезировании или тампонировании. При концентрации менее 3,5 мас. гидрогель неустойчив и может быть использован в качестве основы лечебных мазей или электропроводных иммперсионных сред для кардиоили энцефалографии, а при концентрации более 9,0 мас. он практически теряет текучесть и может быть использован в некоторых случаях для изготовления относительно жестких формоустойчивых предварительно отливаемых эндопротезов, для постановки которых требуется оперативный доступ к зоне протезирования.

Третье дополнительное отличие состоит в том, что биосовместимый гидрогель дополнительно содержит физиологически нейтральную водорастворимую соль, что позволяет наиболее эффективно использовать его в качестве электропроводной иммерсионной среды.

Четвертое дополнительное отличие состоит в том, что биосовместимый гидрогель в качестве физиологически нейтральной водорастворимой соли содержит общедоступный хлорид натрия.

Для получения предложенного биосовместимого гидрогеля были использованы реагенты, приведенные в табл.1.

За исключением бидистиллированной воды в экспериментах использовали реагенты фирмы "REANAL" (Венгрия).

Предложенный биосовместимый гидрогель в общем случае получают следующим способом.

В асептическом помещении в стерильный стеклянный сосуд вносят расчетные количества акриламида и разбавленных водных растворов сшивающего агента - метилен-бис-акриламида и инициаторов полимеризации: персульфата аммония и ТМЭД. Указанные реагенты тщательно перемешивают, разбавляют водой, или физиологическим раствором, или разбавленным водным раствором иной физиологический нейтральной соли (например ацетата натрия), фильтруют смесь и выдерживают фильтрат до получения гидрогеля поперечно сшитого полиакриламида (ПС ПАА).

В готовом гидрогеле ПС ПАА контролируют: внешний вид визуально (гидрогель должен быть прозрачным бесцветным без посторонних включений); показатель преломления, который должен находиться в пределах от 1,334 до 1,350; рН который должен быть в пределах 7,0-9,0; содержание тяжелых металлов, которое должно быть менее 0,001% по массе; стерильность.

Пример 1. Получение низкоконцентрированного биосовместимого гидрогеля. В стеклянном стакане емкостью 1 л смешивали 34,2 г акриламида, 60 мл 1%-ного водного раствора метил-бис-акриламида. 6 мл 1%-ного водного раствора ТМЭД и 25 мл 0,48%-ного водного раствора персульфата аммония. Смесь доводили водой до конечного объема 380 мл. фильтровали через стеклянный фильтр и фильтрат выдерживали не менее 20 мин до образования 9%-ного гидрогеля ПС ПАА.

Пример 2. Получение высококонцентрированного биосовместимого гидрогеля. В стеклянном стакане емкостью 1 л смешивали 34,2 г акриламида, 60 мл 1%-ного водного раствора метил-бис-акриламида, 6 мл 1%-ного водного раствора тетраметилэтилендиамина и 25 мл 0,48%-ного водного раствора персульфата аммония. Смесь доводили водой до конечного объема 380 мл, фильтровали через стеклянный фильтр и фильтрат выдерживали не менее 20 мин до образования 9%- ного гидрогеля ПС ПАА.

Пример 3. Получение среднеконцентрированного биосовместимого гидрогеля. В стеклянном стакане емкостью 1 л смешивали 24 г акриламида, 50 мл 1%-ного водного раствора метил-бис-акриламида, 25 мл 1%-ного водного раствора тетраметилэтилендиамина и 50 мл 1,3%-ного водного раствора персульфата аммония. Смесь доводили до конечного объема 350 мл, фильтровали через стеклянный фильтр и фильтрат выдерживали не менее 20 мин до образования 5%-ного гидрогеля ПС ПАА.

Пример 4. Получение низкоконцентрированного электропроводного биосовместимого гидрогеля. Гидрогель ПС ПАА получали, как в примере 1, с тем отличием, что вместо воды для разбавления использовали физиологический раствор.

Пример 5. Получение высококонцентрированного электропроводного биосовместимого гидрогеля. Гидрогель ПС ПАА получали, как в примере 2, с тем отличием, что вместо воды для разбавления использовали 0,3%-ный водный раствор ацетата натрия.

Примеры биосовместимых гидрогелей ПС ПАА приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, примеры составов БСГ 2, 3 и 4, 6, 7, 8 и 9 соответствуют предпочтительным значениям концентрации ПС ПАА в гидрогеле, причем примеры 2 и 4 соответствуют ее граничным предпочтительным значениям, а остальные указанные примеры характеризуют ее промежуточные, наиболее предпочтительные значения. Примеры составов БСГ 1 и 5 соответствуют таким значениям концентраций ПС ПАА в гидрогеле, которые могут быть использованы лишь в весьма ограниченных случаях.

Лабораторные исследования предложенного гидрогеля были проведены в химическом, биохимическом и медико-биологическом аспектах. Это разграничение не было строгим и основывалось преимущественно на используемых для анализа методах и средствах.

Так. согласно требованиям государственного стандарта СССР ГОСТ 15.013-86 "Медицинские изделия" по методике, изложенной в практическом руководстве "Методы анализа акрилатов и метакрилатов" (М. Химия, 1972 г.) были проведены исследования сухого остатка.

По сухому остатку обычно определяют точную концентрацию ПС ПАА в гидрогеле. Метод предусматривает взвешивание пробы гидрогеля и ее высушивание при температуре 35 С и остаточном давлении 12-15 мм рт.ст. до постоянной массы (примерно в течение 20 ч) с последующим вычислением процентной доли ПС ПАА в гидрогеле.

Этот метод был использован для оценки химической стабильности предложенного гидрогеля.

Для этого был приготовлен слабо сшитый гидрогель (с использованием 0,25% метилен-бис-акриламида от массы акриламида) с расчетной концентрацией ПС ПАА примерно 5% Четыре серии были обработаны следующим образом: в первой серии - взвешены и высушены, как было указано, до постоянной массы; во второй серии взвешены, залиты бидистиллированной водой, подвергнуты кипячению в течение 15 мин и затем высушены до постоянной массы; в третьей серии взвешены, залиты бидистиллированной водой до уровня 200 мл каждый, вымочены в течение 7 сут с ежесуточной сменой воды и высушены до постоянной массы; в четвертой серии взвешены, вымочены в течение 7 сут, как и образцы третьей серии, подвергнуты кипячению в течение 15 мин, как и образцы второй серии, и лишь затем высушены до постоянной массы.

Результаты представлены в табл. 3.

Как видно из полученных результатов, даже вымачивание с последующим кипячением не разрушает структуру ПС ПАА в гидрогеле, что свидетельствует о возможности его термической стерилизации, если в ней возникнет необходимость, и о стабильности даже слабо сшитого ПС ПАА.

Далее в соответствии с "Руководящими методическими материалами по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий для эндопротезирования" (МЗ СССР, 1987 г. с. 18-25) по устойчивости основы предложенного гидрогеля (ПС ПАА) в водной среде была оценена способность акриламида к миграции в биоткани.

Этот показатель определяли методом ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с детектированием поглощения ультрафиолетового излучения в характерном для указанного мономера диапазоне 195-210 нм на хроматографе "Liguochrom" (Венгрия).

Для этого замачиванием проб предложенного гидрогеля в течение 14 и 30 сут при 40^oС при соотношении 100 мл экстрагента (бидистиллированной воды) на 1 мг геля получали вытяжки (экстракты). Пробы для ВЭЖХ приготовляли, высушивая при остаточном давлении 12-15 мм рт.ст. и комнатной температуре аликвотные дозы экстракта объемом 5 мл, однократным элюируя остаток со скоростью 0,2 мл/мин двумя миллилитрами смеси вода-метанол в соотношении 1:1 в колонке длиной 150 и диаметром 4 мм с фазой Separon С18 и вводя элюат в петлю инжектора объемом 20 мкл.

Минимально детектируемая концентрация акриламида по методу ВЭЖХ составляет 0,000001 мг/л, а его ПДК (предельно допустимая концентрация) в водных вытяжках из материала для имплантатов равна 0,02 мг/л.

В водных вытяжках из полученных описанным способом гидрогелей акриламид методом ВЭЖХ не обнаруживается, что свидетельствует о высокой химической стабильности ПС ПАА и предложенного биосовместимого гидрогеля в целом.

В медико-биологическом аспекте образцы гидрогелей ПС ПАА, полученные описанным способом, были испытаны в лабораторных условиях на: биохимическую и гемолитическую активность; эмбриотоксическую активность; мутагенную активность; канцерогенную активность.

Биохимическую и гемолитическую активность гидрогелей ПС ПАА оценивали по изменениям химического состава плазмы и клеточных показателей крови у самцов белых крыс линии "Вистар" массой 300-350 г в опытной и контрольной группах по 16 особей в каждой.

В начале эксперимента наркотизированным крысам контрольной группы шприцом внутрибрюшинно ввели по 5 мл предложенного 5%-ного гидрогеля.

Крыс обеих групп содержали на обычном рационе.

Через две недели у крыс взяли кровь и с использованием биохимического анализатора фирмы "КОРНИНГ" (Швеция) определили в ней содержание: ионов Na, K, Ca и Cl; мочевины, азота мочевины и мочевой кислоты; креатинина и ферментов (амилазы, щелочной фосфатазы, аланин- и аспартатаминотрансфераз, обозначенных далее соответственно АлАТ и АсАТ, лактатдегидрогеназы ЛДГ и креатининфосфокиназы). При этом содержание калия и мочевины определяли по био-тесту "Lachema" (Чехия). Полученные результаты показаны в табл.4.

Как видно из табл. 4, основные показатели электролитного обмена свидетельствуют об отсутствии заметных повреждений клеточных мембран. АТФ-азная активность также в норме.

Стабильность показателей азотистого обмена свидетельствуют о нормальном метаболизме, включая пуриновый обмен, а совместно со стабильностью креатинина и о стабильности работы системы выделения в присутствии ПС ПАА в организме.

Нормальная активность АлАТ и АсАТ указывает на стабильность гепатоцитов и хорошее состояние сердечной мышцы, которая, судя по остающейся в норме активности креатининфосфокиназы, не испытывает заметных перегрузок.

Достаточная активность щелочной фосфатазы показывает, что в эндотели желчных проходов нет воспалительных процессов.

Кроме того, был проведен клеточный анализ крови тех же крыс, результаты которого приведены в табл. 5.

Как видно из табл. 5, уровень лейкоцитов в опыте несущественно превышает норму 4,5 1000 в 1 мм³, а данные о концентрации эритроцитов в крови и гемоглобина в эритроцитах свидетельствуют о нормальной насыщаемости крови кислородом. Относительно гематокрита также можно утверждать, что водно-солевой баланс близок к норме.

Косвенно все эти данные свидетельствуют о высокой биохимической стабильности ПС ПАА и о его высокой биосовместимости.

Эмбриотоксическую активность гидрогелей ПС ПАА определяли согласно "Руководящим методическим материалам по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств" (М. МЗ СССР, 1975, с.42-45) и "Руководящим методическим материалам по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий для эндопротезирования" (М. МЗ СССР, 1987).

В эксперименте использовали три группы самок белых беспородных крыс массой 180-200 г по 16 особей в каждой.

Крысам первой группы шприцом внутрибрюшинно вводили по 2 мл 5%-ного предложенного гидрогеля и через неделю их случали с самцами.

Крысам второй группы также внутрибрюшинно вводили по 2 мл 5%-ного предложенного гидрогеля на третьи сутки беременности.

Третью группу составляли беременные интактные крысы.

Две крысы первой группы не забеременели. 14 крыс первой и все 16 крыс из второй и третьей групп родили нормальных здоровых детенышей, что свидетельствует об отсутствии эмбриотоксичности предложенного гидрогеля.

Мутагенную активность гидрогелей ПС ПАА исследовали согласно методическим рекомендациям МЗ СССР "Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом" (М. 1984, с.14) на ретикулоцитах костного мозга обоеполых мышей линии С3Н1 двухмесячного возраста в двух группах из 10 особей каждая.

Мышам контрольной группы в количестве 0,01% от массы тела вводили 30-суточную водную вытяжку из 9%-ного гидрогеля ПС ПАА, приготовленную при температуре 40^oС при соотношении 100 мл экстрагента на 1 г геля.

Через 24 ч подопытных и интактных мышей забивали смещением спинного мозга и известным образом из бедренных костей на сыворотке свежей неконсервированной человеческой крови группы АВ (lV) получали мазки костного мозга, которые окрашивали по Паппенгейму.

В мазках под микроскопом подсчитывали количество ретикулоцитов с микроядрами. Было установлено, что различие в количестве таких ретикулоцитов между мазками костного мозга подопытных и интактных мышей при подсчете в 20 полях зрения по 1000 клеток в каждом не превышал 2,3% что свидетельствует об отсутствии мутагенного действия гидрогеля ПС ПАА.

Канцерогенную активность гидрогелей ПС ПАА оценивали методом иммунодетекции органоспецифических опухолеассоциированных антигенов.

Указанный метод (в использованном варианте) основан на определении электрофоретической подвижности (ЭФП) стабилизированных и таннинизированных эритроцитов, которые сенсибилизированы опухолеассоциированному антигену рабдомиосаркомы и дополнительно к неспецифическому эмбриональному антигену, служащему при положительной реакции индикатором прогрессирующего роста опухолей. В общем случае ЭФП-тесты считаются положительными, если электрофоретическая подвижность индикаторных клеток снижается на 20% и более.

Эксперименты были проведены на 12 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 г, разделенных на опытную и контрольную группы по 6 особей в каждой.

Крысам опытной группы под местной анестезией в бедренную мышцу ввели по 4 мл 6% -ного гидрогеля ПС ПАА. После этого крыс обеих групп содержали на обычном для вивариев корме 18 мес. Затем у всех животных из хвостовой вены взяли пробы крови, выделили из проб эритроциты, сенсибилизировали их указанными антигенами и провели ЭФПтесты.

Замедление ЭФП сенсибилизированных эритроцитов в сравнении с несенсибилизированными составило: у крыс опытной группы 4,171,58% для антигена рабдомиосаркомы и 1,670,95 для неспецифического эмбрионального антигена, а у крыс контрольной группы 1,50,62 для антигена рабдомиосаркомы и 1,831,28 для неспецифического эмбрионального антигена.

Таким образом, ЭФП-тест оказался отрицательным для крыс обеих групп, что позволяет сделать вывод об отсутствии канцерогенной активности у предложенного гидрогеля ПС ПАА.

Наиболее детальные медико-биологические исследования применимости предложенного биосовместимого гидрогеля ПС ПАА в медицине для нужд эндопротезировали и тампонирования были проведены на беспородных трех-четырехлетних кобелях массой от 25 до 30 кг, на которых в стерильных условиях под местной анестезией после обработки кожного чехла пениса 10% настойкой йода моделировали эндопротезирование, в том числе: на 6 собаках - подкожно однократным введением 5 мл 3,5%-ного гидрогеля ПС ПАА; также на 6 собаках эндофасциально, исключая проникновение под белочную оболочку, введением 9%-ного гидрогеля ПС ПАА в три сегмента на каждой стороне вдоль пениса в количестве до 1,5 мл на сегмент с суммарной дозой 8,0 мл и еще на 6 собаках интракавернозно с проникновением под белочную оболочку преимущественно в трабекулы пещеристых тел и исключая повреждение мочеиспускательного канала введением 6%-ного гидрогеля ПС ПАА также в три сегмента на каждой стороне вдоль пениса в количестве до 1,5 мл на сегмент с суммарной дозой 8,0 мл.

Четвертая группа из трех собак служила контролем.

Собак поодиночке умерщвляли внутривенным введением нембутала: в опытных группах через 1, 7 и 14 сут и 1, 3 и 6 мес после операции; в контрольной группе через 1, 3 и 6 мес.

Вырезанные кусочки полных поперечных срезов пениса, регионарных лимфатических узлов и легких собак вместе с контрольными срезами фиксировали в 10% -ном и 6%-ном нейтральном формалине и жидкости Карнуа, обезвоживали в спиртах восходящей крепости и заливали в парафин.

Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пирофуксином по ван Гизон, на эластику по Вейгерту и толуидиновым синим при различных рН раствора красителя с химическим и ферментативным контролем для выявления гликозаминогликанов.

Гликопротеины и гликоген выявляли РАS-реакцией по Мак-Манусу, соли кальция по методу фон Коса, РНК по Браше (контроль с рибонуклеазой).

Исследовали активность ферментов: сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу; лактатдегидрогеназы (ЛДГ); глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), НАД- и НАДФ-диафораз соответственно по Гесс, Скарпелли и Пирсу; щелочной фосфатазы (ЩФ) по Гомори и аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) по Вахштейну-Майзелю.

Исследования показали следующее.

При подкожном введении гидрогеля ПС ПАА: через 1 сут в месте инъекции видно муфтообразное утолщение мягко-эластичной консистенции с некоторым истончением кожи (при этом у одной из собак окружающие имплантат ткани были слегка отечны и гиперемированы с небольшим рассосавшимся на седьмые сутки очаговым кровоизлиянием, которое можно рассматривать как манипуляционную травму).

Через 7 сут видимые гемодинамические, альтеративные и воспалительные реакции отсутствовали. При гистологическом исследовании имплантат имел вид крупной бледноголубой вакуоли, которая окружена тонкой соединительнотканной капсулой, отделяющей гидрогель ПС ПАА от фасции пениса и дермы. Капсула состояла из расположенных в один-два слоя юных фибробластов, вокруг которых видны нежные коллагеновые и эластические волокна. Для цитоплазмы фибробластов характерны пиронинофилия и повышенная активность окислительновосстановительных ферментов (СДГ, МДГ, НАД- и НАДФ-диафораз, ЛДГ) и ЩФ. Рост активности Г-6-ФДГ свидетельствовал об активации пентозного пути метаболизма. В приповерхностном слое гидрогеля наблюдалась негустая лейкоцитарная и макрофагальная инфильтрация. Грануляционная ткань по периферии капсулы состояла из умеренного количества новообразованных выстланных набухшими эпителиальными клетками сосудов, просветы которых были иногда расширены и заполнены форменными элементами крови. В адвентиции сосудов выявлялись пролиферирующие фибробласты, гистиоциты и единичные плазматические клетки. Гигантоклеточная реакция отсутствовала во всех случаях. Очаги метахромазии при окрашивании толуидиновым синим не были выявлены при всех значениях рН использованных растворов. В небольшой части нервных волокон при импрегнировании нитратом серебра были выявлены разнообразные изменения: местное набухание осевых цилиндров, их разволокнение, вакуолизация, варикозные расширения, гипо- или гиперимпрегнация. Иногда были отмечены наплывы оксоплазмы по ходу или на концах нервных волокон, частичные нарушения гладкости миелиновой оболочки и ее распада на короткие и длинные фрагменты. Указанные изменения характерны для компенсаторно-приспособительной перестройки нервных волокон в ответ на сдавление вакуолью гидрогеля ПС ПАА.

Через 14 сут макрофагально-лейкоцитарная реакция вокруг геля незначительно усиливалась, отмечалась хорошо выраженная фибропластическая реакция с формированием вокруг вакуоли соединительнотканной капсулы, которая на некоторых участках была представлена хаотично расположенными коллагеновыми и эластическими волокнами с молодыми фибробластами и новообразованными капиллярами в промежутках, а на других участках более зрелой соединительной тканью из нескольких рядов параллельных коллагеновых и эластических волокон и пролиферирующих фибробластов. В цитоплазме и ядрышках увеличено содержание РНК, активность окислительновосстановительных и гидролитических ферментов повышена. Цитоплазма фибробластов богата метахроматическими гранулами, хорошо выявляемыми толуидиновым синим при рН 2,8, что характерно при усилении синтеза гликозаминогликанов. В окружающей капсулу ткани количество новообразованных сосудов было резко уменьшено, а на их месте преобладали клетки гистиогенного типа, продуцирующие гликозаминогликаны и коллаген. Гигантские клетки встречались чрезвычайно редко. Изменения нервных волокон аналогичны описанным выше.

Через 1 мес после введения вокруг вакуоли гидрогеля ПС ПАА формировалась зрелая соединительнотканная капсула из циркулярно расположенных коллагеновых и эластических волокон со зрелыми фибробластами в промежутках, содержащими умеренное количество РНК и высокосульфатированных выявляемых толуидиновым синим при рН 2,8 гликозаминогликанов. Активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов в цитоплазме фиброцитов в норме. На поверхности гидрогеля иногда наблюдалась клеточная реакция в виде негустой диффузной инфильтрации макрофагами и плазматическими клетками. Структура тканей, окружающих имплантат, была полностью нормализована и ничем не отличалась от структуры аналогичной ткани интактного животного. Реактивные изменения чувствительных нервных волокон начинали уменьшаться и проявляться в основном неравномерными расширениями или истончениями осевых цилиндров и их очаговой гипо- или гиперимпрегнацией.

Через 3 мес отмечалось некоторое сгущение гидрогеля ПС ПАА с повышением базофильности и хорошее отграничение имплантата от прилегающих тканей соединительнотканной капсулой из коллагеновых и эластических волокон и клеток типа фиброцитов. Структурные и гистохимические изменения в прилегающих тканях отсутствовали, а нервные волокна приобретали нормальные формы.

Через 6 мес форма и размеры имплантата оставались практически теми же, что и в первые сутки после введения гидрогеля ПС ПАА. Гистологически имплантат имел вид цельной хорошо инкапсулированной темноголубой вакуоли. Капсула состояла из одного-двух рядов фиброцитов и упорядоченно расположенных коллагеновых и эластических волокон, соли кальция в которых по фон Косу не выявлены. В окружающих имплантат тканях не обнаружены какие-либо р