Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста

Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста

Реферат

 

Использование: биотехнология, ветеринария, животноводство. Сущность изобретения: получают последовательность к ДНК гена свиного гормона роста с N-концевым аланином (сГР/А), встраивают ее в плазмиду, пригодную для экспрессии в E. coli непосредственно за кодоном метионина, предназначенным для инициации трансляции, трансформируют полученной рекомбинантной плазмидой штамм E. coli, отбирают трансформированные клетки, культивируют их в подходящей питательной среде до накопления целевого продукта, а экспрессированный полипептид, не содержащий на N-конце дополнительного остатка метионина, подвергают выделению и очистке. 4 табл., 10 ил.

Изобретение направлено на способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста, включающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидой штамма E. coli, отбор и культивирование трансформантов в питательной среде, выделение и очистку полученного полипептида.

Экспрессия генов эукаристами и прокариотами, хотя и использует одни и те же основные стадии транскрипции генов в информационную РНК (mРНК) и последующей трансляции этой mРНК в протеины, использует при этом различные совокупности внутриклеточных регуляторов для этих стадий.

Кроме того, у эукаристов многие зрелые протеины сначала транслируются как препротеины, то есть, как полипептиды, содержащие последовательность зрелого протеина, слившуюся с главной или сигнальной последовательностью. Эукаристная mРНК кодирует полный предпротеин, который обрабатывается после трансляции с тем, чтобы удалить главную последовательность и получить зрелый протеин. Несмотря на то, что эукариотные клетки снабжены всем необходимым для того, чтобы специальной обработкой превратить такие предпротеины в зрелые протеины, прокариотные клетки в общем случае не способны распознавать сигналы обработки, содержащиеся в эукариотных протеинах. Таким образом, если полные транскрипции комплементарной ДНК (кДНК) эукариотной mРНК используются в качестве ДНК-последовательностей для экспрессии в прокаристах, то получают в результате предпротеин, а не зрелый протеин. Имеется возможность превратить предпротеины в зрелые протеины в лабораторных условиях, но эта стадия требует значительных затрат.

В том случае, когда для экспрессии зрелого протеина в прокаристах используют ДНК-последовательность, кодирующую зрелый протеин, эта последовательность не содержит эукариотных сигналов трансляции и сигналов послетрансляционной обработки, которые в общем случае содержатся внутри ДНК для главной последовательности. Следовательно, для экспрессии клонированных эукариотных генов или других последовательностей гетерологической ДНК в прокариотных системах, как было установлено, желательно использовать прокариотные контрольные сигналы ввиду их эффективности и вследствие того, что эукариотные сигналы не могут распознаваться прокариотной клеткой-хозяином.

Термин "гетерологическая ДНК", как он используется в соответствии с настоящим изобретением, означает ДНК, по крайней мере часть которой не содержится в общем внутри генома клетки-хозяина. Примеры гетерологической ДНК включают, но ими не исчерпывается полный список, вирусные и эукариотные гены, фрагменты генов, аллели и синтетические последовательности ДНК. Термин "гетерологический протеин" или "гетерологический полипептид" означает здесь протеин или полипептид, по крайней мере часть которого в общем случае не закодирована внутри генома клетки-хозяина.

Прокариотные управляющие сигналы содержат промотор, который указывает на инициирование транскрипции, и управляющие трансляцией сигналы, содержащие сайт связывания рибосомы, сигнал начала трансляции и сигнал завершения трансляции. Все эти сигналы, за исключением сигнала завершения трансляции, должны быть расположены перед эукариотным геном или другой ДНК, которые должны быть подвергнуты экспрессии.

Известны несколько подходов с целью экспрессии гетерологической ДНК (например, эукариотных генов) в прокариотах. В соответствии с одним из подходов, сегмент ДНК, кодирующий искомый протеин, подвергают лигации с ДНК, кодирующей полный бактериальный протеин или его некоторую часть при управляющем воздействии его бактериального промотора. Эндогенная прокариотная ДНК обязательно содержит также рибосомный связующий сайт и сигнал начала трансляции. Экспрессия такой лигационной ДНК дает то, что называют протеином слияния, содержащим эукариотный полипептид, связанный или слившийся с полным или частичным бактериальным протеином. Выделение эукариотного протеина затем можно осуществить при помощи ориентируемого на определенный сайт ферментного или химического сечения в сайте слияния эндогенного-эукариотного протеина или при помощи селективного разрушения прокариотных полипептидных последовательностей.

Примерами опубликованных работ, касающихся получения в бактериях эукариотных протеинов слияния, являются: Европейская патентная заявка 47,600 (опубликованная 17 марта 1982 года), которая относится к протеинам слияния и "однородным" протеинам, содержащим бычий предгормон роста или бычий гормон роста ("бГР") на карбокси (С-) конце с порцией прокариотного протеина на амино (N-) конце; патентная заявка Великобритания 2,073,245А (опубликованная 14 октября 1981 года), касающаяся протеинов слияния бГР и -лактамазы E.coli; публикация E. Keshet et al "Nucleic Acid Researh", 9: 19-30(1981), касающаяся протеина слияния бГР и b-лактамазы E.coli; Европейская патентная заявка 95,361 (опубликованная 30 ноября 1983 года), касающаяся протеина слияния, содержащего последовательно эндогенный протеин на N-конце, аминокислоту сигнала начала трансляции, сайт сечения энтерокиназой и экзогенный протеин (например, гормон роста) на С-конце. Такой подход с целью получения протеина слияния однако является слишком громоздким, ввиду того, что он требует обработки в лабораторных условиях после очистки и стоимость фермента (ферментов) для обработки промышленных количеств может оказаться сильным препятствием.

Однако, протеины слияния стали весьма притягательной системой для экспрессии некоторых эукариотных генов или других гетерологических ДНК в прокариотных клетках, так как продукт слияния, оказывается, предохраняет некоторые, полученные в результате, гетерологические протеины от внутриклеточной деградации. Оказывается, что бактериальные клетки "принимают" некоторые эукариотные протеины, продуцированные в ней за "чужеродные", и, таким образом, стараются разрушить эти протеины сразу же после их синтеза или через весьма непродолжительное время. Протеины слияния, созданные для предохранительных целей, могут использовать эндогенные полипептидные последовательности либо на амино-, либо на карбокси-конце гетерологического протеина. Примером последнего подхода может служить подход, предложенный в Европейской патентной заявке 111,814 (опубликованной 27 июня 1984 года), где описаны протеины слияния, содержащие некоторую форму бГР, имеющую синтетический передний конец (амино-конец) и b-галактозидазу E.coli на С-конце. Однако, все преимущества снова снижаются ввиду необходимости в последующем рассекать гетерологический протеин из эндогенного полипептида в соответствии с описанием, приведенным выше.

В соответствии с другим подходом сигнал начала трансляции, ATG, при регулирующем воздействии бактериального промотора расположен непосредственно перед ДНК-последовательностью, кодирующей гетерологический (например, эукариотный) протеин, не содержащий эндогенный протеин как на N-конце, так и на С-конце полученного протеина. Хотя протеины, полученные при помощи таких генных конструкций не требуют последующего сечения для образования искомого протеина, они в общем случае включают метионин (в некоторых случаях формилметионин) на N-конце, так как стартовый сигнал ATG также является кодоном метионина. Таким образом, если целевой зрелый протеин не начинается с метионина, то такой протеин будет иметь N-конец, измененный включением метионинового остатка.

К примерам таких генных конструкций относятся работа Guarente et al. Cell (1980) 20: 543 553, в соответствии с которой ген b-глобина кролика, который обладает N-концевым валином, подвергается экспрессии в E.coli с использованием только что описанной генной конструкции. В результате исследований ими было установлено, что "в то время как в b-глобине кролика отсутствует амино-концевой метионин, а лейцины содержатся в позициях 3, 14, 28, 31, 32 в меченом протеине лейцины были обнаружены в позициях 4, 15, 29, 32 и 33, а метионин был найден в позиции 1. Этот результат показывает, что этот протеин является b-глобином кролика плюс аминоконцевой метионин, которые не удаляются в E.coli, см. там же, стр. 546 547.

Другой пример относится к получению гормонов роста в бактериях, используя описанную выше генную конструкцию. Schoner et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. (1984)- 81: 5403 5407 описывают систему с высокой степенью экспрессии в бактерии для получения бГР, которая приводит к получению N-метионинового бГР; то есть соединения, содержащего аминокислотную последовательность, подобную аминокислотной последовательности одного из встречающихся в природе видов бГР плюс метионин на его N-конце. Присоединение N-концевого метионина к различным видам гормона роста, производимого бактериями, уже обсуждалось в Европейской патентной заявке 103,395 (опубликованной 21 марта 1984 года) и в Европейской патентной заявке 75,444 (опубликованной 30 марта 1983 года) для бГР и Seeburg et al. DNA (1983), 2: 37 45, для бГР и свиного гормона роста ("сГР").

Присоединение N-концевого метионина к натуральному N-концу может быть нежелательным по нескольким причинам. Во-первых, вполне возможно (хотя в настоящее время представляется мало правдоподобным), что метионин имеет тенденцию превращать протеин в антигенный в организме, в котором протеин без N-метионина является эндогенным. Во-вторых, присоединение метионина к N-терминальной части протеина может оказать нежелательный эффект на его биологическую активность или его физические свойства. В-третьих, эта измененная форма протеина может служить препятствием для научных исследований, направленных на определение связи между функцией натурального протеина и его структурой. Кроме того, может оказаться предпочтительным иметь дело с биосинтетическим протеином, который по структуре близок, насколько это возможно, к встречающемуся в природе протеину при его применении после одобрения правительством для медицинских или ветеринарных целей.

Способность таких прокаристов, как бактерий, удалять N-концевой метионин из протеинов либо во время их получения, либо уже после их получения привлекает в последнее время большое внимание. Например, Waller, J.Mol.Biol. (1963) 7: 483 496 исследовал состав N-терминальных аминокислот "растворимых" и рибосомных протеинов из экстракта E.coli, не содержащего клеток, а в Европейской патентной заявке 103,395 (опубликованной 21 марта 1984 года) предложен способ удаления N-концевого метионина из эукариотного протеина, синтезированного культурой E.coli. В частности, метионин удаляется из одного из двух упомянутых, производимых бактериями, протеинов бГР, причем оба они содержат остаток серина сразу же после содержащегося с самого начала N-концевого метионина. Генная конструкция, которая была использована в этих исследованиях, однако содержала синтетическую стартовую последовательность, кодирующую 5'-метионин-серин-лейцин-3', вставленную непосредственно рядом с 5'-концом бГР-кодирующей последовательности, в которой предварительно были удалены основания, кодирующие первые 4 или 9 встречающихся в естественных условиях аминокислот. Таким образом, полученный в результате протеин, синтезированный в культуре E.coli, был не натуральным протеином. В патентной заявке Великобритании 2,073,245А (опубликованной 14 октября 1981 года) указано, что, если met-pro заменить ala в зрелом бГР-протеине, то "met" может быть переработана бактериями таким образом, что в результате получается модифицированный бГР, начинающийся с аминокислотной последовательности Pro-Phe-Ala-Pro".

Таким образом, имеется необходимость в экономичном и предсказуемом средстве для получения в таких микроорганизмах, как бактерии, гетерологических (например, эукариотных) протеинов, которые не содержат N-концевого метионина. Особенно желательно разработать такой способ, в соответствии с которым такие протеины, полученные в бактериях, не требовали бы в лабораторных условиях обработки после ферментации и не содержали бы дополнительного, ненатурального N-концевого метионина.

Гормоны роста (также называемые соматотропинами) представляют собой полипептиды, продуцированные и секретированные клетками гипофиза и в значительной степени ориентированные на них по своему действию. Наряду с их ролью в ускорении роста скелета гормоны роста оказывают влияние на многочисленные метаболические процессы, включая стимулирование выделения молока, увеличение высвобождения инсулина из поджелудочной железы и выделения глюкоголя; кроме того, они оказывают эффект мобилизации липидов. Экзогенное применение бГР к крупному рогатому скоту, например, приводило к увеличению надоев молока, эффективности корма и/или скорости роста, снижению времени откармливания и увеличению отношения постная часть мяса/жира. Однако до сих пор не полностью ясно, как этот гормон вызывает столь многочисленные эффекты.

Обширные исследования, выполненные с гормоном роста человека (чГР), показали, что этот гормон в том виде, в каком он секретируется человеческим гипофизом, не представляет собой цельную молекулу, а является смесью полипептидов. Фракционирование различных видов чГР привело в конце концов к получению некоторых фракций чГР без диабетогенной активности и без липолитической активности.

Точно также, бГР, производимый крупным рогатым скотом, имеет несколько форм. В частности, синтезируется четыре вида бГР, которые отличаются в двух позициях протеина, N-концевая аминокислота может варьироваться из-за вероятной неоднозначности при удалении сигнальной пептидной (главной) последовательности таким образом, что зрелый протеин начинается либо с NH₂-phe-pro, либо с NH₂-ala-phe-pro. Кроме того, имеется некоторая неоднородность в аминокислоте 126, которая является либо лейцином, либо валином. Это вызвано, очевидно, аллельными вариациями в бычьей популяции [Wallis (1969) FEBS Letters 3: 118 120; Fellows and Rogol (1969) J. Biol. Chem. 244: 1567 1575; Fernandez et al. (1971) FEBS Letters 18: 53 54; Fellows (1973) личный комментарий, приведенный в Recent Progress in Hormone Research 29: 404; Santome (1973) Eur.J.Biochem. 37: 164 170; Graf and Li (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm. 56: 168 176] Четыре молекулярные формы (вида) гипофизарного бГР обозначаются в сокращении следующим образом (см. табл.1).

Виды бГР (A,B) и бГР(В) иногда называют общим термином "валиновые аллельные бГР-виды" или "валиновые бГР-виды". В точности также, виды бГР(А,Л) и бГР(Л) иногда называют общим термином "лейциновые аллельные бГР-виды" или "лейциновые бГР-виды". Числа, связанные с аминокислотами в протеинах бГР, указанных выше, приведены только с целью идентификации и удобства ссылок.

Mills et al. (1970),J.Biol.Chem. 245: 3407 3415, в точности также идентифицировал два фрагмента цианбромида свиного гормона роста (сГР), имеющих неоднородность в соответствующих им N-концах. В частности, один фрагмент содержал N-концевой фенилаланин, а другой дополнительный N-концевой аланин. Эти молекулярные формы сГР в дальнейшем коротко обозначаются через сГР(Ф) и сГР(А), соответственно.

В работе Seeburg et al. DNA (1983) 2: 37 45, посвященной бактериальной экспрессии метиониновой формы PGH (Ph) при регулирующем воздействии бактериального промотора и расположении ДНК-последовательности, кодирующей целевой полипептидный продукт, непосредственно за сигналом начала трансляции, ATG, опубликованы полные ДНК-кодирующие последовательности и соответствующие аминокислотные последовательности для бГР(Л) и бГР(А).

Гипофизарные клетки отдельных видов крупного рогатого скота, как было установлено, в общем случае содержат смесь по крайней мере бГР(А,Л) и бГР(Л) или бГР(А, В) и бГР(В). Анализ N-концов протеинов бГР, полученных в культивированных гипофизарных клетках, показал на присутствие 50:50 смеси молекул, содержащих либо N-концевой фенилаланин (phe), либо N-концевой аланин (ala). Препарации, изготовленные в промышленных условиях и полученные из собранных гипофизов многих животных, в общем случае содержат все четыре молекулярные формы гипофизарного бГР. Кроме того, стало известно, что примерно 30% молекул в препарациях бГР, полученных из собранных гипофизов, имеют валин, заменяющий лейцин в позиции 126 [Fernandez et al. (1971) FEBS Letters 18: 53 54] Стандартные биохимические приемы разделения для четырех известных бГР-форм не позволяют получать каждый или какой-нибудь один из этих видов в промышленных масштабах. Поэтому было бы желательно исследовать и сделать доступными для промышленной применимости биологические активности каждой из 4 форм бГР, "существенно чистой" от других 3 форм и/или свободной от других протеинов бычьей природы. Термин "существенно чистый" используется здесь для обозначения специального протеина или протеинов, существенно свободного(ных) от протеинов и/или других материалов, с которыми протеин(протеины) связан(ы) в естественных условиях или источниках.

Целью изобретения является получение рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста.

Указанный полипептид согласно изобретению получают способом, включающим конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей промотор, действующий в E.coli, участок связывания с рибосомой, терминирующий кодон сайт инициации трансляции, представленный кодоном метионина, и расположенную непосредственно за названным кодоном последовательность кДНК гена свиного гормона роста pGH(А) с N-концевым аланином, кодирующим целевой полипептид, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидной штамма E.coli, отбор и культивирование полученных трансформантов в питательной среде. Полученный полипептид, не содержащий на N-конце дополнительного остатка метионина, подвергают выделению и очистке.

Предлагаемый способ отличается от ближайшего известного способа, опубликованного Seeburg (1983) в DNB, использованием в качестве кодирующей последовательности кДНК гена свиного гормона роста pGH(A) с N-концевым аланином, и выделением и очисткой полученного полипептида, не содержащего на N-конце дополнительного остатка метионина.

Полипептиды сГР, полученные при помощи способа, являющегося предметом настоящего изобретения, обеспечивают средство для усиления таких активностей соматотропина, как увеличение выхода молока, скорости роста и/или эффективности корма.

На приводимых на фигурах диаграммах штриховым контуром изображена кодирующая последовательность ДНК бактериального промотора, зачерченный контур представляет кодирующую последовательность гетерологической ДНК, черточками изображены дополнительные кодирующие последовательности ДНК (они конкретно указаны на фигурах), а направленная стрелка указывает на ориентацию 5' и 3' кодирующих последовательностей ДНК. Указаны также соответствующие сайты для эндонуклеаза сечения. Отмеченные области ДНК приведены только с целью наглядного представления и они не связаны с реальными размерами этих областей.

Фиг. 1 конструкция M13mp8/XbaI, содержащая вектор M13mp8, имеющий вставленный в него в сайте сечения эндонуклеазой SmaI сайт сечения эндонуклеазой XbaI.

Фиг. 2 конструкция M13mp8/BGH_ex-1, содержащая M13mp8/XbaI, несущую кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК.

Фиг. 3 конструкция кодирующей бГР(А,Л) последовательности ДНК при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте.

Фиг. 4 конструкция кодирующей бГР(А,В) последовательности ДНК при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте.

Фиг. 5 конструкция вектора экспрессии pMON3209, содержащего pBGH_ex-1, несущую кодирующую бГР(А,Л) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.

Фиг. 6 конструкция вектора экспрессии pMON3215, содержащего pBGH_ex-1, несущую кодирующую бГР(А,В) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.

Фиг. 7 конструкция M13mp9/PGH_ex-1, содержащей M13mp9, несущий кодирующую сГР(П) последовательность ДНК.

Фиг. 8 конструкция кодирующей сГР(А) последовательности ДНК при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте.

Фиг. 9 конструкция pBGH_ex-1^*, содержащего pBGH_ex-1, в котором сайт сечения эндонуклеазной EcoRI расположен по направлению вверх от 5'-конца кодирующей ptrp последовательности ДНК был предварительно удален.

Фиг. 10 конструкция вектора экспрессии pMON3213, содержащего pBGH_ex-1^*, несущий кодирующую сГР(А) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ получения в прокаристе гетерологического полипептида, такого, как эукаристный (например, млекопитающего или птицы) протеин, который содержит N-концевой аланин. Таким образом, получают полипептид без N-концевого метионина и тем самым исключается необходимость в обработке в лабораторных условиях с целью получения такого полипептида без N-концевого метионина. Возможность устойчивого получения такого полипептида без N-концевого метионина, содержащегося в кодирующей последовательности гена, является новым и совершенно неожиданным результатом.

Настоящее изобретение предлагает весьма эффективный способ получения "существенно чистых протеинов", которые имеют N-концевой аланин. Кроме того, настоящее изобретение можно эффективно использовать для получения других полипептидов, когда желательно иметь на N-конце аланин, а не метионин, например, когда N-аланиновая форма полипептида может быть менее иммуногенной, или иметь другие физические свойства или модифицированную биологическую активность.

Примеры реализации настоящего изобретения, согласно которым получают по существу чистые виды бГР или сГР при помощи культивирования бактериальных клеток, пока не содержат ни доказательства необходимости удаления N-концевого метионина, ни указания на необходимость осуществления этого приема. Во всех работах, посвященных экспрессии бГР при помощи бактериальных клеток, в которых N-конец содержит N-концевую аминокислотную последовательность, гомологичную встречающимся в природе видам бГР, описано присутствие N-концевого метионина. В статье Seeburg et al. DNA (1983), т. 2, с. 37 45 на с. 44 указано, что последовательность гена для N-концевых фенилаланиновых видов бГР, например бГР(Л), умышленно выбирается для экспрессии в культуре E.coli частично, чтобы избежать ожидаемого присоединения второй гидрофобной аминокислоты (метионина) к гидрофобному N-концевому аланину других видов бГР, например, бГР(А,Л). Таким образом, доступные до настоящего времени исследования указывают на сохранение N-концевого метионина в синтезированных бактериями видах бГР. Несмотря на эти известные результаты, заявителем было установлено, что по причинам, указанным выше, имеется необходимость в получении каждого из двух видов бГР-бГР(А,Л) и бГР(А,В) и вида сГР(А) гормона сГР. Однако попытки получить эти виды соматотропина с помощью бактерий предприняты в ожидании, что полученные полипептиды будут содержать N-концевой метионин.

Как это более подробно описано в примерах реализации настоящего изобретения, подход заявителя с целью получения бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А) в бактериях, если очень коротко, заключается в следующем. Кодирующие вышеупомянутые протеины последовательности ДНК строятся при помощи направленного на нуклеотиды мутагенеза в специальном сайте последовательностей ДНК, кодирующих свиные виды соматотропина, содержащие N-концевой фенилаланин, как это показано на фиг. 3, 4 и 8. Затем последовательности, кодирующие бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А) вставляют в векторы экспрессии таким образом, что окончательная генетическая последовательность содержит последовательно промотор, сайт связывания рибосом, кодон ATG начала [метионин, непосредственно примыкающий к последовательности ДНК, кодирующей либо бГР(А,Л), либо бГР(А,В), либо сГР(А)] и, наконец, кодон прекращения трансляции. Культуру E.coli затем подвергают трансформации полученным вектором экспрессии, несущим искомую последовательность гена, и культивируют при условиях, которые позволили бы осуществить экспрессию искомой гетерологической ДНК и получить тем самым искомый гетерологический протеин. Затем полученные таким образом протеины анализируют с точки зрения их последовательности и соответствующей биологической активности.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением установлено, что когда ДНК-последовательность, содержащую кодон сигнал начала (метионин) и следующие за ним кодоны гетерологического N-аланинового полипептида, подвергают экспрессии, то протеин, выделенный из прокаристного организма действительно содержит аланин на N-конце, а не метионин. Представляется правдоподобным, что аналогичный результат может быть получен, если этот аланиновый кодон расположен вслед за примерно тремя соседними метиониновыми кодонами, которые включают сигнал начала трансляции mРНК, кодирующей целевой полипептидный продукт. Например ДНК, включающая этот сигнал начала трансляции и кодоны целевого полипептидного продукта, может включать любую последовательность, которая соответствующим образом кодирует met-ala, met-met-ala, met-met-met-ala или любой его функциональный эквивалент.

N-аланиновый полипептид определяется здесь как полипептид, содержащий аланин на своем аминоконце. Заявитель не хотел бы ограничивать себя представленной ниже теорией механизма, но он убежден, что после трансляции N-концевой метионин полипептида ферментным образом удаляется прокаристом, если следующей аминокислотой является аланин или другая аминокислота, имеющая такие же характеристики (например, полярность или гидрофобность), которая способствует такому удалению N-метионина. Кроме того, также представляется правдоподобным, что многие прокариоты оказываются способными удалять N-концевые метионины из гетерологических и/или эндогенных полипептидов, если после вышеупомянутых N-концевых метионинов сразу же следует аланин.

Эти прокаристы (например различные бактерии, известные и доступные благодаря существованию институтов для депонирования микроорганизмов, таких как ATCC и другие) включают E.coli и различные ее штаммы, но видимо, ими не ограничивается весь список. В самом деле, весьма правдоподобно, что любой прокарист, способный синтезировать полипептид, содержащий N-концевой аланин из кодирующей последовательности ДНК, которая начинается с одного и до примерно трех соседних кодонов метионина, после которых сразу же следует кодон аланина, потенциально может оказаться эффективным при реализации настоящего изобретения. Производимые промышленностью другие доступные прокариотные организмы могут быть просеяны на их способность продуцировать такие N-аланиновые полипептиды при помощи вставки в геном вышеупомянутых организмов гена, содержащего последовательно промотор, действующий в вышеупомянутом организме, ДНК, кодирующую сайт связывания рибосом, от одного до примерно трех соседних кодонов метионина, включающих сигнал начала трансляции, а затем сразу идут кодоны гетерологического N-аланинового полипептида и сигнал прекращения трансляции, затем осуществления экспрессии вышеупомянутого гена и, наконец, идентификации N-концевой аминокислотной последовательности полученного таким образом гетерологического полипептида. Если установлено, что такой прокариотный организм продуцирует внутренним образом такой гетерологический N-аланиновый полипептид, то такой организм содержится внутри класса, который может быть использован согласно настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения три различных изолята штамма K12 E.coli, каждый из которых был депонирован в Американском Собрании Типов Культур, Роквилл, Мэрилэнд и имеет числовой шифр ATCC 39936, 53010 и 53009 соответственно, обладают способностью удалять N-концевые метионины в том случае, когда после вышеупомянутых N-концевых метионинов следует сразу же аланин.

Это открытие представляется значительным, так как оно дает способ получения в прокаристах гетерологических полипептидов, которые содержат N-концевые аланины.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления способа, являющегося предметом настоящего изобретения, он используется для получения двух видов бГР-бГР(А, Л) и бГР(А, В), и одного вида сГР-сГР(А), которые не содержат других бычьих или свиных протеинов и/или других бГР или сГР видов соответственно. В частности этот способ обеспечивает получение бГР(А,Л), бГР(А,В) или сГР(А), как одного единственного вида. Способность продуцировать единственный бГР- или сГР-вид с аминокислотными последовательностями, гомологичными встречающимися в природе соматотропинами, имеет огромное значение для определения точной биологической активности каждого бГР- или сГР-вида, выявляя тем самым многочисленные усиливающие эффекты бГР и сГР в общем случае, как это было описано выше. В действительности было установлено, что применение одного из двух N-аланиловых видов бГР дает усиление такой функции бГР, как увеличение надоев молока. Кроме того, было установлено, что использование для увеличения выделения молока количества бГР(А,В), полученного в соответствии с настоящим изобретением, увеличивает надои молока в день от коровы в более значительной степени в статистическом смысле, например, p<0,05, чем полученный таким же образом бГР(А,Л). До последнего времени не было известно каких-либо результатов по поводу относительной эффективности специальных форм (видов) бГР с целью увеличения надоев молока у млекопитающих, производящих молоко. Кроме того, не было также известно каких-либо результатов, полученных в живом организме или в лабораторных условиях, которые бы указывали, что имеются различия в биологической активности между различными видами бГР. Таким образом, вывод, заключающийся в том, что валиновые аллельные виды бГР приводят к более значительному увеличению выделения молока, чем лейциновые аллельные виды бГР, оказался и удивительным и неожиданным. Кроме того, этот вывод предполагает, что можно аналогичным образом определить различия в относительной эффективности видов бГР в усилении других свойств гормонов роста, таких как увеличение эффективности корма и стимулирования роста. Таким образом, используя приемы настоящего изобретения, которые позволяют получить в бактериях по крайней мере две молекулярные формы гипофизарного бГР в существенно чистом виде, и/или используя другие известные приемы, можно теперь получать виды бГР, наиболее эффективные для достижения специальной реакции, вызванной гормоном роста. К таким другим известным приемам относятся, но ими не исчерпывается полный список, химический синтез полных протеинов бГР или их фрагментов, и/или продуцирование в других микроорганизмах таких, как дрожжи, или в клетках млекопитающих, используя известные методы рекомбинантной ДНК.

Кроме того, после определения биологической активности каждого, встречающегося в природе вида, вполне выполнимой задачей является получение полипептидных вариантов каждого из таких видов, которые должны еще более увеличивать их соматотропиновую активность. Таким образом, можно предвидеть, что образование соматотропиновых вариантов в результате удаления нуклеотидов или аминокислот, замены и/или добавления нуклеотидов или аминокислот дает возможность получить различные полезные эквиваленты композиций, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением. К таким вариантам относится измененная форма бГР(В), в котором изменение заключается в присоединении метионина к амино-концу. Этот вариант, производимый генетически трансформированной бактерией, как было установлено, значительно увеличивает ежедневное отделение молока у коров при применении его в количестве, увеличивающем лактацию. Кроме того, степень отмеченного увеличения лактации после применения этого варианта бГР(В), как было установлено, заметно больше по сравнению с увеличением лактации, отмеченным после применения в других отношениях варианта, содержащего лейцин в аминокислотной последовательности в положении 126.

Оказалось, что замена лейцина валином в положении 126 существенно увеличивает биоусваиваемость и/или биологическую активность таких соматотропиновых протеинов. В частности, кристаллографический анализ в рентгеновских лучах, проведенный на соматотропиновых протеинах, показал, что область вышеупомянутых протеинов, расположенная примерно от аминокислоты 90 до 136, образует относительно гибкую область. Исследование других протеинов показало, что такие гибкие области часто содержат биологически активный сайт (например, сайт, который взаимодействует с биологическими рецепторами и/или другими частями того же протеина с тем, чтобы получить биологически активную форму). Таким образом, следует ожидать, что дополнительные варианты бГР(А, В), которые содержат замещения, удаления, добавления и/или инверсии аминокислот внутри только что описанной гибкой области и/или вне этой области, могут быть получены и в точности также приводят к заметному увеличению надоев в большей степени, чем идентичные в других отношениях лейциновые виды бГР или бГР(А,Л). Например, изменения в позиции 126 аминокислоты или вокруг нее могут включать замещение других, более гидрофильных и/или меньших аминокислот (относительно лейцина), при условии, чтобы описанное увеличение отделения молока не снизилось до недопустимой степени.

Кроме того, можно ожидать, что валиновые типа бГР, содержащие N-концевые phe₁, или N-концевые ala_-1, могут обеспечивать описанное увеличение надоев молока при применении к коровам. Можно также ожидать, что изменения в аминоконцах (например, met_-1), которые не отличаются существенно от N-конца, встречающегося в природе бГР, не окажут слишком сильного влияния на способность валиновых видов бГР увеличивать надои молока в существенно большей степени, чем идентичные во всех других отношениях лейциновые виды бГР и бГР(А, Л). Кроме того, следует также ожидать, что композиция бГР, в которой концентрация валиновых видов бГР в пересчете на вес всех бГР в этой композиции существенно больше, чем концентрация валиновых видов бГР в собранных препарациях гипофизарного бГР, также позволили бы добиться необходимого результата.

В соответствии с одной из своих широких реализаций настоящее изобретение представляет собой углубление в использовании технологии рекомбинантной ДНК с целью непосредственного получения в прокаристах гетерологических полипептидов. Таким образом, описание настоящего изобретения предполагает знакомство с основными приемами, которые используются в технологии рекомбинантной ДНК с целью изоляции и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды, с перераспределением или изменением клонированных последовательностей ДНК и экспрессией клонированных или модифицированных последовательностей ДНК в трансформированных микроорганизмах. С такими приемами знаком любой специалист в этой области техники. (См. например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; под ред. Maniatis, Fritsch Sambrook, 1982).

Изоляция и/или конструкция гетерологической ДНК В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения ДНК последовательность, кодирующую искомый гетерологический полипептид, подлежащий продуцированию в прокаристе, выбирают и изолируют, или ДНК последовательность, которая его кодирует, строят или синтезируют химически. Во многих важных вариантах воплощения таким полипептидом является эукаристый протеин. Если полипептид является небольшим и известна полная аминокислотная последовательность, то можно построить синтетическую ДНК-молекулу или последовательность, кодирующую этот полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида неизвестна или ее размеры слишком велики для того, чтобы практически реализовать синтез соответствующей ДНК-последовательности, можно получить последовательность кДНК при помощи обратной транскрипции из соответствующей mРНК, полученн