Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707, f(ab)-фрагмент моноклонального антитела, продуцируемого штаммом гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707, f(ab)*002-фрагмент моноклонального антитела, продуцируемого штаммом гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707, штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., продуцирующий моноклональное антитело и способ получения штамма гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707

Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707, f(ab)-фрагмент моноклонального антитела, продуцируемого штаммом гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707, f(ab)*002-фрагмент моноклонального антитела, продуцируемого штаммом гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707, штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., продуцирующий моноклональное антитело и способ получения штамма гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l. есасс n 90110707

Реферат

 

Использование: биотехнология, иммунологическое определение альфа-фактора некроза опухолей (-ФНО) человека в биологических жидкостях организма. Сущность: получение моноклонального антитела (МКА), взаимодействующего с -ФНО человека, его фрагментов и штамма гибридных клеток, продуцирующего указанное антитело. Штамм получают при слиянии спленоцитов мышей, иммунизированных -ФНО человека, с клетками миеломы NSO. Продуцируемое этим штаммом МКА, а также его фрагменты с высоким сродством взаимодействуют с -ФНО человека и нейтрализуют его действие в условиях in vitro. 5 с. п. ф-лы, 6 ил., 10 табл.

Это изобретение относится к биотехнологии, в частности к моноклональному антителу, которое имеет высокую нейтрализующую активность против фактора альфа некроза человеческой опухоли (-ФНО), а также нейтрализующую активность против фактора бета человеческого фактора некроза опухоли (-ФНО), гибридной клеточной линии, которая продуцирует это антитело и использованию моноклонального антитела.

-ФНО представляет собой полипептид с молекулярным весом 17500, у которого выявлены первичная и третичная структура (1-2). -ФНО является биологически активным в виде тримера. Основным источником -ФНО являются поколения моноцит/макрофаговых клеток, но после соответствующей стимуляции он также хорошо продуцируется другими типами клеток (например Т-лимфоцитами).

-ФНО является полипептидом, весьма родственным к -ФНО. Обе молекулы демонстрируют 28% гомологии на аминокислотном уровне (3). Основным источником -ФНО являются Т-лимфоциты.

-ФНО был первоначально описан как молекула, которая вызывает кровоизлиятельный некроз опухолей в мышах. Однако после того, как стали доступны большие количества гомогенного -ФНО посредством клонирования его к ДНК, вскоре стало ясно, что -ФНО обладает большим множеством биологических активностей (4).

-ФНО обладает множеством аналогичных биологических активностей, однако были описаны количественные различия относительно дозировок -ФНО и -ФНО, необходимых для их биологической активности.

При воспалительной реакции -ФНО играет центральную роль в защите клетки-хозяина от вторжения в организм вредных агентов. Однако при некоторых обстоятельствах, таких как хроническое или острое, системное или локализованное перепроизводство в сочетании с другими медиаторами воспалительной реакции -ФНО приводит к большому числу патологических состояний. Наиболее известными примерами являются истощение и септический шок (4-5). Вероятно -ФНО, как предполагают, играет патогенную роль при заболевании СПИД (6), при противопоказаниям к прививке (7), при церебральной малярии (8), при ревматоидном артрите (9) и некоторых других болезненных состояниях.

Гораздо менее известно об эффектах -ФНО в живом организме. Однако при наличии факта, что он обладает вне организма биологическими активностями, аналогичными таковым для -ФНО, можно утверждать, что в случае сверхпроизводства -ФНО также может вносить свой вклад в патогенез некоторых болезненных состояний.

Эти результаты позволяют предположить, что антитела против -ФНО, а также возможно антитела против -ФНО могут быть терапевтически полезными при тех болезненных состояниях, в которых эти полипептиды проявляют патогенный эффект.

Для того, чтобы антитела против -ФНО были терапевтически эффективны, они должна обладать способностью нейтрализовать токсические эффекты -ФНО в живом организме. Поликлональные антитела легко могут быть получены из сыворотки гипериммунизованных животных. Однако эти препараты поликлональных антител не являются оптимальными для использования в живом организме, вследствие того что они являются смесью антител, содержащей антитела, которые не нейтрализуют -ФНО, они являются смесью антител, содержащей различные антитела, имеющие различающиеся степени сродства для одинаковых эпитопов, и они трудно стандаpтизуются в смысле потенциала, из-за изменений от случая к случаю.

Выбранным средством для устранения этих проблем является технология моноклональных антител. Она позволяет продуцировать вне организма при контролируемых условиях и в неограниченных количествах моноклональные антитела с воспроизводимой специфичностью и степенью средства против -ФНО, как и против любой иммуногенной молекулы. Ясно, что против отдельного антигена можно получить много различных моноклональных антител. Они могут различаться друг от друга в терминах: класса и подкласса антитела, эпитопной специфичности, cвязывающего сродства и нейтрализующей активности вне и внутри организма.

Для терапевтического использования желательно использовать моноклональное антитело против -ФНО, как и против любого другого антигена, который обладает высокой нейтрализующей активностью. Это может дать возможность назначения меньших дозировок моноклонального антитела для достижения терапевтически эффективных уровней в живом организме, таким образом смягчаются возможные, нежелательные побочные эффекты, вызванные моноклональным антителом.

Однако настоящее изобретение предоставляет новое моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, который способен нейтрализовать человеческий -ФНО. Антитело в соответствии с настоящим изобретением обладает высокой активностью в нейтрализации -ФНО как вне, так и внутри организма. Таким образом, вне организма человеческий -ФНО проявляет полумаксимальную биологическую активность при концентрации около 0,15 нг/мл (3,3 10^-12 моль/л, принимая, что -ФНО является тримером). В присутствии 1 мкг/мл (6,25 10^-9 моль/л) указанного антитела человеческий -ФНО проявляет полумаксимальную биологическую активность примерно при 229 нг/мл (4,610^-9 моль/л, отношение полумаксимальной биологической активности в присутствии 1 мкг/мл указанного антитела к активности в его отсутствие составляет около 1527). В присутствии 100 нг/л (6,5 10^-10 моль/л) указанного антитела человеческий -ФНО проявляет полумаксимальную биологическую активность примерно при 26 нг/мл (5,210^-10 моль/л). В присутствии 10 нг/мл (6,25 10^-11 моль/л) указанного антитела человеческий -ФНО проявляет полумаксимальную активность (биологическую) примерно при 1,9 нг/мл (3,8 10^-11 моль/л). Таким образом, моноклональное антитело, представленное настоящим изобретением, характеризуется тем фактом, что оно нейтрализует человеческий -ФНО вне организма при отношении ниже, чем 2:1, в частности при отношении примерно 1,3:1 в молярном исчислении. Кроме того, упомянутое моноклональное антитело нейтрализует и поэтому также распознает структурно родственный полипептидный человеческий -ФНО.

Так, вне организма человеческий -ФНО проявляет полумаксимальную биологическую активность примерно при 4 нг/мл (810^-11 моль/л, принимая, что -ФНО является тримером). В присутствии 1 мкг/мл (6,2510^-9 моль/л) упомянутого антитела человеческий -ФНО проявляет полумаксимальную биологическую активность примерно при 25,6 нг/мл (510^-10 моль/л; отношение полумаксимальной биологической активности в присутствии 1 мкг/мл указанного антитела к активности в его отсутствие составляет около 6,3).

В качестве второго аспекта настоящее изобретение демонстрирует, что упомянутое моноклональное антитело способно осаждать человеческий -ФНО., что определяется посредством двойной диффузии в двух измерениях (метод Оучтерлони). В качестве третьего аспекта настоящее изобретение демонстрирует, что наименьший комплекс антиген-антитело, образующийся при инкубации указанного моноклонального антитела с человеческим -ФНО, является высокомолекулярным комплексом антиген-антитело, содержащим практически не менее двух молекул указанного моноклонального антитела и по меньшей мере одну молекулу человеческого -ФНО. Обычно три молекулы моноклонального антитела связывают вместе две молекулы человеческого -ФНО.

Термин "высокомолекулярный комплекс антиген-антитело" используется для обозначения антиген-антительных комплексов с молекулярным весом не менее 400 тыс. ед. Дальтона (еД), обычно примерно от 570 до 600 тыс. еД.

Более того, указанное антитело представляет полную защиту мышей от летательной (в ином случае) дозы человеческого -ФНО при дозировках ниже, чем примерно 1 мкг/мышь, обычно примерно от 0,4 до 0,8 мкг/мышь. Необходимо отметить, что 0,4 мкг/мышь соответствует примерно 20 мкг/кг веса тела.

Кроме того, получена стабильная клеточная линия гибридомы и ее потомство, которое продуцирует такие моноклональные антитела.

Дополнительно в заявке описан способ получения такого моноклонального антитела и фармацевтическая композиция, включающая такое моноклональное антитело, которое способно нейтрализовать как человеческий -ФНО, так и человеческий -ФНО и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

С помощью описанных антител возможно детектирование содержимого человеческого -ФНО в жидкостях организма и получение антиидиотипических антител, которые распознают рецепторы человеческих -ФНО и -ФНО Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут принадлежать к любому из классов иммуноглобулинов, таких как IgM, IgD, IgE, IgA или подклассы IgG. Моноклональное антитело может использоваться интактно или в качестве связывающих фрагментов, таких как F_v, Fab, F(ab')₂.

В заявке описано получение моноклонального антитела или его связывающего фрагмента, причем этот способ включает культивирование клеточной линии гибридомы или ее потомства по настоящему изобретению и выделение моноклонального антитела, полученного таким образом.

Моноклональные антитела по настоящему изобретению или их фрагменты могут быть приготовлены путем иммортализации лимфоцитов ряда поколений В-клеток. Иммортализация может быть осуществлена путем трансформации онкогенным вирусом или посредством слияния с уже иммортальной клеточной линией (например, миеломная или лимфобластоидная клеточная линия). Последний подход, который первоначально был описан Келером и Мильштейном (10), привел к созданию иммортальных гибридных клеточных линий, способных к неограниченному росту и продуцированию антитела. Полученные таким образом клеточные линии могут клонироваться и отбираться таким образом, чтобы детектировать антитела против заданного антигена в надклеточной жидкости. Было описано большое количество методик отбора в литературе, которая известна специалистам в этой области биохимии. Эти методики однозначно дают возможность выделить моноклональные антитела против желаемого антигена (антигенов). Однако, если оператор желает выделить моноклональное антитело, обладающее особыми свойствами (например, имеющее высокую или малую степень сродства к антигену, будучи нейтрализованным или не нейтрализованным), то методики отбора должны устанавливаться таким образом, чтобы давать им возможность изолировать моноклональные антитела, имеющие желаемые свойства. Способ установления таких анализов зависит от искомого свойства антигена, против которого оператор желает получить антитела, и говоря вообще, он непредсказуем и должен изучаться в каждом отдельном случае. Однако эта стадия имеет решающее значение, если оператор желает выделить моноклональные антитела с высокой активностью.

По желанию, когда клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела с заданными свойствами против человеческого -ФНО, выделены в соответствии с настоящим изобретением, они могут использоваться в качестве источника генов, кодирующих моноклональные антитела.

Эти гены могут быть выделены путем приготовления сначала библиотек кДНК из МРНК. Затем выделяется отдельный клон кДНК, кодирующий иммуноглобулин, который может быть обработан дополнительно. Конечной целью этих обработок обычно является, но не обязательно, генерирование антител с пониженной иммуногенной активностью при назначении внутрь организма хозяина, который отличается от того организма, из которого были произведены первоначальные антитела. Это может быть достигнуто посредством сшивки нуклеотидов, соответствующих переменным областям генов с нуклеотидами, соответствующими постоянным областям тех генов, в которые должны быть введены антитела. Альтернативно, нуклеотиды, кодирующие области первоначального моноклонального антитела, определяющие комплементарность, могут быть заменены соответствующими нуклеотидами переменных областей генов антитела, в которые должны быть введены антитела. Окончательно, исходный или модифицированный клон к ДНК затем может быть выделен и помещен в подходящие прокариотические или эукариотические векторы экспрессии и в последующем трансфектирован в хозяина для окончательного продуцирования массы.

На рис. 1 показана специфичность для человеческого -ФНО моноклонального антитела, которая определена методом ELISA, при котором измеряется остаточное связывание к -ФНО 100 нг/мл антитела при инкубировании с различными дозами человеческого -ФНО. или с различными дозами неродственных антигенов.

На рис. 2 представлена нейтрализующая активность 1 мкг/мл (6,25 10^-9 моль/л) моноклональных антител при различных дозах человеческого -ФНО.

На рис. 3 показана нейтрализующая активность 1 мкг/мл моноклональных антител при различных дозах человеческого -ФНО.

На рис. 4 представлен график Скатчарда для связывания человеческого -ФНО с упомянутым моноклональным антителом.

На рис. 5 показана диссоциация человеческого -ФНО от моноклонального антитела настоящего изобретения.

На рис. 6 показаны профили исключения размера жидкостной хроматографии быстрого давления для только 210^-6 моль/л человеческого -ФНО (- - - панель A), только 6,2510^-6 моль/л указанного моноклонального антитела (___ панель A), смеси 210^-6 моль/л человеческого -ФНО и 210^-7 моль/л моноклонального антитела (панель В) и смеси 10^-10 моль/л иодированного человеческого -ФНО и 1,2510^-11 моль/л моноклонального антитела (панель С).

В материалах заявки даны таблицы 1, 2, 3, 4 и 5, которые описаны в тексте. Кроме того, табл. 6 демонстрирует параметры связывания человеческого -ФНО с моноклональным антителом настоящего изобретения.

Таблица 7 показывает концентрации человеческого -ФНО, при которых достигается полумаксимальная биологическая активность в отсутствии или в присутствии различных концентраций упомянутого моноклонального антитела.

В табл. 8 показано действие на выжимаемость мышей введения им различных доз человеческого -ФНО.

В табл. 9 показано защищающее действие моноклонального антитела настоящего изобретения для мышей, которым введены две летальные дозы -ФНО.

В таблице 10 показано защищающее действие инъекции моноклонального антитела настоящего изобретения мышам, введенной в различные моменты до и после их обработки двумя летальными дозами -ФНО..

Что касается характеристик заявленной гибридной клеточной линии, то термины "постоянный" и "стабильный" означают жизнеспособный в течение продолжительного периода, обычно примерно не менее 6 месяцев. Изобретение раскрывает стабильную, постоянную клеточную линию гибридомы, которая обладает способностью производить специфическое моноклональное антитело в течение по меньшей мере 25 циклов.

Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, выбранному из антител, популяция которых является существенно однородной, то есть особи популяции антител являются идентичными, за исключением мутаций естественного происхождения.

Термин "антитело" также означает включение интактных молекул, а также их фрагментов, таких как F_v; Fab и F(ab')₂, которые способны связывать антиген. Фрагментам F_v, Fab и F(a,b')₂ недостает фрагмента Fc антитела, и они могут обладать меньшим, неспецифическим связыванием ткани, чем интактное антитело. Можно будет признать, что фрагменты F_v, Fab и F(ab')₂, и другие фрагменты моноклонального антитела настоящего изобретения могут использоваться также, как интактное антитело для тех же целей, например детектирования -ФНО и лечения тех болезненных состояний, в которых, как было показано, -ФНО играет вредную роль.

Термин "нейтрализующий" используется для обозначения способности растворов, содержащих антитело, блокировать биологическую активность -ФНО и -ФHO вне и/или внутри организма.

Термин "усиленная или высокая нейтрализующая -ФНО активность вне организма" используется для обозначения способности раствора, содержащего антитело, нейтрализовать человеческий -ФНО при весовом отношении 6:1 и при молярном отношении меньше, чем 2:1, при дозах моноклонального антитела не более 10 нг/мл.

Термин "усиленная или высокая нейтрализующая -ФНО активность в организме" используется для обозначения способности раствора, содержащего антитело, блокировать, при дозах не более 20 мкг/кг веса тела, способность -ФНО играть вредную роль в живом организме.

Моноклональное антитело, описанное в данной заявке, разумеется, способно осуществлять полную защиту мышей от других летальных доз -ФНО при дозировках, меньше чем 1 мкг/мышь, типично примерно от 0,4 до 0,8 мкг/мышь. Следует подчеркнуть, что 0,4 мкг/мышь соответствует примерно 20 мкг/кг веса тела.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такое моноклональное антитело секретируется гибридомной клеточной линией, которая была получена с использованием клеток, способных к неограниченному росту, и клеток, произведенных из мышей, которые были иммунизированы человеческим рекомбинантным -ФНО.

Клеточная линия, способная к неограниченному росту, представляет собой клеточную линию, которая в практических целях может непрерывно поддерживаться в клеточной культуре. Иными словами, она является стабильной и постоянной, и при слиянии с клетками, которые не проявляют такие свойства, способна присваивать эти свойства продукту слияния.

Может использоваться любая подходящая клеточная линия, способная к неограниченному росту. Типично может быть использована плазмацитома (миелома), происходящая из млекопитающих. Предпочтительным типом клеточной линии является мышиная плазмацитома, лишенная гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (ГФРТ). Однако такая клеточная линия является особенно предпочтительной. Это клеточная линия NSO, хорошо известная, лишенная ГФРТ, плазмацитома происхождения ВАLВ/с, которая сама по себе не продуцирует или не секретирует какого-либо иммуноглобулина, или тяжелой, или легкой цепочки (11).

Клетки, способные к неограниченному росту, сливаются с клетками, из которых по меньшей мене некоторые продуцируют антитела, специфически связывающиеся с человеческим -ФНО..

Клетки, продуцирующие антитела, обычно получают из мышей, которые иммунизированы человеческим -ФНО.. Для этой цели может быть использован промышленно доступный человеческий -ФНО. После слияния продукты слияния подвергают скринингу, отбирая те, которые секретируют целевые моноклональные антитела.

Вне организма сначала они испытываются методом EL ISA, который детектируют антитела против -ФНО. Затем они испытываются на способность нейтрализовать циклотоксическую активность человеческого -ФНО на мышиных клетках LM.

Потомство клонов, продуцирующих целевые моноклональные антитела, затем может быть выращено вне организма в подходящей культуральной среде в колбах с культурой ткани или в крупномасштабном устройстве для культивирования (например, Акуцист, фирма Эндотроникс, г. Куун Рэпидз, шт. Миннесота) или в организме как асцитная опухоль в лабораторных животных (например, мышах или крысах).

По желанию, антитело может быть выделено из культуральной среды или жидкости организма; примером могут служить такие методики как осаждение сульфатом аммония, ионообменная хроматография, жидкостная хроматография высокого разрешения или другие методики, известные среднему специалисту в этой области биохимии. В заявке описано получение моноклональных антител с высокой нейтрализующей активностью против -ФНО, а также нейтрализующей активностью против -ФНО, которые отличаются тем, что а) их популяция существенно однородна, б) они продуцируются клетками, способными к неограниченному росту, которые представляют собой гибриды между клеточной линией, способной к неограниченному росту, и клеткой, продуцирующей антитела, в) они проявляют повышенную нейтрализующую активность -ФНО вне и внутри организма, г) они способны нейтрализовать и тем самым распознавать человеческий -ФНО, д) они осаждают человеческий -ФНО, е) они образуют в растворе комплексы с человеческим -ФНО, из которых наименьший содержит практически не менее двух молекул моноклонального антитела и имеют высокий молекулярный вес, обычно не менее 400 тысяч единиц Дальтона.

Благодаря их -ФНО и -ФНО нейтрализующей активности моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть применены по отношению к млекопитающим, включая людей, для профилактического и/или терапевтического воздействия при болезнях, для которых известно, что -ФНО и/или -ФНО оказывают патогенное действие. Как отмечалось ранее, обычно такими болезненными состояниями являются истощение, септический шок, СПИД, церебральная маляция, ревматоидный артрит, хронические и острые воспалительные заболевания, ишемия миокарда, противопоказания к прививкам и другие, для которых уже известно или как полагают -ФНО и/или -ФНО играют отрицательную роль.

Уровни дозирования, пригодные для отдельного или систематического назначения взрослым людям, моноклональных антител в соответствии с настоящим изобретением, например, полученных с использованием гибридомного клона 78, могут иметь диапазон 20 мкг 1 мг антитела на 1 кг веса тела. Однократные или многократные назначения этих композиций могут выполняться на уровнях дозирования и по системе, выбранной лечащим врачом. В любом случае, фармацевтическая композиция должна обеспечить достаточное количество антитела для эффективного лечения или профилактики болезни пациента.

Моноклональное антитело этого изобретения может быть применено одно или совместно с другими фармацевтическими активными агентами в фармацевтических композициях, содержащих соответствующие количества моноклонального антитела совместно с фармацевтически приемлемым носителем и/или растворителем.

Ниже приведены типичные примеры рецептур.

А. FCE 27477 лиофилизированная рецептура (композиция предварительно лиофилизированного раствора), содержащая: Активное лекарство 0,05 0,5% м/о Наполнитель, например лактоза или маннитол 2,5 5,0% м/о Поверхностно-активное вещество, например полисорбаты или полоксамер - 0,0025 0,025% м/о рН регулирующий агент, например NaOH 0,01N или HCl 0,01N До рН 6,5 7 В. РСЕ 27477 "готовая к применению" рецептура, содержащая: Активное лекарство 0,05 0,5% м/о Поверхностно-активное вещество, например полисорбаты или полоксамер - 0,0025-0,025% м/о рН регулирующий агент, например NaOH 0,01N или HCl 0,01N До рН 6,5 7 Вода для инъекций Остальное Для того, чтобы приготовить изотонический водный раствор, может быть добавлен внешний агент (например, хлорид натрия, сорбитол или декстроза) на его изотоническом уровне.

Моноклональное антитело настоящего изобретения может назначаться при комбинированном методе лечения с другим фармацевтически активным агентом, фармацевтически активные агенты, которые могут быть применены с моноклональными антителами настоящего изобретения или могут назначаться альтернативно в комбинированном методе лечения, могут быть, например, антителами, в особенности моноклональными антителами, против других антигенов, таким образом обеспечивая "коктейль", содержащий моноклональное антитело настоящего изобретения и одно или более (моноклональных) антител против других антигенов, вовлеченных в патогенез соответствующего расстройства.

Дополнительные активные агенты, которые могут быть составлены в рецептуре с моноклональными антителами настоящего изобретения или альтернативно могут быть введены комбинированным методом лечения, особенно для того, чтобы произвести терапевтически полезный эффект, зависят от состояния болезни, подлежащей лечению, и, например, являются промышленно доступным гамма-глобулином и иммуно-глобулиновыми продуктами, антибиотиками, антимикробными продуктами, антибактериальными и противоопухолевыми агентами или смесью из двух или более таких агентов.

Сверх того, моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть использованы одни или в комбинированном методе лечения с антибактериальным и, в особенности, с антинеопластичными агентами, с тем, чтобы предотвратить или улучшить возникающие при этом побочные эффекты. Типичными побочными эффектами, которые могут быть устранены, являются, например, кахексия, тошнота, рвота, потеря аппетита, алопеция, понос и нейтропания.

Типично, антимикробные агенты могут включать пенициллин в сочетании с аминогликозидом (например, гентамицин, тобрамицин). Однако могут быть использованы некоторые хорошо известные дополнительные агенты, например цефалоспорины.

Термин "антинеопластичный агент" означает включение как одного противоопухолевого медикамента, так и "коктейлей", то есть смеси таких медикаментов, в соответствии с клинической практикой.

Противоопухолевые агенты, которые могут быть составлены в рецептуре с веществом изобретения или альтернативно, могут быть введены комбинированным методом лечения, представляет собой например, доксорубицин, дауномицин, эпирубицин, идарубицин, этопозид, фторурацил, мефалан, циклофосфамид, блеомицин, винбластин и митомицин или смесь двух или более таких агентов.

Термин "комбинированный метод лечения" означает включение отдельного, а также практически одновременное назначение фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело настоящего изобретения, фармацевтической композиции, содержащей другой фармацевтически активный агент.

Соответственно, предпочтительной целью настоящего изобретения является комбинированный метод лечения рака у млекопитающих, включая людей, при необходимости такого лечения, причем этот метод включает назначение 1) моноклонального антитела настоящего изобретения или его связывающего фрагмента, и 2) противоопухолевого агента в таких количествах и в непосредственной близости по времени, которые достаточны для обеспечения терапевтически полезного эффекта.

Продукты, содержащие моноклональное антитело настоящего изобретения или его связывающий фрагмент и противоопухолевый агент в виде комбинированного препарата, могут быть использованы для одновременного, раздельного или последовательного применения в противораковой терапии.

Поэтому моноклональное антитело настоящего изобретения или его связывающий фрагмент могут использоваться для улучшения лечения рака. Они могут назначаться пациентам, страдающим от рака и обрабатываемым противоопухолевым агентом, например антрациклиновым гликозидом, таким как доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин или идарубицин, которые упомянуты выше. Антитело настоящего изобретения и противоопухолевый агент, такой как антрациклиновый гликозид, могут назначаться для улучшения состояния пациента, имеющего лейкомию, такую как миелобластическая лейкомия, лимфома, саркома, нейробластома, опухоль Вилмса или злокачественная неоплазма мочевого пузыря, груди, легких или щитовидной железы.

Кроме того, высокая нейтрализующая активность антитела настоящего изобретения, как показано, например, на рис. 2, позволяет предположить, что упомянутое антитело распознает эпитоп, находящийся близко или внутри центра, связывающего рецептор человеческого -ФНО. Были охарактеризованы два рецептора -ФНО (12-13).

Оба рецептора связывают человеческий -ФНО и -ФHO с почти одинаковой степенью сродства или экспрессии на целых клетках. Однако растворимые формы этих двух рецепторов связывают человеческий -ФНО с гораздо меньшей степенью сродства, чем человеческий -ФНО (14-15). Этот результат позволяет предположить, что солюбилизация внеклеточного домена рецепторов вызывает изменение в относительной степени сродства для человеческого -ФНО. Если моноклональное антитело настоящего изобретения распознает эпитоп внутри центра человеческого -ФНО, связывающего рецептор, тогда оно должно функционально вести себя подобно рецептору -ФНО, то есть оно должно распознавать как человеческий -ФНО, так и человеческий -ФНО. Так как упомянутое моноклональное антитело является растворимой молекулой, оно должно функционально вести себя подобно растворимому рецептору -ФНО, то есть оно должно связывать человеческий -ФНО с гораздо большей степенью сродства, чем человеческий -ФНО. Рис. 3 демонстрирует, что, разумеется, это так. Для человеческого -ФНО отношение полумаксимальной биологической активности в присутствии или в отсутствии 1 мкг/мл упомянутого антитела равно 6,3. Это позволяло предположить, что упомянутое моноклональное антитело связывается с человеческим -ФНО и человеческим -ФНО подобно растворимому рецептору -ФНО.

Следовательно, оно идеально подходит для использования в качестве иммуногена, для того, чтобы получить в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными для специалистов в этой области биохимии (16), антиидиотипические антитела, которые связываются с моноклональным антителом настоящего изобретения, подобно человеческому -ФНО.. Следовательно, эти моноклональные антиидиотипические антитела, которые способны связываться с рецепторами -ФНО, подобно -ФНО, и, следовательно, подражательные биологические активности -ФНО могут быть терапевтически полезными при тех заболеваниях, при которых введение -ФНО вероятно играет полезную роль. Этими болезненными состояниями являются, например, рак, при котором антиидиотипические антитела изобретения аналогично -ФНО могут быть введены или как таковые, или предпочтительно как часть комбинированного метода лечения (17), и некоторые автоиммунные заболевания (18).

Моноклональные антитела и фармацевтические композиции, содержащие моноклональные антитела, описанные в заявке, могут назначаться парэнтерально посредством подкожного, внутримышечного, внутриартериального или внутривенного введения.

Фармацевтические композиции, содержащие моноклональные антитела настоящего изобретения, обычно готовятся следующими традиционными методами.

Вообще говоря, носители и/или разбавители согласно фармацевтической композиции настоящего изобретения включают спиртово-водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые или буферные среды. Парэнтеральные носители включают раствор хлористого натрия, декстрозу Ринджера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Ринджера или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкость и питательные наполнители, электролитные наполнители, такие как на основе декстрозы Ринджера и т.п. Также могут присутствовать предохранители и другие добавки, такие как, например, антимикробные агенты, антиокислители, хелатирующие агенты, инертные газы и т.п. (19).

Обычно в болезненных состояниях, при которых -ФНО проявляет патогенное действие, содержание -ФНО в жидкостях организма возрастает по сравнению с тем уровнем, который обнаруживается в тех же самых жидкостях организма здоровых людей. Следов