Живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита в и натуральной оспы для накожного применения и способ ее получения

Живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита в и натуральной оспы для накожного применения и способ ее получения

Реферат

 

Использование: изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к вакцинопрофилактике инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: предложен лиофилизированный препарат рекомбинантной вакцины против гепатита В, полученного на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины в 7,5 S2-S (ГКВ N 2131) путем пассирования на РКЭ и коже телят с последующей очисткой и концентрированием. Вакцина исследована с помощью биологических, иммуномедицинских и серологических методов при проведении доклинических и клинических испытаний на добровольцах и предназначена для профилактики гепатита В (сывороточного гепатита) и натуральной оспы. 2 с. п. ф-лы, 1 ил., 21 табл.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к вакцинопрофилактике инфекционных заболеваний, и представляет собой лиофилизованный препарат рекомбинантной вакцины против гепатита В, полученный на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ N 2131. Вакцина исследована с помощью биологических, иммуномедицинских и серологических методов при проведении доклинических и клинических испытаний на добровольцах и предназначена для профилактики гепатита В (сывороточного гепатита).

Гепатит В (сывороточный гепатит) вирусное заболевание, передающееся от человека к человеку в основном парэнтерально. Возбудителем является вирус гепатита В, который не размножается на культуре клеток и на лабораторных животных, за исключением некоторых видов высших приматов [1] В России и странах СНГ вакцина против гепатита В не производится. За рубежом производится плазменная вакцина, приготовленная из сыворотки доноров крови носителей поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и субъективная, полученная на основе рекомбинантных дрожжей [2, 3] Однако широкое применение их в нашей стране ограничено из-за высокой стоимости препаратов [4, 5] Ограничен также источник получения плазменной вакцины - носители HBsAg. Производство дрожжевой рекомбинантной вакцины связано с трудоемкой, дорогостоящей очисткой HBsAg.

Вакцина против гепатита В на основе рекомбинантных штаммов вируса осповакцины (ВОВ) была бы лишена этих недостатков: независимость от подобного рода источников сырья и простота технологии производства позволяет быстро удовлетворить потребность медицины в надежном и недорогом препарате.

Использование рекомбинантной вакцины против гепатита В на основе вируса осповакцины имеет преимущество перед другими [6] так как позволяет осуществлять экспрессию протективных антигенов вируса гепатита В не только в культуре клеток, но и в организме привитого, моделируя естественный инфекционный процесс. Необходимо отметить также, что в данной векторной системе протективные белки правильно процессируются и гликозилируются [7] образуясь внутри антиген-презентирующих клеток, что очень важно для надежной индукции иммунитета [8 11] Работы, направленные на создание рекомбинантных вакцин против гепатита В, основывались на экспрессии основного белка вируса гепатита В S-белка (HBsAg), длиной 226 а.к. [12, 13] Вместе с тем известно, что preS2-S-белок является гораздо более сильным иммуногеном, чем S-белок [16, 17] Кроме того, preS2-область даже без S-компонента обладает протективными свойствами, что показано в экспериментах на шимпанзе [18, 19] Поэтому предполагается что вакцина против гепатита В, основанная на вирусе осповакцины, включающая preS2-S-белок, окажется эффективной.

Известен способ получения оспенно-гепатитной вакцины на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, экспрессирующего только HBsAg [4] однако проведенные клинические испытания на добровольцах показали неиммуногенность полученного препарата, а значит и бесперспективность такой вакцины [15] Известен рекомбинантный штамм вируса осповакцины ГКВ2131, полученный путем встройки в ген тимидинкиназы вируса осповакцины (штамм ЛИВП) фрагмент ДНК вируса гепатита В, кодирующего синтез preS2- и HBs-антигенов вируса гепатита В [20] Экспрессия антигенов вируса гепатита В осуществляется под контролем ранне-позднего 7,5k промотора ВОВ. Однако вакцина против гепатита В на основе этого штамма пока не создана.

Таким образом, не известно из литературных источников о рекомбинантных вакцинах против гепатита В на основе ВОВ, используемых в целях профилактики.

Целью изобретения является создание живой рекомбинантной вакцины против гепатита В на основе вируса осповакцины, предназначенной для использования в медицинской практике для профилактики заболеваний сывороточным гепатитом В.

Сущность изобретения заключается в том, что, используя рекомбинантный штамм вируса осповакцины ГКВ N 2131 (в 7,5 S2-S, гепатит В/вирус осповакцины), получают путем пассирования этого штамма на куриных эмбрионах (двукратно) и коже телят (однократного) живую рекомбинантную вакцину против гепатита В "Ревакс В", лиофильно высушенную и содержащуюся в ампулах, предназначенную для накожного применения. Вакцина "Ревакс В" исследована на токсичность, безвредность, подлинность, специфичность, нейровирулентность, некротическую активность, туморогенность, влияние на центральную нервную систему (ЦНС), аллергическое воздействие, термостабильность и стабильность при хранении в процессе доклинических испытаний. Препарат изучен по показателям генетической стабильности и однородности, соответствует требованиям по бактериальной контаминации. Доклинические и клинические испытания показали, что вакцина обладает иммуногенностью, индуцируя специфическое антителообразование и возникновение сенсибилизированных к протективным антигенам лифмоцитов. В ходе испытаний препарата на добровольцах показана его клиническая и иммунологическая безопасность.

Морфология, признаки вакцины.

Препарат "Ревакс В" представляет собой однородную пористую массу светло-серого или светло-желтоватого цвета, гигроскопичен, при растворении растворителем оспенной вакцины (50%-ный раствор глицерина) при температуре 15 30^oC представляет собой гомогенную, светло-серую или серо-желтую жидкость со слабой опалесценцией. Вакцина растворяется не более 1 мин в (0,200,01) мл растворителя при температуре (17 25)^oC.

Водородный показатель (7,00,5) рН, определяется при растворении. Массовая доля влаги не более 2,5% Ампулы с препаратом, герметично запаянные под разряжением, имеют голубое или розово-голубое свечение в поле высокочастотного разряда на аппарате Д'Арсонвала или Тесла. Ампулы, заполненные азотом особой чистоты, герметичны и содержат остаточный кислород не более 2% Содержание сапрофитной микрофлоры в 1 мл вирусной суспензии не более 50 колоний. Патогенная микрофлора отсутствует.

При сублимационной сушке вакцины используется раствор пептона 5-10%-ной массовой доли в качестве стабилизатора (от 0,05 до 0,1 г сухого пептона на 1 мл готового препарата).

В препарат также вносится фенол, применяемый для обработки кожи теленка с вакцинальными оспинами, в вакцине не должно содержаться его более 0,25% массовой доли.

Физиолого-биохимические характеристики и биологические свойства вакцины.

Препарат содержит в 1 мл не менее 2,510⁸ оспино-образующих единиц (ООЕ/мл). Одна прививочная доза содержит не менее 10⁶ООЕ в 0,01 мл вакцины (показатель специфической активности).

Вакцина индуцирует образование HBsAg при заражении перевиваемой культуры клеток почки зеленой мартышки CV-1 с концентрацией не менее (505) нг/мл.

Препарат специфичен: образует типичные вакцинальные оспины при накожной вакцинации.

Вакцина подлинна: на хорионаллантоисных оболочках развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) образуется не более 10 поражений поверхностного типа на 1000 типичных, размерами от 0,5 до 3,0 мм. Препарат генетически однороден: HBsAg образуется не менее чем у 80% клонов (HBsAg-экспрессирующие клоны).

Препарат термостабилен: титр не менее 110⁸ ООЕ/мл при хранении при температуре (371)^oC в течение 28 сут. или при нагревании при температуре (621)^oC в течение 5 ч. При хранении при температуре не выше 10^oC в течение 28 месяцев показана стабильность вакцины, определяемая по сохранению специфической активности.

Рестрикционный анализ препаратов ДНК, выделенных из HBsAg-экспрессирующих клонов вируса (из везикулярного содержимого привитых добровольцев), показал соответствие этих клонов эталонному штамму вакцины гепатита В очищенной концентрированной рекомбинантной живой сухой для накожного применения "Ревакс В" ГКВ N 2131, что свидетельствует о генетической стабильности вакцины.

Показатели безопасности вакцины.

Безопасность вакцины исследовалась в процессе доклинических и клинических испытаний на добровольцах.

Доклинические испытания проводились в соответствии с требованиями Минздрава, составленными на основе широко используемой в мире и рекомендованной ВОЗ системы проведения доклинических испытаний GLP (Good laboratory practice) [21] При проверке реактогенности вакцины не отмечено способности некротизировать кожу при внутрикожном и накожном введении кроликам; при совместном содержании привитых и непривитых животных (кроликов и мышей) не выявлены случаи воздушно-капельного заражения и образования специфических антител, что говорит об отсутствии свойств повышенной контактности.

При интрацеребральном введении вакцины кроликам и мышам гибель животных не наблюдалась. Последующее патолого-анатомическое и гистологическое исследование головного мозга и внутренних органов животных выявило умеренно выраженные структурные изменения, не отличающиеся от таковых, наблюдаемых при введении оспенной вакцины. Проведенные исследования позволили сделать вывод об отсутствии нейровирулентности препарата вакцины. Эти результаты подтвердились в экспериментах на мышах с использованием метода судорожных проб с тиосемикарбазидом и коразолом для оценки влияния вакцины на ЦНС: отрицательного воздействия на ЦНС в результате вакцинации не выявлено.

Вакцина "Ревакс В" оказалась нетоксичной и специфически безвредной при простановке тестов на мышах и морских свинках: в течение наблюдаемого срока не было выявлено никаких патологических изменений.

Препарат не вызывал образования опухолей при заражении сирийских хомячков, что свидетельствует об отсутствии туморогенных свойств. Проверка ДНК вакцины на отсутствие в ее геноме чужеродной ДНК с помощью метода дот-гибридизации подтвердила эти результаты. Наличие потенциально онкогенной ДНК генома клеточных культур не выявлено.

Не отмечалось также выраженного супрессорного воздействия вакцины "Ревакс В" на функциональное состояние и количественные характеристики иммунной системы в экспериментах на линейных мышах (линий СВА и ВАLB/c) с использованием цитотоксического теста, методов определения поликлональной активации В-лимфоцитов, изменения неспецифической бласттрансформации лимфоцитов в результате вакцинации под воздействием митогенов, определения антителообразующих клеток, изменения численности иммунокомпетентных клеток.

Аллергизирующие свойства вакцины, исследованные в тестах на линейных мышах и морских свинках с помощью методов анафилактического шока, оценки титра реагиноподобных антител, определения косвенного сенсибилизирующего эффекта, уровня развития реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и оценки фагоцитарной активности макрофагов, не отличались от таковых при иммунизации оспенной вакцины (препарат сравнения) и были оценены как удовлетворительные.

Клинические испытания проводили на добровольцах. В процессе испытаний исследовали реактогенность, безопасность и специфическую активность вакцины против гепатита В "Ревакс В" на основе утвержденной Минздравом программы испытаний и других документов Минздрава [22] При клиническом изучении вакцины "Ревакс В" не было отмечено повышения температурной реакции, изменений общего состояния, нарушений со стороны органов и систем, аллергических реакций, побочных действий. Клинико-лабораторные показатели крови волонтеров различных групп не выявили статистически значимых различий по сравнению с исходными величинами. Испытуемый препарат вызывает менее выраженные местные и общие реакции по сравнению с вакциной оспенной живой сухой, что согласуется с имеющимися данными [6, 15] Изучение иммунного статуса волонтеров, привитых вакциной "Ревакс В", показало, что вакцина не оказывает супрессорного влияния на количественные показатели циркулирующих лимфоцитов и на функцию кроветворения (лейкопоэз). Наблюдается умеренное снижение активности ГЗТ-эффекторов, стимулированных поликлональными активаторами после вакцинации с полным восстановлением их активности к концу исследования. Определение бласттрансформирующей активности лимфоцитов на воздействие in vitro митогенов выявило, что признаки умеренной неспецифической иммунодепрессии существенно ослабевают, что говорит о восстановлении неспецифических пролиферативных функций мононуклеаров.

Результаты клинической апробации вакцины "Ревакс В" на ограниченной группе людей (волонтеров) говорят об ареактогенности и безопасности препарата.

Иммуногенные свойства вакцины "Ревакс В".

Проведенные доклинические испытания показали, что вакцина обладает специфической иммуногенностью, индицируя вируснейтрализующие антитела к ВОВ, определенные с помощью методов вируснейтрализации и иммуно-ферментного анализа (ИФА), специфическое анти-HBs- (методом ИФА) и анти-preS2-антителообразование (методом конкурентного ингибирования связывания с иммобилизованным антигеном), а также возникновение сенсибилизированных лимфоцитов к HBsAg и BOB, определенное в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) у мышей, кроликов и обезьян Macaca mulatta.

Введение вакцины "Ревакс В" волонтерам в дозе не менее 10 ООЕ на человека вызывает индукцию антител к HBsAg и ВОВ, определявшихся с помощью ИФА, а также клеточный специфический иммунный ответ на HBsAg и ВОВ, оцененный в РБТЛ.

Вакцина гепатита В очищенная концентрированная рекомбинантная живая сухая для накожного применения "Ревакс В" (в 7, 5S2-S/гепатит В/ВОВ, ГКВ N 2131) прошла стадии доклинического изучения и клинического испытания на добровольцах согласно решению Комитета МИБП Минздрава СССР о проведении клинических испытаний препарата на ограниченной группе людей (протокол N 13 от 19 декабря 1990 года) по утвержденной Программе испытаний от 03 января 1991 года, а также дополнению к Программе, утвержденному Комитетом МИБП от 14 марта 1991 года на основании результатов доклинических испытаний.

Таким образом, впервые получена рекомбинантная вакцина против гепатита В на основе рекомбинантного штамма ВОВ, обеспечивающая возникновение у человека иммунитета одновременно к гепатиту В и натуральной оспе.

Совокупность всех существенных признаков объектов изобретения экспериментально найдена авторами, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о новизне, изобретательском уровне и промышленной применимости предложенного технического решения.

На чертеже приведена схема производства вакцины "Ревакс В".

Пример 1. Получение вакцины гепатита В очищенной концентрированной рекомбинантной живой сухой для накожного применения "Ревакс В".

Вакцина "Ревакс В" представляет собой лиофилизированную вируссодержащую суспензию, полученную после пассажа на коже телят посевного вируса. Препарат содержится в ампулах.

Исходный материал (эталонный производственный штамм) для производства препарата концентрирован, очищен, разлит в ампулы, лиофильно высушен и представляет собой пассаж на хорионаллантоисных оболочках безлейкозных куриных эмбрионах вакцинного штамма ГКВ N 2131.

Посевной вирус получают в результате пассирования на хориоаллантоисных оболочках развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) исходного материала (эталонного производственного штамма).

Для получения посевного вируса используют 12-суточные куриные эмбрионы.

Заражение исходным материалом (эталонным штаммом) производят на ХАО РКЭ, культивируют в течение не менее 48 ч при (371)^oC. После этого ХАО РКЭ стерильно извлекают, гомогенизируют и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 15 мин. Эти процедуры повторяют несколько раз (в зависимости от содержания вируса) с образовавшимся при центрифугировании осадком при добавлении фреона 113. Надосадочные жидкости объединяют и контролируют. Образовавшийся первичный полуфабрикат представляет собой посевной вирус, который должен быть безвреден, специфичен, не обладает некротической активностью, удовлетворять по показателям бактериальной контаминации, быть генетически однородным (содержать не менее 90% HBsAg-экспрессирующих клонов), индуцировать образование HBsAg в монослое клеток CV-1 в концентрации не менее (505) нг/мл. Специфическая активность должна быть не ниже 510⁸ ООЕ/мл.

Для определения генетической однородности разведение вакцинного материала высевают на чашку Петри монослоем клеток перевиваемой культуры CV-1 под агаровое покрытие (среда Игла ДМЕМ с эмбриональной сывороткой 2%-ной объемной доли). Зараженные клетки инкубируют в течение (241) ч при температуре (37,00,5)^oC в присутствии 5%-ной объемной доли углекислого газа. Образовавшиеся вирусные бляшки отбирают, ресуспендируют и заражают ими монослой клеток перевиваемой культуры CV-1 в 96-луночных планшетах (по 1 бляшке на лунку). Зараженные клетки инкубируют в течение (482) ч при температуре (37,00,5)^oC в присутствии 5%-ной объемной доли углекислого газа, двукратно замораживают и оттаивают, определяют наличие HBsAg в образцах с помощью иммуно-ферментной тест-системы для выявления HBsAg.

Посевной вирус пассируют на скарифицированной коже телят весом 150 200 кг, прошедших карантинный осмотр, в стерильных условиях в специальных помещениях для производства соскоба (детрита). Инкубируют в течение 3 4 сут при 25 29^oC, после чего животное забивают, снимают кожу с оспенными поражениями.

Кожу замачивают в растворе фенола, отмывают от него, после чего снимают детрит. Соскоб гомогенизируют с фреоном, центрифугируют в указанном выше режиме, повторяя эти процедуры с осадком несколько раз и объединяя надосадочную жидкость, представляющую собой вируссодержащую суспензию (вторичный полуфабрикат). Содержание НBsAg-экспрессирующих клонов должно быть не менее 80% Далее производят смешивание вторичного полуфабриката со стабилизатором (пептон). Образовавшуюся в результате этого вакцину в жидком виде сводят в серию, разливают по ампулам, лиофилизируют и запаивают под вакуумом или азотом.

При необходимости возвращения к стадии вакцинного штамма осуществляют повторное клонирование вируссодержащей суспензии готового препарата.

Пример 2. Характеристика реактогенных свойств и показатели безопасности вакцины "Ревакс В".

Клинические изучения реактогенных свойств, показателей безопасности, определение побочного действия вакцины проводили на ограниченной группе людей (добровольцах).

В качестве добровольцев были отобраны лица в возрасте 18 40 лет, имеющие вакцинальные знаки, указывающие на проведенную ранее успешную вакцинацию против оспы. От прививок были отведены лица, перенесшие желтуху любой этиологии, а также лица, имевшие противопоказания, согласно Инструкции по применению вакцины оспенной живой сухой.

При формировании групп добровольцы были серологически обследованы. Носители HBsAg, серопозитивные по антителам к HBsAg и HBcAg, не были включены в число прививаемых добровольцев, однако была выделена подгруппа лиц, имевших антитела к HBsAg, впоследствии привитых вакциной "Ревакс В". Лица, обнаружившие антитела к ВОВ, были распределены между группами. Была выделена также подгруппа лиц серопозитивных по антителам к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) с целью выяснения возможности влияния вакцинации (ревакцинации) "Ревакс В" на изменение уровня антител к ВКЭ, имевшегося у волонтеров до введения испытуемого препарата.

Лица, которым первоначально вводили вакцину "Ревакс В" накожно, методом множественного накалывания с помощью бифуркационных игл или скарификации оспопрививательными перьями, в дозе до 5 10 ООЕ на человека, через 45 суток были разделены на 3 группы в зависимости от ревакцинации: 1 группа повторное введение вакцины "Ревакс В" в той же дозе на другой руке указанным выше способом; 2 группа (однократно привитых) накожное введение плацебо. Сюда же входит подгруппа из добровольцев, имевших антитела к HBsAg до вакцинации, и наблюдаемая отдельно с целью выявления влияния вакцинации "Ревакс В" на ранее сформированный уровень антител к HBsAg ("бустер"-эффект).

В качестве плацебо использовался стерильный глицерин (растворитель оспенной вакцины живой сухой), изготовитель НПО "Вирион" г. Томск.

3 группа внутримышечное однократное введение вакцины "Engerix B" лицам, серонегативным по антителам к HBsAg после первой вакцинации. Данная группа была сформирована для оценки возможного иммунного "праймирования" вакциной "Ревакс В".

Вакцина против гепатита B "Engerix B" (производство фирмы Smith-Kleine Biologicals (Бельгия) представляет собой рекомбинантную дрожжевую вакцину против гепатита В, содержащую очищенный HBsAg. Одна доза вакцины содержится в 1 мл и состоит из суспензии 20 мкг HBsAg, адсорбированном на 0,5 мг Al в виде гидроокиси с добавлением 1:20000 тиомерсаля в качестве консерванта.

Были сформированы другие группы: 4 группа лицам этой группы накожно вводили вакцину оспенную живую сухую (производство НПО "Вирион") в дозе 10 ООЕ на человека; 5 группа добровольцам, входившим в эту группу, вводили вакцину "Engerix B" в качестве препарата сравнения внутримышечно по одной дозе троекратно с интервалом 30 суток от каждого последующего введения; 6 группа (плацебо) волонтерам этой группы однократно накожно вводили растворитель вакцины оспенной живой сухой.

У вакцинированных ежедневно в течение первых 14 суток и далее в указанные сроки измеряли температуру тела, отмечали общее состояние, сон, аппетит, любые нарушения со стороны органов пищеварения, катаральные явления, аллергические реакции. Особое внимание обращали на симптомы, связанные с нарушениями функции печени чувствительность при пальпации, наличие гепатолиенального синдрома.

Отбор крови для постановки тестов по оценке безопасности и эффективности испытуемого препарата осуществляли на 10, 30 и 60 сутки после вакцинации у привитых 4 и 6 групп; на 10, 30, 60, 75 и 185 сутки (15, 30 и 140 сутки после ревакцинации) у привитых 1, 2 и 3 групп; на 10, 30 и 60 сутки со дня последнего введения у волонтеров, прошедших курс вакцинации препаратом Engerix B" 5 группа.

Все добровольцы прошли осмотр через 6 месяцев со дня последнего введения препаратов (отдаленное наблюдение). Привитые опытных групп (1, 2 и 3) были проскринированы на наличие HBsAg в крови.

Первичное введение вакцины "Ревакс В" вызывало в организме привитых (в количестве 99 человек, впоследствии составивших 1 3 группы) развитие как общих, так и местных прививочных реакций. При этом общие реакции были зарегистрированы у 6 человек из 99 испытуемых и выpажались только в повышении температуры тела до 37,1 37,5^oC.

Более реактогенным оказалось введение оспенной вакцины (4 группа 55 добровольцев): из общего числа реакций (8) у 3 привитых температура тела повышалась до 37,6 38,5^oC и у 1 до 39,7^oC, это сопровождалось головной болью, слабостью, чувством жара.

Изучение общей реакции у лиц, ревакцинированных вакцинами "Ревакс В" (1 группа 39 добровольцев) и "Engerix B" (3 группа 13 добровольцев), показало, что у всех волонтеров этих групп отмечается общая реакция легкой степени. Введение плацебо ранее привитым "Ревакс В" (2 группа 47 добровольцев) не вызывало никаких изменений. Не было отмечено повышения температурной реакции, изменения общего состояния, нарушения со стороны органов и систем, аллергических реакций.

Введение вакцины "Ревакс В" волонтерам вызывало в организме привитых изменения, которые характеризовались местным первичными реакциями. Продолжительность местной реакции у лиц, вакцинированных "Ревакс В", однократно была отмечена в течение 14 суток, при повторном введении препарата местные реакции были выявлены в течение 12 суток. У испытуемых, получивших двукратно "Ревакс В" (1 группа), в большинстве случаев были отмечены папулы. Размеры инфильтрата были более выражены в группе оспенной вакцины (4 группа) и варьировали в пределах 10 40 мм, образуясь практически у всех добровольцев группы, в то время как у лиц, вакцинированных "Ревакс В", инфильтрат был выявлен в 25% случаях, а размеры варьировали в большинстве своем в пределах 10 20 мм.

Таким образом, вакцина "Ревакс В" обладает сниженной по сравнению с вакциной оспенной живой сухой реактогенностью при введении людям, что подтверждает данные доклинического изучения испытуемого препарата.

При исследовании функционального состояния сердечно-сосудистой и легочной систем добровольцев 1 3 групп в динамике отклонений от нормы выявлено не было. При анализе ЭКГ через 5 и через 10 суток после прививки отклонений от физиологической нормы не выявлено.

У волонтеров не были отмечены жалобы, относящиеся к вышеназванным системам, при перкуторном и аускультативном обследовании не было выявлено отклонений от нормы, частота сердечных сокращений и величина артериального давления не выявили изменений.

Пример 3. Изучение клинико-лабораторных показателей крови и мочи.

Изучение клинико-лабораторных показателей крови и мочи проводят по общепринятым методам [23] Результаты представлены в табл. 1 6.

Количество гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, значения цветного показателя, СОЭ у добровольцев всех исследованных групп варьировали в процессе наблюдения в пределах границ физиологической нормы. Количество лейкоцитов по критерию Стьюдента и непараметрическим критериям достоверно возрастает в 1 4 группах на 10, 30 и 60 сутки, что может быть обусловлено неспецифической защитной реакцией организма в ответ на вакцинацию.

Существенных изменений в лейкоцитарной формуле не наблюдается. Достаточно стабильными оказались и количества палочко- и сегментоядерных нейтрофилов, зозинофилов, базофилов и моноцитов у всех волонтеров, независимо от групповой принадлежности. Содержание лимфоцитов у обследованных различных групп было менее стабильным. Так незначительный лимфоцитоз наблюдали у добровольцев 2, 3 и 4 групп на 60 сут после вакцинации, а во 2 группе еще и на 80 сут. Возможно это связано с проявлением выраженного иммунного ответа. Содержание моноцитов несколько повышено в опытных (1 3) группах, но в каждой отдельной точке по времени достоверных отклонений нет.

Проведенные исследования позволяют говорить о том, что клинико-лабораторные показатели крови волонтеров различных групп не выявили статистически значимых различий по сравнению с исходными величинами.

Для оценки состояния функции печени исследовалось содержание в сыворотке крови ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), а также оценивали уровень содержания общего билирубина.

Значения исследованных биохимических параметров у всех волонтеров не выходили за пределы физиологической нормы. Однако необходимо отметить, что у лиц 5 группы на 30 сутки после трехкратной вакцинации значения АСТ достигали верхней границы нормы, тогда как этот показатель у лиц других групп был значительно ниже.

Не зарегистрировано отклонений в анализах мочи у добровольцев всех обследованных групп.

Проведенные исследования не показали какого-либо патологического воздействия вакцины "Ревакс В" на организм привитых лиц.

Пример 4. Изучение иммунологической безопасности вакцины "Ревакс В".

Определение количества Т-, Т-активных и В-лимфоцитов проводят, используя в качестве тест-системы нативные или нагруженные комплементом эритроциты барана [22, 24] Фагоцитарную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов определяют по общепринятому методу, применяя в качестве объекта фагоцитоза частицы латекса диаметром 1,8 2,2 мкм [22, 25] Иммуноглобулины A, G, M определяют методом радиальной иммунодиффузии в агаровом геле [22, 23] Для определения используют моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов человека и стандартные сыворотки крови человека производства НПК "Препарат" при Нижегородском НИИ ЭМ МЗ РСФСР.

Субпопуляцию Т-клеток, обладающую супрессорной и хелперной функцией, определяют методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции с моноклональными антителами на клетках, прикрепленных к стеклу с помощью L-линзы [22] Моноклональные антитела производства Нижегородского НПК "Препарат".

Из анализа иммунологических показателей (табл. 7 12) следует, что за время наблюдения за различными группами добровольцев (6 месяцев) среднее число лейкоцитов и абсолютное содержание Т-лимфоцитов периферической крови не выходили за пределы значений физиологических норм, а по первому показателю и не отличались между опытными группами и группой плацебо.

В то же время отмечено волнообразное изменение числа Т-клеток у волонтеров 1 и 2 группы с максимальным их увеличением на 10 сутки после вакцинации и ревакцинации. Количество Т-активных лимфоцитов у лиц 1 группы также изменялось волнообразно, причем первый пик увеличения совпадал по времени с увеличением количества Т-клеток и наблюдался на 10 сутки после вакцинации, в то время как второе повышение числа активных лимфоцитов запаздывало и было отмечено на 30 сутки после ревакцинации. Этот же показатель у добровольцев 2 группы имел тенденцию к линейному повышению, которое продолжалось до конца наблюдения.

Увеличение числа Т-хелперов и Т-супрессоров у лиц 1 группы выше физиологических норм отмечено на 10 сутки после вакцинации. В дальнейшем после нормализации они были стабильны, и их количества были примерно равными. В остальных группах эти показатели не претерпевали каких-либо существенных изменений.

Количество Т-лимфоцитов у лиц 5 группы повысилось по сравнению с исходными значениями на 10 сутки после трехкратной вакцинации, а к 30 суткам произошло их снижение до первоначальных величин с незначительной тенденцией к дальнейшей супрессии. Т-активные клетки в этой группе привитых оставались стабильными.

В 6 группе (плацебо) и в 4 группе количество Т-лимфоцитов имело тенденцию к равномерному снижению вплоть до конца наблюдения, не выходя в то же время за пределы значений физиологической нормы.

В 4 группе Т-активные клетки превысили нормальные величины на 10 и 60 сутки после вакцинации, в то же время как в 6 группе подобное превышение зарегистрировано на 10, 30, 60 сутки после введения плацебо. Возможно предположить, что здесь сыграли роль сезонные колебания, описанные в литературе [26] Также с этими колебаниями можно связать и кратковременное (на 30 сутки) увеличение числа В-лимфоцитов в 6 (контрольной) группе добровольцев.

В 1 группе волонтеров наблюдали такое же волнообразное увеличение содержания В-клеток, как и Т-лимфоцитов, причем в одни и те же сроки (10 сутки после вакцинации и ревакцинации). К 30 суткам после ревакцинации этот показатель продолжал увеличиваться, превышая значения физиологических норм более чем в 1,5 раза. Это свидетельствует о выраженности иммунного ответа, сопровождавшегося выработкой специфических антител.

Подтверждением этого служит резкое увеличение в этот период содержания Ig G у лиц 1 группы. В отдаленные сроки наблюдения (185 сутки) уровень Ig G, также как и количество В-лимфоцитов, не отличались от исходных значений.

Число В-лимфоцитов у добровольцев 2 группы оставалось достаточно стабильным вплоть до повторного введения плацебо, через 30 дней после которого отмечен пик увеличения их количества. Возможно это связано с неспецифической стимуляцией организма, т. к. в это же время зарегистрировано и увеличение содержания Ig G в крови. В последующие сроки, как и в 1 группе добровольцев, эти показатели нормализовались.

Уровни В-лимфоцитов и Ig G у лиц 4 группы оставались стабильными за все время наблюдения, что нельзя сказать об этих показателях у волонтеров 5 группы, у которых зарегистрировано резкое повышение значений, но в пределах физиологической нормы как В-клеток, так и содержания Ig G на 10 сутки после последней (третьей) вакцинации "Engerix B".

По изменению фагоцитарного индекса, фагоцитарного числа и абсолютного фагоцитарного показателя в исследуемых группах можно сказать, что введение вакцины "Ревакс В" вызывает незначительное снижение фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов, тогда как вакцина "Engerix B" несколько повышает ее.

Таким образом, изучение динамики содержания лейкоцитов и иммунокомпетентных клеток в периферической крови добровольцев позволяет говорить о различном влиянии препаратов на иммунную систему добровольцев.

Необходимо отметить, что вакцина "Ревакс В" не оказывает супрессорного влияния на количественные показатели иммунокомпетентных клеток и функцию кроветворения (лейкопоэз).

Пример 5. Определение ингибирования миграции лейкоцитов.

Исследования проводятся в помощью метода оценки продукции клетками фактора торможения миграции (ФТМ) лейкоцитов, являющихся показателями активности эффектов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Активность ГЗТ эффекторов оценивали по индексу ингибирования миграции (ИИМ) в культурах с поликлональными активаторами фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон А). ИИМ представляет собой отношение разности количеств мигрирующих лейкоцитов в контрольной и опытной (ИИМфга или ИИМкон) культурах к количеству клеток в контрольной культуре, выраженное в процентах.

Лейковзвесь, выделенную стандартным способом, помещают в круглодонную лунку планшета для иммунологических реакций и стимулируют субоптимальной и оптимальной дозами митогенов (ФГА и Кон А), инкубируют 1 час при 4^oC (клетки оседают на дно) и при 37^oC 18 часов (клетки мигрируют вверх по стенкам лунки). После удаления неприлипших клеток подсчитывают количество мигрирующих клеток и вычисляют ИИМ, являющийся показателем способности Т-клеток продуцировать ФТМ под воздействием оптимальной дозы митогена [22] Результаты определений представлены в табл. 13, демонстрирующей изменения ИИМ (в процентах) после вакцинации и ревакцинации волонтеров 1, 2 и 3 групп. Результаты ИИМ после вакцинации (ревакцинации) сравнивались с результатами ИИМ до вакцинации.

После вакцинации выявлено достоверное снижение ИИМфга, особенно через 30 сут после вакцинации с последующим восстановлением до исходного уровня в группах 2 и 3. В группе 1, несмотря на практически полное восстановление ИИМфга, на последнем сроке обследования сохраняются достоверные отличия от значений до введения вакцины "Ревакс В", хотя достоверных различий между группами в этот срок не выявлено. Эти данные свидетельствуют об умеренном влиянии вакцинации (ревакцинации) на активность ГЗТ-эффекторов, стимулированных ФГА, заключающемся в достоверном снижении их способности продуцировать ФТМ с последующим восстановлением до исходного уровня.

Аналогичные результаты получены при исследовании активности ГЗТ-эффекторов, стимулированных Кон А, однако эти изменения менее выражены, носят характер тенденции, поскольку статистически значимые отличия выявлены только на 30 сутки после вакцинации и для группы 1 на 15 и 30 сутки после ревакцинации. Достоверных различий между группами, так же и в случае с ФГА, не выявлено.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод об умеренном снижении активности ГЗТ-эффекторов, стимулированных поликлональными активаторами, на 30 сутки после вакцинации с полным восстановлением их активности к концу исследования.

Пример 6. Определение бласттрансформирующей активности лимфоцитов спонтанной и на воздействие in vitro митогенов (реакция бласттрансформации - РБТЛ).

Мононуклеарные клетки выделяют из гепаринизиров