Рацемические и оптические активные производные тетралина и 7-гидрокситетралина

Рацемические и оптические активные производные тетралина и 7-гидрокситетралина

Реферат

 

Использование: в медицине. Сущность: продукт-производные тетралина ф-лы: R-CH₂-O-тетралин-(YY^')-CH-R^', где R - 2- пиридил, 2-хинолил, R^'-C₁-C₃-алкил, Y и Y^' - вместе образуют карбонильную группу или взятые отдельно Y-водород, Y^'-гидроксил, производные 7-гидрокси-тетралина. 1 табл.

Настоящее изобретение касается замещенных тетралинов, 7-гидрокситетралинов и близких им соединений формулы (1), представленной ниже, которые благодаря ингибированию 5-липоксигеназного фермента и/или блокированию лейкотриеновых рецепторов полезны для предупреждения или лечения астмы, аритмии, псориаза, язвы, инфаркта миокарда и связанных с ними болезненных состояний у млекопитающих. Настоящее изобретение касается также фармацевтических композиций и промежуточных соединений, используемых для синтеза указанных соединений формулы (1).

Крефт и др. в патенте США N 4 661 596 описывают соединения, представляющие собой дизамещенные нафталины, дигидронафталины или тетралины, имеющие формулу: в которой пунктирные лини обозначают возможные двойные связи, R^a представляет собой 2-пиридил, 2-хинолил, 2-пиразинил, 2-хиноксалинил, 2-тиазолил, 2-бензотиазолил, 2-оксазолил, 2-бензоксазолил, 1-алкил-2-имидазолил или 1-алкил-2-бензимидазолил, и R^b представляет собой гидрооксигруппу, низший алкокси или перфторалкил. Как и соединения настоящего изобретения, эти соединения ингибируют липоксигеназный фермент и антагонизируют действия лейкотриена D4 и в связи с этим полезны для предупреждения и лечения астмы. Используемая в данном описании химическая номенклатура соответствует номенклатуре, принятой Международным Союзом теоретической и прикладной химии "Номенклатура органической химии", 1979 г. Изд. "Пергамон Пресс", Нью-Йорк, 1979 г.

Настоящее изобретение касается рацемических или оптических активных соединений, имеющих структурную формулу: (1) в которой n равно 1; Х представляет собой СН₂; X^' представляет собой СН₂; Y и Y^', взятые вместе, образуют карбонильную группу, или Y и Y^', взятые в отдельности, Y представляет собой водород и Y^' представляет собой гидрооксигруппу; Z представляет собой СН₂; Z^' представляет собой СН; R представляет собой 2-пиридил или 2-хинолил; и R^' представляет собой (С₁ C₃)алкил.

С учетом легкости получения и ценной биологической активности предпочтительными являются соединения формулы (1), в которой n, X, X^', Y,Y^' и R^', Z и Z₁ имеют значения, определенные выше, и R¹ представляет собой C₂ или C₃ алкил. Самыми предпочтительными являются рацемические или оптически активные соединения, имеющие относительную стереохимическую формулу: особенно те рацемические или оптически активные соединения формулы (II) или (III), в которых Х и Х¹ каждый представляет собой CH₂, R представляет собой 2-пиридил или 2-хинолил и R¹ представляет собой н-пропил, а также пара оптически активных энантиомерных соединений формулы (III), в которой Х и Х¹ каждый представляет собой CH₂, R представляет собой 2-хинолил и R¹ представляет собой н-пропил.

Настоящее изобретение описывает также фармацевтические композиции для ввода в организм млекопитающих животных, которые содержат соединение формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель; и способ ингибирования 5-липоксигеназного фермента и/или блокирования лейкотриеновых D4 рецепторов в организме млекопитающих животных с целью предупреждения или лечения астмы (особенно у мужчин), артрита, псориаза, язвы желудочно-кишечного тракта или инфаркта миокарда.

И, наконец, настоящее изобретение касается ценных промежуточных соединений структурной формулы: в которой n, X, Z и Z¹ имеют те же значения, что определены выше; Y² и Y³, взятые вместе, образуют карбонильную группу, или Y² и Y³, взятые в отдельности, Y² представляет собой водород и Y³ представляет собой гидроксигруппу; и R^a представляет собой гидроксигруппу.

Настоящее изобретение практически легко осуществимо.

Соединения формулы (1), в которых Y + Y^' карбонил, или Y представляет собой Н и Y^' представляет собой ОН, и Х¹ представляет собой CH₂, независимо от того, являются ли они геометрическими (цис-транс) или оптическими изомерами, получаются путем химических превращений, показанных на схемах 1 и 2, в которых n, X, Z, Z¹, R и R¹ определены выше. Ниже подробно обсуждаются различные химические превращения, представленные на данных схемах, а также химические превращения, необходимые для получения соединения формулы (1) с другими значениями и Y, Y^' и X¹, и способы разделения цис-транс и оптических изомеров.

Конденсация согласно схеме 1 обычно осуществляется с фенольной группой в защищенной форме, как это показано, причем металл является предпочтительной защищающей группой. Согласно предпочтительным условиям используется молярный избыток требуемого альдегида и молярный избыток вторичного амина, такого как пирролидин или пиперидин в качестве основания. Такое основание облегчает конденсацию за счет образования енаминового промежуточного соединения.

Данная реакция обычно осуществляется в инертном к реализационной смеси растворителе, причем особенно подходящим растворителем для данной цели являются низшие спирты, такие как метанол. Температурные условия данного химического превращения не являются критическими, обычно они составляют от 0 до 70^oC, и особенно подходящей является комнатная температура.

Под термином "инертный к реакционной среде растворитель" имеется в виду растворитель, который не взаимодействует с исходными веществами, химическими реагентами, промежуточными продуктами или конечными продуктами таким образом, чтобы отрицательно влиять на выход желаемого продукта.

С-Алкилирование, согласно схеме 1, осуществляется путем превращения сначала кетона (А) в его литиевую соль, обычно in situ, путем воздействия в основном одного молярного эквивалента сильного пространственно затрудненного основания, такого как диизопропиламид лития, осуществляемого обычно при низкой температуре (например, примерно от -40 до -80^oC, обычно при температуре бани сухой лед-ацетон). Данную соль, в свою очередь, подвергают взаимодействию с алкилирующим реагентом, предпочтительно высоко реакционноспособным иодидом, обычно в молярном избытке, в присутствии молярного избытка гексаметилфосфорамида, теперь уже при более высокой температуре (например, примерно от 0 до 40^oC). Последние указанные реагенты удобным образом вводятся в холодный раствор литиевой соли, и температуре дают возможность повышаться до комнатной по мере протекания реакции. Реакции получения соли и алкилирования обычно осуществляются в одном и том же инертном к реакционной смеси растворителе (например, тетрагидрофуране). Для специалистов в данной области должно быть ясно, что любые свободные гидрокси- или карбоксигруппы в алкилирующем реагенте должны быть в защищенной форме.

Преобразования с помощью каталитического гидрирования (дебензилирование, ввод Н₂ в двойную связь) согласно схемам 1 и 2 осуществляются в обычных условиях, обычно в инертном к реакционной смеси растворителе, и предпочтительно с использованием в качестве катализатора благородного металла, и в условиях умеренной температуры (например, примерно от 0 до 70^oC и под давлением водорода (например, под давлением примерно от 1 до 10 атмосфер). Хотя в отдельных случаях могут быть желательны более высокие давления, указанные умеренные давления позволяют использовать значительно меньшие затраты труда и менее дорогостоящее оборудование.

Подходящими для данной цели металлическими катализаторами являются платина, палладий, рений, родий и рутений, либо на носителе, либо без носителей, а также известные их каталитические соединения, такие как оксиды, хлориды и т.д. Примерами подходящих носителей катализаторов являются углерод, двуокись кремния, сульфат бария. Катализаторы могут быть приготовлены непосредственно в условиях рабочего процесса путем предварительного восстановления подходящей соли каталитического соединения.

Примерами предпочтительных катализаторов являются 5% палладдий на угле, 5% платина на угле, 5% родий на угле, хлорид платины, хлорид палладия, оксид платины и оксид рутения.

Наиболее предпочтительным катализатором согласно изобретению является палладий на угле. Подходящими растворителями для процесса гидрирования являются низшие алканолы, этилацетат и тетрагидрофуран.

Простые метиловые эфиры [соединения формулы (С)] согласно схеме 1 деблокируются с образованием соответствующего фенольного производного также общепринятыми способами; так, например, они деблокируются с использованием концентрированных НВr или ВВr₃.

Фенольное алкилирование, как показано на схеме 2, представляет собой обычную реакцию нуклеофильного замещения.

Данная реакция обычно осуществляется в присутствии основания достаточной крепости и взятого в количестве, по меньшей мере достаточном для нейтрализации кислотного побочного продукта (НХ²).

В тех субстратах, которые содержат алифатическую спиртовую группу (например, соединение IV, в котором Y² представляет собой Н и Y³ представляет собой ОН), обычно используются основания достаточной крепости для превращения данной группы в анион, в количестве не большем, чем достаточное для превращения более кислотного фенола в соль. Когда любой из данных реагентов содержит группу с кислотностью, аналогичной или превышающей кислотность соединения нуклеофильного замещения, то также потенциально участвующие в процессе группы желательнее всего вводить в защищенной форме (например, гетероароматическая фенольная группа в виде метокси- или бензилоксигруппы, карбоксильная группа в виде сложного метилового или бензилового эфира, удаляемые путем гидролиза или гидрогенолиза согласно подробно описанным здесь примерам).

Данные реакции нуклеофильного замещения осуществляются в инертном к реакционной среде растворителе, предпочтительно таком, который имеет меньшую кислотность, чем вытесняющий фенол, спирт или меркаптан. Наиболее предпочтительными являются полярные апротонные растворители, такие как диметилформамид или ацетон, обычно с молярным избытком более легко доступного из двух реагентов. Температура не является критически важным фактором, обычно удовлетворительной является температура в пределах примерно от 10 до 70^oC, и наиболее желательна комнатная температура. Согласно одному из предпочтительных вариантов, фенол, спирт или меркаптан необратимо превращается в анион с помощью основания, такого как гидрид натрия. Согласно другим предпочтительным вариантам, в качестве основания используется К₂CO₃ в присутствии NaI; или используется Cs₂CO₃ в присутствии CsI.

Реакция "восстановления" согласно схеме 2 требует восстановления кетона во вторичный спирт, для чего доступны ряд реагентов избирательного действия. В случае, когда отсутствуют какие-либо другие группы, восстанавливаемые с помощью LiAlH₄ (такие как карбокси- или метоксикарбонил), данный реагент вполне подходит для данной цели. С другой стороны, когда присутствуют такие группы, в качестве восстанавливающего реагента предпочтительным является NaBH₄. В любом случае гидридные восстановления обычно осуществляются в инертном к реакционной смеси растворителе (таким как тетрагидрофуран в случае LiAlH₄, метанол или сочетание метанол/тетрагидрофуран в случае NaBH₄). В любом случае температура не является критической, обычно вполне удовлетворительна температура в пределах от 0 до 50^oС, и наиболее предпочтительна комнатная температура. Данный этап восстановления обеспечивает возможность получения смеси цис- и трансизомеров (как иллюстрировано формулами (II) и (III), и при данном гидридном восстановлении обычно наблюдается данный результат. Если особенно желателен один из этих изомеров, то обычно определяются такие условия восстановления, которые благоприятствуют образованию желаемого изомера. Так, например, восстановление NaBH₄ в присутствии хлорида цезия обычно благоприятствует образованию цис-изомера. Каталитическое гидрирование обычно также является желательным способом восстановления, и, как правило, оно осуществляется в условиях, которые несколько более жесткие, чем описанные выше (например, более продолжительное время, более высокое содержание катализатора, более высокие температура и/или давление).

Гидрирование осуществляется предпочтительно на таких субстратах, как (V) которые не содержат никакой другой легко гидрируемой группы. Катализатор Pd/C благоприятствует образованию цис-изомера. Однако в результате изменения условий и замены катализатора эту тенденцию можно модифицировать и даже изменить на обратную.

В случае, когда, согласно данному изобретению, образуются и цис и транс-изомер одновременно, обычно они могут разделяться стандартными химическими приемами (например путем избирательной или фракционной кристаллизации, хроматографии и т.д.).

Те кетоновые соединения формулы (I) или (IV), в которых Y и Y¹ или Y² и Y³ образуют карбонильную группу, содержат асимметричный атом углерода в альфа-положении, которое смежно с карбонильной группой, и, следовательно, являются рацемическими соединениями, способными к разделению на оптически активные энантиомеры путем, например, превращения рацемата в диастереоизомерные соли с оптически активной кислотой, которые обычно способны разделяться путем фракционной кристаллизации.

Как возможный вариант, если данный субстрат содержит карбоксильную группу, то образуются разделяемые диастереоизомерные соли с оптически активным органическим амином. Оптическая активность может индуцироваться также использованием оптически активного реагента на данной стадии, в результате чего образуется асимметричный атом углерода, например в результате использования оптически активного катализатора типа катализатора Уилкинсона, или благородного металла, нанесенного на оптически активный носитель, при осуществлении гидрирования. Оптически активные кетоны также могут быть получены путем обычного повторного окисления оптически активного спирта, описываемого в следующем абзаце, например, путем окисления Джоунса, пример которого приводится ниже.

Гидроксисоединения формулы (I) и (IV), где V (или Y² представляют собой водород и Y¹ (или Y³) представляет собой ОН, содержат два таких асимметричных атома углерода, соответствующих двум рацематам и четырем оптически активным соединениям. Один из этих рацематов является указанным выше цис-изомером и другой является транс-изомером. Каждый из этих рацематов способен к разделению на пару энантиомеров через диастереоизомерные соли, как подробно разъяснено выше. Однако желательно превращение данного рацемического спирта в соответствующие диастереоизомерные сложные эфиры или уретаны, образуемые с оптически активными кислотой или изоцианатом. Такие производные соединения с ковалентной связью обычно подвергаются различным способам разделения (например, хроматографии), отличным от способов разделения диастереизомерных солей.

Эти диастереоизомерные сложные эфиры образуются из спиртов и оптически активных кислот стандартными способами, обычно способами, включающими активацию кислоты, например хлорангидрида, смешанного ангидрида с алкилхлорформатом, или с дегидративным агентом сочетания, таким как дициклогексилкарбодиимид.

Предпочтительной оптической активной кислотой в данном случае является S-O-ацетилминдальная кислота. После разделения образующихся диастереоизомерных сложных эфиров путем, например, хроматографических методов, они гидролизуются общепринятыми способами, например водной кислотой или водным основанием, и в результате получаются энантиомерные оптически активные спирты.

Пролекарственные сложные эфиры данного изобретения получаются способами, аналогичными способам, используемым для синтеза сложных эфиров, как описано выше. Сложные эфиры с альфа-аминокислотами, включающими природные L-аминокислоты, обычно получаются из подходящей аминокислоты, в которой альфа-аминогруппа, группы заместителя NH₂ или NH (например, лизин, орнитин, аргинин, гистидин, триптофтан), гидроксигруппы (серин, гомосерин, треонин, тирозин), меркаптогруппы (цистеин) и карбоксигруппы (глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота) находятся в защищенной форме (например N-бензилоксикарбонил, О- и S-бензил), которые обычно удаляются путем каталитического гидрирования в следующей стадии. Аналогичным образом, в случае сложных эфиров с первичным или вторичным аминозаместителями данные кислоты будут образовывать сопряженные соединения с защищенными аминогруппами. Такая защита, безусловно, не является обязательной в случае с кислотами, содержащими третичные аминозаместители. И, наконец, карбокси замещенные сложные эфиры наилучшим образом получаются из циклического ангидрида Что касается биологической активности соединений, отвечающих данному изобретению, то известно, что арахидоновая кислота метаболизируется в организме млекопитающих животных двумя различными путями, один из которых приводит к образованию простагландинов и тромбоксанов и другой приводит к различным окислительным продуктам, называемым лейкотриенами, которые обозначаются буквенно-цифровым сочетанием, например Б4, С4 и D4. Первый этап данного окислительного пути это окисление арахидоновой кислоты под воздействием 5-липоксигеназного фермента, фермента, который обычно ингибируется соединениями /1/, отвечающими данному изобретению, блокируя таким образом синтез всех лейкотриенов. Он как таковой обеспечивает механизм, позволяющий использовать данные соединения для лечения или предупреждения астмы (когда LTC4 и LTD4 являются медиаторами при воспалениях), артрита (когда LTB4 является медиатором при воспалении), псориаза (когда LTB4 является медиатором), язв (когда LTC4 и LTD4 являются медиаторами) и инфаркта миокарда (когда LTB4 является медиатором). Повышение этой ингибирующей фермент активности проявляется в обычной способности данных соединений антагонизировать лейкотриен D4 (то есть блокировать рецепторы LTD4). Обычно данные соединения антагонизируют также лейкотриен В4. Информацию по лейкотриенам можно получить в публикации: Bailey и др. Ann. Reports Med.Chem. стр.203 217 1982 г.).

Активность соединений формулы (1) в условиях "ин витро" определяется при следующем испытании. Клетки RBL-1, сохраняемые в форме монослоя, выращиваются в течение 1 или 2 дней в тканевой культуре в минимальной основной среде (Eagle) с солью Earl плюс 15% эмбриональной бычьей сыворотки, дополненной антибиотическим (противогрибковым раствором (GIBCO). Клетки один раз промываются RPMI 1640 (GIBCO) и повторно суспендируются в RPMI 1640 плюс 1 микромолярный глютатион до клеточной плотности 1 х 10 клеток/мл. 0,5 мл этой клеточной суспензии инкубируется при 30>198>C вместе с 0,001 мл диметоксисульфоксидного раствора лекарства в течение 10 минут. Реакция начинается при одновременном вводе 0,005 мл (14С) арахидоновой кислоты в этаноле и 0,002 мл А23187 в диметилсульфоксиде до получения конечных концентрация соответственно 5,0 и 7,6 микроМол. После инкубирования в течение 5 минут при температуре 30^oС реакция прекращается при вводе 0,27 мл ацетонитрила/уксусной кислоты (100/0,3) и данная среда осветляется путем центрифугирования. Осуществляется анализ распределения продукта путем инжекции 0,2 мл осветвленного поверхностного слоя от центрифугирования в колонку жидкостной хроматографии высокого разрешения. Разделение радиоактивных продуктов осуществляется в радиальной колонке РАХ CN (внутренним диаметром 5 мм, Waters) с использованием системы растворителей ацетонитрил (Н₂O) уксусная кислота (0,1%) с линейным ацетонитрильным градиентом от 35 до 70% в течение 15 минут со скоростью 1 мл/мин. Количественное определение осуществляется с использованием регистрирующего устройства радиоактивности Бертольда, снабженного встроенным интегратором и ячейкой потока объемом 0,2 мл. Омнифлер 2,4 мл/мин (NEN) с колонкой для потока. Суммарные единичные дозы для каждого продукта рассчитываются как процент от общих суммарных доз и затем сопоставляются со средними контрольными значениями. Данные результаты выражаются как "процент подавления" и выражаются в виде кривых зависимости от логарифма концентрации лекарства. Значения 1С₅₀ определяются графически (см.таблицу).

Для соединения известного из патента США 4 661 596 значение 1С₅₀ ингибирования фермента липоксигеназы составляет 50 микроМол, что примерно в 5 10 раз меньше активности, проявляемой соединениями настоящего изобретения.

Проводили испытание рецептора лейкотриена 4 (LTD4) с определением способности соединения конкурировать с радиомеченным LTD4 для специфических точек рецептора LTD4 на легочных оболочках морской свинки. В этом испытании морские свинки в возрасте 3 4 недели акклиматизировались в стандартных условиях в течение 3 дней, после чего они умерщвлялись. Конечный возраст свинок составлял 24 31 день. Морских свинок оглушали ударом по задней части шеи и обескровливали путем выреза сонной артерии. Раскрывали полость грудной клетки и легкое удаляли, промывали в 50 мМол. буфера Трис (рН 7,0) и помещали в чистый буферный раствор. В данной и во всех последующих операциях все ткани и буферные растворы выдерживались на льду в процессе препарирования, и все операции центрифугирования осуществлялись при температуре 4^oС. Ткани бронхов и соединительные ткани извлекались из легких. Данная ткань взвешивалась и помещалась в 50 мл поликарбонатные пробирки с буферным раствором в соотношении 1 г ткани/3 мл буферного раствора. Ткань гомогенизировалась посредством устройства Тиссьюмайзера Текмана при полной скорости в течение 30 секунд и центрифугировалась во вращающемся устройстве Sovall SS-34 со скоростью вращения 3250 об/мин в течение 15 минут. Поверхностный слой центрифугировался со скоростью 1900 об/мин в течение 10 минут. Полученный спрессованный осадок снова суспендировался в буферном растворе с использованием гомогенизатора Тиссьюмайзера со средней скоростью (позиция 75) в течение 10 секунд. Эта новая суспензия снова центрифугировалась со скоростью 19000 об/мин в течение 10 минут. Образующийся осадок снова суспендировался с использованием устройства Тиссьюмайзера с небольшой скоростью (позиция 50) в течение 10 секунд в 1 мл буферного раствора на грамм исходной ткани. Эта конечная суспензия перемешивалась при температуре 4^oC с одновременным отбором аликвот в полипропиленовые пробирки и выдерживалась при -70^oC. В полистирольную пробирку вводились следующие компоненты: (1) 25 мкл одного из следующих: А. Диметилсульфоксид (для определения общего связывания).

В. 1 микроМол.LTD4 (для определения неспецифического связывания).

С. 30 наноМол 100 микроМол соединения в диметилсульфоксиде.

(2) 0,025 мл 3Н-LTD4 (с удельной активностью 30 60 Ci/мМол) в 50 мМол буфера Трис (рН 7,0) + 10 микроМол L-цистеина (12000 15000 срm/0,025 мл).

(3) 0,2 мл разбавленного мембранного препарата (1 Мг/мл) (препарат разбавлялся в 50 микроМол. буферного раствора Трис + MgCl₂, так чтобы в 200 микрол. белка достигалась концентрация MgCl₂ 10 микроМол).

Эти реакционные пробирки инкубировались при 25^oC в течение 30 минут. В каждую пробирку вводили 4 мл холодного буферного раствора Трис + 10 микроМол MgCl₂. Содержимое их быстро фильтровалось через фильтр Ватмана GF/C в разделительном устройстве Yeda. Фильтр трехкратно промывался четырьмя миллилитрами буферного раствора Трис-MgCl₂. Этот фильтр переносился в сцинтилляционную ампулу. В ампулу вводилась ультрафлюоресцентная сцинтилляционная жидкость. Ампула закрывалась, подвергалась завихряющему движению и подвергалась детектированию в течение трех часов. Процент специфического связывания рассчитывался с помощью следующей формулы: SB (X NSB)/(TB NSB), где Х cpm отсчетов в минуту образца; NSB cpm отсчетов в минуту неспецифического связывания; ТВ срm отсчетов в минуту общего связывания.

Процент специфического связывания представлен графически как функция концентрации соединения. 1С₅₀ является концентрацией, при которой имеет место 50% SB. Кi рассчитывается по следующей формуле: Ki (IC₅₀)/[1+(L/Kd)] где L концентрация вводимого лиганда (микроМол) срm ввода/срm 1 микроМол 3Н-LTD4; Кd 1 микроМол (константа диссоциации).

Человеческие нейтрофильные лейкоциты используются для измерения конкуренции испытываемых молекул с (3Н)-LТB4 для связывания в рецепторе LTB4. В данном испытании нейтрофилы отделяются от гепаринизированной человеческой периферической крови (обычно 100 мл) с использованием градиента Hypagye-Ficoll (плотностью 1,095 г/мл). Для повторного суспендирования клеток используется уравновешенный солевой раствор Хэнка (HBSS), содержащий 0,1 г/100 мл альбумина бычьей сыворотки (HBSS BSA). Этот одноэтапный процесс Hypague-Ficoll дает высокочистую популяцию нейтрофил (более чем 95%). Клеточная жизнеспособность определяется по эксклюзии красителя трипанового синего (должно быть более 95%), и функциональное единство нейтрофил определяется по восстановлению нитросинего тетразолиевого (должно быть более чем на 85% положительным). Подвергаемые испытанию соединения растворяются в диметилсульфоксиде до концентрации 100 микроМол. Эти растворы разбавляются в 500 раз с использованием HBSS-BSA. 100 микроМолярная концентрация лекарства достигается путем ввода разбавления образца в аликвоте (0,5 мл) в реакционную пробирку. Приготавливается ряд разбавленных растворов 1 3 и 1 5 (принятым образом), и алюквата (0,5 мл) этих разбавленных растворов вводится в инкубационную пробирку. В боросиликатные пробирки (12 х 75 мм) вводится (3Н) LTBA/NEN: удельная радиоактивность более чем 180 Сi/мМол; 0,005 мл в абсолютном этаноле). Затем вводится 0,5 мл лекарственного раствора (см.выше). Реакция связывания инфицируется путем добавления 0,5 мл охлажденных льдом нейтрофил с клеточной плотностью (5 х 10⁶ клеток/мл) и продолжается при температуре 4^oC в течение 30 минут. Инкубация прекращается путем быстрой фильтрации через фильтр Ватман GF/C стекло с отделением свободного от связанного радиоактивного меченного лиганда. Эти фильтры трехкратно промываются охлажденным льдом HBSS, высушиваются, помещаются в 4 мл ультрафлюор и подвергаются индикации. Общее связывание определяется как СРМ, присутствующий на фильтре (клеточно ассоциированный), когда радиоактивно меченный лиганд инкубируется с нейтрофилами при отсутствии какого-либо конкурирующего агента. Неспецифическое связывание получается путем инкубации клеток с радиоактивно меченным лигандом плюс 1 микроМол. нерадиоактивно меченного LTB4. Специфическое связывание является суммарным связыванием СРМ, скорректированным на неспецифическое связывание СРМ. Каждая пробирка корректируется на неспецифическое связывание. Точки полумаксимального смещения радиоактивного меченого лиганда определяются путем графического анализа полулогарифмической кривой процента специфического связывания (при отсутствии какого-либо конкурента) в зависимости от концентрации.

Для оценки соединений формулы (1) в условиях "ин виво" они испытываются путем так называемого анализа на летальность PAF.

Материалы для испытания.

Мыши: самцы разновидности CD1, все примерно одинакового веса (примерно по 26 г), по 12 штук на группу.

Носитель для дозирования лекарства, вводимого орально: EES (5% этанол, 5% эмульфор, 90% солевой раствор). Выдерживается при комнатной температуре.

Лекарства: для обычного отбора дозой 50 мг/кг 20 мг лекарства растворяются в 4 мл EES с использованием ультразвукового воздействия в ультразвуковой ванне или измельчения в измельчающем устройстве Ten Broech для растворения лекарства, если это необходимо. Если растворимость все еще остается проблемой, то лекарство используется в форме суспензии.

Носитель для внутривенной инъекции; солевой раствор вместе с 2,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA, Cигма A 4378) и 0,05 мг/мл пропранолола (Сигма H 0884). Ежедневно приготавливается свежая порция и выдерживается при комнатной температуре. Фактор активирования промбоцитов (РАF): приготавливается 10 микроМол. основной раствор путем растворения 1 мн PAF (Calbiochem 429460) в 0,18 мл этанола. Этот раствор выдерживается при -20^oC и разбавляется в носителе в день использования. Концентрация используемого PAF регулируется таким образом, чтобы при вводе дозой 0,1 мл/10 г тела умерщвлялось примерно 80% необработанных контрольных организмов. Это обычно составляет 0,028 г/кг (разбавление основного раствора от 1 до 2034). Раствор приготавливается в стеклянных емкостях и используется посредством стеклянных шприцов для уменьшения до минимума адгезии PAF. Он выдерживается при комнатной температуре. Положительный контроль: Используется фенидон в количестве 25 мг/кг (его приблизительная доза ED50).

Метод.

За 45 минут до инъекции PAF мыши обрабатываются путем орального ввода лекарства в количестве 0,1 мл/10 г тела. Через 35 40 минут их помещают под воздействие обогревающей лампы для расширения хвостовой вены для инъекции PAF. PAF вводится путем внутривенной инъекции в количестве 0,1 мл/10 г веса тела, и смерть обычно наступает в течение 30 минут, редко по прошествии 60 минут. Результаты выражаются как процент смертности в сравнении с контрольными результатами. Ввиду того, что данный анализ чувствителен к эндогенным катехоламинам (например, защита мышей бета- агонистами), то для разрешения этой возможной проблемы используется пропранолол. Он помогает также, если мыши акклиматизируются к комнатным условиям до испытания и если комнатные шумы и температура сохраняются умеренными и постоянными. Расстояние от нагревательной лампы должно устанавливаться таким, чтобы расширение сосудов происходило без создания видимого стресса на мышей. Голодание мышей должно быть исключено.

Вариации.

1. Время для орального дозирования может быть изменено.

2. Внутривенный ввод дозированного лекарства возможен за счет совместной инъекции лекарства и PAF в том же объеме и в том же носителе, что указаны выше. Для совместной инъекции PAF приготавливается в двойной концентрации от желаемой концентрации в солевом растворе вместе с BSA и пропанололом, как указано выше, и лекарство приготавливается в двойной концентрации от желаемой концентрации в том же носителе. Оба препарата смешиваются в равных объемах непосредственно перед инъекцией.

Для использования с целью профилактики или лечения астмы, артрита, псориаза и язвы желудочного тракта у млекопитающих животных, в том числе человека, соединение формулы (1) дается в количестве, ингибирующем 5-липоксигеназу и/или блокирующем лейкотриеновый рецептор, составляющем примерно 0,5 50 мг/кг/день в виде единичной или разделенных дневных доз. Более предпочтительный дозированный предел составляет от 2 до 20 мг/кг/день, хотя в отдельных случаях по решению лечащего врача могут потребоваться дозы за указанными пределами. Предпочтительным способом введения лекарства является оральный, но в отдельных случаях предпочтителен парэнтеральный ввод (например внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, например в тех случаях, когда впитывание лекарства при оральном вводе снижается под влиянием заболевания, или когда пациент не в состоянии проглотить лекарство.

Соединения, отвечающие данному изобретению, обычно вводятся в форме фармацевтических композиций, включающих по меньшей мере одно из соединений формулы (1), вместе с фармацевтически пригодным носителем или разбавителем. Такие композиции обычно приготавливаются общеизвестным образом с использованием твердых или жидких носителей или разбавителей, как принято для подходящего способа ввода: для орального ввода форме таблеток, твердых или мягких желатиновых капсул, суспензий, гранул, порошков и т.д. и для парэнтерального ввода в форме инъекционных растворов или суспензий и т.д.

Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации данного изобретения.

Пример 1.

6-(2-Хинолил)метокси-4-хроманон.

Смесь 6-окси-4-хроманона (10,0 г, 0,0609 моля), 2-хлорметилхинолина (11,9 г, 0,0670 моля), иодида натрия (109 г, 0,0670 моля), карбоната калия (25,3 г, 0,183 моля) и ацетона (200 мл) нагревается с обратным холодильником в течение ночи в атмосфере N₂. По прошествии 17 часов смесь становится светлее и анализ методом тонкослойной хроматографии (10% этилацетата) CH₂Cl₂ показывает полное превращение исходного продукта в несколько менее полярный продукт. Смесь охлаждается, фильтруется и фильтрат концентрируется в вакууме. Остаточный продукт концентрирования растворяется в этилацетате (400 мл), промывается Н₂О и солевым раствором, высушивается над MgSO₄ и концентриpуется в вакууме до темнокоричневого масла. После очистки в колонке с силикагелем при элюировании смесью 10% этилацетата (CH₂Cl₂) получается желаемый продукт в виде беловатого твердого вещества, 15,3 г (82%), точка плавления 112 114^oC; анализ методом тонкослойной хроматографии (этилацетат:CH₂Cl₂ в соотношении 1:9), Rf 0,30.

Пример 2.

3-Оксиметилен-6-(2-хинолил)метокси-4-хроманон.

В раствор желаемого продукта предыдущего примера (7,00 г, 0,0229 моля) и избытка этилформата (35 мл) в толуоле (80 мл) при комнатной температуре вводят отдельными порциями в течение 5 минут 2,2 г (0,0458 моля) 50% гидрида натрия в минеральном масле. Желтовато-зеленая смесь перемешивается при комнатной температуре в течение 5 минут, затем добавляется 2 капли этанола для инициирования реакции. В течение 5 минут смесь превращается в красно-оранжевую с выделением газа и является слабо экзотермической. Эта смесь перемешивается при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего, как показывает анализ методом тонкослойной хроматографии (5% CH₃OH/CH₂Cl₂), исходный материал полностью превращается в более полярный продукт. Эта реакционная смесь вливается в 400 мл ледяной воды, величина рН доводится до 5 посредством 2 нормальной HCl, и она экстрагируется этилацетатом (500 мл). Органический слой промывается водой и солевым раствором, высушивается над MgSO₄ и концентрируется в вакууме до образования пастообразного желтого твердого вещества. После повторного перемешивания с гексаном с целью удаления минерального масла получается желаемый продукт с выходом 85% тонкослойная хроматография (CН₃OH CH₂Cl₂ 1:19), Rf 0,40.

Пример 3.

3-Диазо-6-(2-хинолил)метокси-4-хроманон.

В растворе конечного продукта предыдущего примера (7,60 г, 0,023 моля) и сухого триэтиламина (6,4 мл, 0,046 моля) в сухом СН₂Cl₂ (100 мл) при температуре -30^oС (баня с смесью сухой лед ацетон) вводят по каплям в течение 20 минут раствор азида толиза (4,5 г, 0,023 моля) в CH₂Cl₂ (25 мл). Реакционная смесь медленно нагревается до комнатной температуры в течение ночи при перемешивании. По прошествии 18 часов, как показывает тонкослойная хроматография (20% этилацетата (CH₂CLl₂) происходит полное исчезновение исходного материала и образование менее полярного продукта. Эта смесь обрабатывается 1 нормальной NaOH (100 мл) и перемешивается в течение 10 минут. После обработки солевым раствором слои разделяются и органический слой разбавляется 200 мл этилацетата. Затем метиленхлорид удаляется в вакууме. Этилацетатный остаточный продукт промывается водой и солевым раствором, высушивается над MgSO₄ и концентрируется в вакууме, и в результате получается конечный желаемый продукт в виде темно-желтого твердого вещества, 6 г (90%); анализ методом тонкослойной хроматографии, (этилацетат: CH₂Cl₂ 1:4), Rf 0,27.

Пример 4.

3-Циклогексилокси-6-(2-хинолил)метокси-4-хроманон.

В суспензию конечного продукта предыдущего примера (1,50 г, 4,53 моля) и циклогексанола (1,7 мл, 16,4 ммоля) в сухом толуоле (25 мл) при температуре 70^oС вводится 5 мг димера ацетата родия (2-вал). В ходе реакции быстро выделяется N₂ и смесь становится гомогенной. Анализ методом тонкослойной хроматографии (20% э