Рекомбинантная плазмидная днк psv-dep-poly-neo, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка сно-ре - продуцент эритропоэтина человека

Рекомбинантная плазмидная днк psv-dep-poly-neo, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка сно-ре - продуцент эритропоэтина человека

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к генной и клеточной инженерии, представляет интерес для получения рекомбинантного эритропоэтина (ЭП) человека, который может быть использован в медицинских и исследовательских целях. Сущность изобретения: путем клонирования Hind III - Bgl II фрагмента геномной человеческой ДНК, включающего полноразмерный ген эритропоэтина, в составе плазмиды pSV2gpt, удаления нетранслируемой 5'-фланкирующей области гена, добавления сигнала сплайсинга и сайта полиаденилирования ранних генов обезьяньего вируса SV40, а также слияния с ДНК pSV2neo получена рекомбинатная плазмида pSV-dEp-poly-NeO, обеспечивающая синтез в животных клетках рекомбинантного эритропоэтина человека. Путем контрансфекции плазмидами pSV-dEp-poly-NeO и pTKI (кодирует активную тимидин киназу вируса простого герпеса) культивируемых клеток китайского хомячка CHOtk-, проведения селекции трансфектантов в среде, содержащей антибиотик G 418, и последующей амплификации интегрированных последовательностей в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), получен штамм-продуцент СНО-РЕ, обеспечивающий синтез и секрецию в культуральную жидкость рекомбинантного эритропоэтина человека с выходом до 4 мг/л при стационарном культивировании. Полученный рекомбинантный гормон может быть использован в медицинских и исследовательских целях. 2 с.п. ф-лы, 5 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к генной и клеточной инженерии, представляет интерес для получения рекомбинантного эритропоэтина (ЭП) человека, который может быть использован в медицинских и исследовательских целях.

В литературе описано несколько работ по экспрессии гена ЭП в животных клетках и по созданию штаммов-продуцентов рекомбинантного ЭП на основе клеток грызунов и приматов. Однако продуценты на основе линии клеток CHO (клетки яичника китайского хомячка) созданы лишь двумя группами исследователей. Авторы работ [1, 2] сконструировали плазмиду pDSVL-gHuEPO, содержащую полноразмерный ген ЭП человека под контролем промотора поздних генов вируса SV40, а также миниген дигидрофолат редуктазы (DHFR) мыши. После трансфекции экспрессирующим вектором pDSVL-gHuEPO клеток линии CHOdhfr- [3] и селекции в среде без нуклеозидов авторы получили клеточный клон, секретирующий рекомбинантный ЭП в культуральную жидкость c выходом 18,2 единицы активности (ед. акт. ) на мл. Путем проведения нескольких раундов амплификации в присутствии возрастающих концентраций метотрексата был получен штамм-продуцент, стабильно секретирующий ЭП с выходом до 100 ед.акт./мл.

Авторы патента [4] для получения продуцента ЭП cконструировали плазмиду pRKEL13, содержащую кДНК гена ЭП под контролем основного позднего промотора аденовируса, сайт полиаденилирования, энхансер и участок инициации репликации вируса SV40, вирус-ассоциированный ген аденовируса, а также ген DHFR под контролем раннего промотора SV40. Путем трансфекции плазмидой pRKFL13 клеток CHOdhfr- [3] последующей селекцией трансфектантов в среде без нуклеотидов, а также проведения трех раундов амплификации в среде с метотрексатом, авторам удалось получить штамм-продуцент ЭП, секретирующий гормон с выходом до 50 ед/мл.

К недостаткам описанных аналогов следует отнести невысокие уровни секреции рекомбинантного ЭП клетками-продуцентами, что значительно усложняет процедуры выделения и очистки гормона и делает продукт более дорогим.

В качестве прототипа выбраны плазмидная ДНК pSVEpoI и штамм культивируемых клеток китайского хомячка BCKK(П) N16D2 продуцент ЭП человека, описанные в работе [5] Плазмида pSVEpoI получена путем клонирования HidIII BglII ДНК-фрагмента, длиной 3 тысячи нуклеотидных пар (т.н.п.), содержащего полный ген ЭП человека в составе вектора pSV2gpt [6, 7] по сайтам рестрикции HindIII и BamHI. Путем трансфекции рекомбинантной плазмидой pSVEpol клеток яичника китайского хомячка CHOtk- и последующей селекции трансфектантов в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), авторами отобран клон клеток CHO Epol, клетки которого стабильно продуцируют ЭП в культуральную среду с выходом до 10 12 ед.акт./мл.

Недостатком штамма-продуцента, выбранного в качестве прототипа, является низкая продуктивность, что делает проблематичным его использование при крупномасштабном получении рекомбинантного ЭП человека. Недостатком рекомбинантной плазмиды-прототипа pSVpol является наличие протяженной 5'-фланкирующей области гена ЭП, которая отделяет промотор ранних генов обезьяньего вируса SV40 от первого экзона ЭП-гена [1] а также отсутствие в составе плазмиды эффективного сигнала сплайсинга и сайта полиаденилирования вслед за ЭП геном. Неоптимальное строение использованной генетической конструкции, по-видимому, и определяет низкий уровень продукции рекомбинантного ЭП в клетках-продуцентах.

Цель изобретения упрощение и удешевление процессов получения рекомбинантного эритропоэтина человека за счет повышения уровня биологического синтеза эритропоэтина клетками-продуцентами. Цель достигается конструированием рекомбинантной плазмиды pSV-dEp-poly-Neo, в которой промотор ранних генов вируса SV40 приближен к структурной части полноразмерного гена ЭП человека, и в которой сразу за ЭП геном находится сигнал сплайсинга и сайт полиаденилирования ранней области вируса SV40. Такое сочетание регуляторных элементов определяет высокий уровень экспреcсии гена ЭП и эффективность синтеза рекомбинантного гормона в животных клетках. Цель достигается также за счет наличия в составе плазмиды pSV-dEp-poly-Neo активного гена аминогликозид-3'-фосфотрансферазы (neo), позволяющего проводить отбор трансфектантов в среде, содержащей антибиотик генетицин (G481). Цель достигается также одновременным использованием для трансфекции клеток линии CHOtk- плазмид pSV-dEp-poly-Neo и pTK1, первая из которых содержит ген ЭП и ген устойчивости к G418 (neo), а вторая активный ген тимидинкиназы вируса простого геpпеса [8] Использование для котрансфекции ДНК pTK1 позволяет проводить амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки, в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов CHO-PE, содержащих в своем геноме интегрированные копии гена ЭП и стабильно секретирующих рекомбинантный гормон в культуральную жидкость.

Штамм-продуцент CHO-PE отличается от исходного штамма СHOtk- тем, что содержит интегрированные в геном копии плазмиды pSV-dEp-poly-Neo.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками: 1. Морфологические признаки.

Культура представлена эпителиоподобными и веретеновидными клетками с крупными ядрами неправильной формы, содержащими от одного до трех ядрышек. Цитоплазма зернистая, вакуолизированная.

2. Культуральные признаки.

Штамм COH-PE поддерживается на смеси отечественных сред Игла МЕМ (45%) и 199 (45%) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС), содержащей гипоксантин в концентрации 100 мкМ, аминоптерин 20 мкМ, и тимидин 100 мкМ (ГАТ). Клетки субстратзависимы, склонны к неравномерному росту, образуют многослойные островки. Отделение клеток от стекла или пластика проводят смесью 0,02% версена (2/3) и 0,25% трипсина (1/3), кратность рассева 1:4, посевная доза 100 тыс. клеток в 1 мл. Плотного монослоя культура достигает через 3 суток после посева.

3. Устойчивость к антибиотикам.

Штамм проявляет устойчивость к генетицину (G418) в концентрации до 1 мг/мл, обусловленную наличием интегрированных в геном последовательностей ДНК.

4. Криоконсервация.

Криоконсервирование проводят на среде Игла МЕМ (40%), 199 (40%) с добавлением 10% КРС. ГАТ и 10% глицерина в качестве криопротектора. Концентрация клеток 1 2 млн. в 1 мл. Жизнеспособными после восстановления остаются 95% клеток.

5. Кариологическая характеристика.

Кариологический анализ штамма CHO-PE проводят на 10 и 20 пассажах. Модальный класс клеточной линии определен подсчетом числа хромосом в 100 метафазных пластинках. Распределение клеток по числу хромосом следующее: 28 хромосом 4 клетки, 29 хромосом 6 клеток, 30 хромосом 12 клеток, 31 хромосома 18 клеток, 32 хромосомы 17 клеток, 33 хромосомы 38 клеток, 34 хромосомы 3 клетки, 36 хромосом 1 клетка, 42 хромосомы 1 клетка. Модальный класс 33 хромосомы, 2n=22.

6. Контроль видовой идентичности.

Соответствие виду подтверждается с помощью анализа электрофоретической подвижности изоферментов глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в полиакриламидном геле (ПААГ). Клетки имеют изоферментный набор, характерный для клеток китайского хомячка.

7. Контаминация.

При обследовании клеток штамма на стерильность (наличие бактерий, грибов, и микоплазмы) получают отрицательные результаты на уровнях 10 и 20 пассажей.

Предложенная рекомбинантная плазмида pSV-dEp-poly-Neo и штамм культивируемых клеток китайского хомячка СHO-PE в советской и зарубежной литературе не описаны, следовательно они обладают существенными отличиями.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК/П/626Д.

На фиг. 1. дано графическое изображение фрагмента геномной ДНК человека, содержащего ген ЭП.

a структурная организация гена. Прямоугольникам I-V обозначены экзоны, темными блоками кодирующие области.

б рестрикционная карта гена. Отмечены сайты узнавания рестриктаз: BgIII (B), BstEII (E), HindIII (H), KpnI (K), SmaI (S), XbaI (X). Цифрами обозначены размеры в т.н.п.

На фиг. 2-4 схема конструирования плазмидной ДНК pSV-dEp-poly-Neo, а также генетическая карта плазмиды pSV-dEp-poly-Neo.

Светлыми блоками обозначены ДНК-последовательности вируса SV40, темными блоками районы гена ксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы E.coli(gpt), штриховкой ген ЭП, двойной штриховкой ген neo, тонкой линией - ДНК-фрагменты плазмиды pBR322.

Отмечены бактериальный ген бета-лактамазы (Amp^r), сайты инициации репликации (ori) pBR322 и вируса SV40, промотор ранних генов вируса SV40 (SV_E). Стрелками указаны направления транскрипции генов.

На фиг. 5 электрофоретический анализ препарата рекомбинантного эритропоэтина человека в 13%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в восстанавливающих условиях (окраски кумасси).

1 3 белковые маркеры молекулярных весов; 4 препарат эритропоэтина.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pSVdEp-poly-Neo.

В качестве источника генетических последовательностей, кодирующих ЭП человека, используют плазмиду pBR-Epo, которая содержит EcoRI-фрагмент геномной ДНК человека длиной 12 13 т.н.п. [9] Клетки бактерий Escherichia coli (E. coli) штамма HB101, трансформированные плазмидой pBR-Epo и клетки бактерий E. coli HB101, трансформированные плазмидой pSV2gpt [6] выращивают в одном литре среды LB [10] с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4^oC и выделяют из них плазмидные ДНК как описано в работе [11] Полученные препараты ДНК плазмид pBR-Epo и pSV2gpt используют для конструирования плазмиды pSV-Ep-gpt (схема на фиг. 2-4), которое проводят следующим образом. Осуществляют гидролиз 60 мкг ДНК pBR-Epo эндонуклеазами рестрикции HindIII и BglII в буфере, содержащем 0,01 М Трис-HСl; pH 8; 0,01 M MgCl₂, 0,05 M NaCl, 1мM -- меркаптоэтанол. Аналогичным образом проводят гидролиз 20 мкг ДНК pSV2gpt. Гидролизаты плазмид подвергают электрофорезу в 1% -ном агарозном геле в трис-боратном буфере, гель прокрашивают бромистым этидием и под длинноволновым ультрафиолетовым облучением (УФО) вырезают полосу, соответствующую линейной ДНК, для HindIII-BglII гидролизата pSV2gpt и полосу, соответствующую фрагменту 2961 н.п. для HindIII-BglII гидролизата pBR-EPO. Фрагменты ДНК выделяют из кусочков геля электроэлюцией на бумажные диски DE-81 (Whatman, СШA) в 0,01 М трис-боратном буфере, рН 8,3, при 350 В в течение 2 3 ч, ДНК с дисков смывают 1,5 M NaCl, 0,01 М трис-HCl, pH7,5,1 мМ ЭДТА (4 х 20 мкл) в течение 40 сек при 56^oC, осаждают этанолом. Осадки промывают спиртом, высушивают, растворяют в 10 мкл воды. Выделенный HindIII-BglII фрагмент длиной 2961 н.п. (1 пмоль) смешивают с 0,2 пмоль линейной векторной ДНК pSVgpt в 30 мкл раствора, содержащего 66 мМ Трис-HCl, pH 7,5 5 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотреит (ДТТ), 1 мМ АТФ, 14 ед. акт. ДНК-лигазы фага Т4. Реакцию проводят при 8^o C в течение 20 ч. Аликвоты лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli HB101, как описано в работе [12] Трансформированные клетки высевают на чашки с твердым агаром, содержащем ампициллин (50 мкг/мл), и растят 18 ч при 37^oC. Выросшие колонии скалывают в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин (5 мкг/мл), инкубируют при 37^oC и интенсивном встряхивании в течение 18 ч. Клетки отделяют центрифугированием, из них выделяют плазмидную ДНК для последующего рестрикционного анализа. Плазмида, дающая при совместном гидролизе рестриктазами HindIII и BglII фрагмент величиной 3 т.н.п. получила название pSV-Ep-gpt (фиг. 2).

Путем гидролиза ДНК pSV-Ep-gpt рестриктазами HindIII и BstEII, достройки образующихся 5'-выступающих концов с помощью большого фрагмента (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I E.coli в условиях [13] и последующего лигирования получают плазмиду pSV-dEp-gpt, несущую делецию 5'-фланкирующей области гена эритропоэтина (584 н.п.). Для удаления из состава плазмиды pSV-dEp-gpt гена ксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы E.coli (gpt) осуществляют BglII-гидролиз ДНК pSV-dEp-gpt, 5'-выступающие концы достраивают до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli, проводят рестрикцию BamHI. Фрагменты рестрикции разделяют электрофорезом в 4%-ном ПААГ в трис-боратном буфере, большой фрагмент (векторную ДНК) элюируют, как описано выше. Путем гидролиза ДНК pSV2gpt рестриктазой Bsp120I, достройки 5'-выступающих концов, последующей рестрикцией BamHI, электрофорезом в 4%-ном ПААГ и электроэлюцией выделяют фрагмент длиной 850 н.п. содержащий сигнал сплайсинга и сайт полиаденилирования ранней области вируса SV40. Путем клонирования выделенного фрагмента 850 н.п. в составе векторной ДНК pSV-dEp-gpt, обработанной BglII, фрагментом Кленова и BamHI, получают плазмиду pSV-dEp-poly.

Для получения плазмиды pSV-dEp-poly-Neo ДНК pSV-dEp-poly гидролизуют рестриктазой EcoRI и лигируют с EcoRI-линеаризованной ДНК pSV2neo, несущей ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы (neo) под контролем промотора ранних генов SV40 [14] Ориентацию гена neo в составе ДНК pSV-dEp-poly-Neo определяют гидролизом плазмиды рестриктазой BamHI.

Пример 2. Транзиентная экспрессия гена эритропоэтина в клетках почки обезьяны.

Для оценки качества генетической конструкции pSV-dEp-poly-Neo проводят анализ транзиентной экспрессии гена эритропоэтина человека в клетках обезьяны линии COS-7 [15] Клетки пассируют в среде Игла МЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Для трансфекции 5 мл клеточной суспензии (1 млн клеток) засевают в культуральные флаконы площадью 25 кв. см и через 16 20 ч среду заменяют на 5 мл свежей ростовой среды. Через 3 ч к клеткам добавляют плазмидную ДНК в виде кальций-фосфатного преципитата. Преципитат готовят следующим образом: при комнатной температуре во флакон А вносят 5 мкг ДНК плазмиды pSV-dEp-poly-Neo, 31 мкл 2 М CaCl₂ и воды до 0,25 мл. Во флакон 8 вносят 0,5 мл буфера НВ (0,3 М NaCl, 50 мM Hepes, 2,8мM Na₂HPO4, pH 7,1). Содержимое флакона А по каплям добавляют к содержимому флакона В, что приводит к образованию полупрозрачного преципитата, 0,5 мл преципитата наносят к образованию полупрозрачного преципитата, 0,5 мл преципитата наносят на монослой клеток СOS-7 и инкубируют при 37^oC в течение 16 ч. Клетки отмывают 5 мл среды Игла MEM и заливают свежей ростовой средой. Через 48 ч культуральную жидкость сливают и анализируют на наличие ЭП-активности.

Наличие эритропоэтина в культуральной жидкости определяют по включению in vitro тритий-меченого тимидина в растущие спленоциты мышей с фенилгидразиновой анемией [16] Анализ проводят следующим образом. Мышам линии С3Н/He весом 20 30 г вводят раствор фенилгидразина из расчета 60 мг на кг веса двухкратно через сутки. На третий день после последней инъекции стерильно извлекают селезенки и готовят суспензию спленоцитов с концентрацией 4 млн клеток на мл в среде RPMI 1640, содержащей 20% ЭТС. По 50 мкл клеточной суспензии вносят в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, добавляют равный объем разведений тестируемого материала в ростовой среде. В качестве положительного контроля используют разведения стандартного образца ЭП с активностью 250 ед. акт. /мл производства Boehringer Mannheim (Австрия). В качестве отрицательного контроля служит среда культивирования. Планшет инкубируют в течение 22 ч при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Далее в каждую лунку вносят по 1 мкКи [³H]-тимидина в 20 мкл среды RPMI 1640. Инкубацию продолжают в тех же условиях в течение 2-х ч. Содержимое лунок переносят на стекловолоконные фильтры GF/C (Whatman, США) с помощью харвестера Titertek (Flow. США), промывают несколько раз водой. Фильтры высушивают на воздухе и просчитывают в толуольном сцинтилляторе на счетчике радиоактивности MarkIII (Beckman, США). Биологическую активность тестируемых проб оценивают путем сравнения с калибровочной кривой ЭП-стандарта. По данным 5-ти независимых экспериментов уровень секреции рекомбинантного ЭП в культуральную жидкость после трансфекции COS-клеток плазмидной pSV-dEp-poly-Neo составляет 2,60,6 ед.акт./мл.

Пример 3. Получение штамма-продуцента CHO-PE.

Для получения стабильного продуцента рекомбинантного ЭП человека проводят трансфекцию плазмидной pSV-dEp-poly-Neo клеток яичника китайского хомячка CHOtk-. Клетки CHOtk- культивируют в среде Игла (45%), 199 (45%), ЭТС (10%). Для трансфекции используют смесь ДНК pSV-dEp-poly-Neo (15 мкг) и pTK1 [8] (5 мкг). Трансфекцию проводят стандартным методом кальций-фосфатной преципитации, как описано в примере 2. Через 16 ч после трансфекции клетки отмывают и помещают в ростовую среду на 48 ч. Далее среду меняют на селективную, содержащую 0,5 мг/мл антибиотик G418 (генетицин). Клетки инкубируют в селективной среде в течение 2-х недель, смену среды проводят каждые трое суток. Через 14 дней после помещения в селективные условия формируются колонии, устойчивые к G418. Устойчивые клоны подращивают до достижения клетками монослоя и проводят вторую стадию селекции. Для этого ростовую среду меняют на селективную, содержащую Игла (45%), 199 (45%), ЭТС (10%), 100 мкМ гипоксантин, 20 мкМ аминоптерин и 100 мкМ тимидин (ГАТ). Устойчивые к ГАТ клоны отдельно культивируют в ростовой среде, секретируемый клетками эритропоэтин тестируют методом включения тритий-меченого тимидина в спленоциты анемических мышей, как описано в примере 2.

Таким образом, отбирают клон CHO-PE, клетки которого стабильно продуцируют эритропоэтин в культуральную жидкость с выходом до 400 ед.акт. (4 мкг) на мл среды при стационарном культивировании. Методом дот-блот гибридизации показывают, что плазмида pSV-dEp-poly-Neo интегрирована в геном этих клеток.

Пример 4. Выделение и характеризация рекомбинантного эритропоэтина.

Культуральную жидкость после выращивания клеток-продуцентов CHO-PE в объеме 3000 мл фильтруют через бумажный фильтр, проводят последовательно концентрирование до объема 50 60 мл и диафильтрацию против 500 600 мл раствора 15 мМ трис-HCl, рН 7,0, содержащего 0,2 мМ сульфат меди и 0,02% твин-20 (буфер А) с использованием разделительного ультрафильтрационного аппарата на полых волокнах АР-0,2н производства ОКБ ТБМ г. Кириши. Полученный концентрат культуральной жидкости наносят на колонку с 50 мл ДЕАЕ-Сефарозы, уравновешенной буфером B (15 мМ трис-HСl pH 7,0, 0,02% твин-20). Колонку промывают последовательно 50 мл буфера A: 150 мл раствора 6 М мочевины, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,5: 100 мл раствора 25 мМ NaCl в буфере B: 100 мл раствора 80 мМ NaCl в буфере B: 100 мл раствора 160 мМ NaCl в буфере В со скоростью 4 мл/мин. Фракции элюата собирают по оптической плотности, определяемой при длине волны 254 нм с помощью проточного УФ-денситометра и определяют их активность методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием ЭП-специфической поликлональной кроличьей антисыворотки и конъюгата антивидовых антител (коза-антикролик) с пероксидазой хрена. Фракции, обладающие активностью в ИФА, объединяют и наносят на колонку 8 х 150 мм с обращеннофазовым широкопористым (диаметр пор 30 нм) сорбентом, содержащим бутильные группы, уравновешенную 5%-ным раствором ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Элюцию белков с колонки проводят линейным градиентом 5 90% ацетонитрила в течение 60 мин со скоростью 5 мл/мин. Фракции собирают, анализируют на наличие ЭП-активности, как описано выше, объединяют и концентрируют в три раза упариванием на ротационном иcпарителе Buchi (Швейцария). Полученный образец рехроматографируют на приведенной выше колонке с обращеннофазовым сорбентом. Фракции, элюирующиеся с колонки в 48 55%-ном ацетонитриле и обладающие ЭП-активностью, объединяют, упаривают на ротационном испарителе при 30^oC, растворяют в 0,02 М цитрате натрия, рН 6,9, содержащем 0,1 М NaCl.

Полученные образцы рекомбинантного эритропоэтина характеризуются следующими показателями: 1. Чистота и гомогенностью.

гомогенность препарат не менее 90 95% (по данным гельэлектрофореза в 13% -ном полиакриламидном геле с денситометрией); отношение ОП₂₈₀/ОП₂₆₀=1,05; содержание агрегированной формы до 4,5% (по данным иммуноблоттинга и денситометрии электрофореграмм, окрашенных серебром); содержание примесей ДНК клеток-продуцентов не более 10 пг на 10000 ед. активности (по данным дот-блот гибридизации с использованием меченной радиоактивным фосфором суммарной ДНК клеток CHO-PE).

2. Идентичность.

молекулярная масса 37500 Да (по данным гельэлектрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов); удельная активность 150000 ед/мг (10000 ед/мл) (определена методом твердофазного ИФА); специфическая активность in vitro 200000 ед/мг (определена по включению [³H] -тимидина в растущие спленоциты мышей с фенилгидразиновой анемией по [16]); специфическая активность in vivo не менее 100000 ед/мг (определена путем подсчета числа ретикулоцитов в образцах крови мышей после введения им образцов ЭП по [17]); аминокислотный состав соответствует расчетным данным (определен после гидролиза 6 н HCl, 110^oC, 24 ч); N-концевая последовательность A-P-P-R-L-I-C-D-S-R в 10 аминокислот соответствует литературным данным (определена методом Эдмана на автоматическом газофазном секвенаторе с идентификацией ФТГ-аминокислот методом ВЭЖХ).

Полученный и охарактеризованный штамм-продуцент CHO-PЕ планируется использовать для промышленного получения рекомбинантного эритропоэтина человека.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSV-dEp-poly-NeO, кодирующая эритропоэтин человека, размером 12328 нуклеотидных пар и мол. м. 8 Мд, содержащая: EcoRI HindIII фрагмент плазмидной ДНК pSV2gpt размером 2624 н.п. BstE II BglII фрагмент плазмидной ДНК pBR EpO размером 2387 н.п. Bsp 1201 EcoRI фрагмент плазмидной ДНК pSV2 gpt размером 1604 н.п. EcoRI EcoRI фрагмент плазмидной ДНК pSV2neo размером 5713 н.п.

уникальные сайты рестрикции HindIII, KpnI, XbaI, гены и генетические маркеры: ген bla, обеспечивающий синтез бета-лактамазы; ген neo, обеспечивающий синтез аминогликозид-3'-фосфотрансферазы; ген эритропоэтина, обеспечивающий синтез рекомбинантного эритропоэтина человека.

2. Штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНО-РЕ ВСКК(П)626Д продуцент эритропоэтина человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5