Замещенные тетрагидро-, или гексагидроциклопент /в/ индолы, или их фармацевтически приемлемые аддитивные соли и способы их получения

Замещенные тетрагидро-, или гексагидроциклопент /в/ индолы, или их фармацевтически приемлемые аддитивные соли и способы их получения

Реферат

 

Использование: в медицине для лечения различных расстройств памяти, характеризующихся пониженной холинергической функцией. Сущность изобретения: продукты: замещенные тетрагидроили гексагидроциклопент (b) индолы ф-лы I, где R₁ водород, низший алкиламинокарбонил, бензилоксикарбонил, R₂ - водород, низший алкил, циклоалкил, фенилзамещенный низший алкил, алкинил, формил, бензилоксикарбонил, R₃ - водород, низший алкил, R₄ - водород, гидрокси, низший алкиламинокарбокси, - - - обозначает отсутствие связи или одинарную связь. Реагент I. Соединение ф-лы 2, которое подвергают восстановлению. Условия реакции: восстановление осуществляют с помощью сплава Ренея в растворе гидроксида натрия. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к соединениям формулы: в которой n равно 2, 3, 4 или 5; Х представляет собой водород, низший алкил, низшую алкокси, гидрокси, галоген, трифторметил или нитро группу; R₁ представляет собой водород, низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, амино-низший алкил, низший алкил-аминонизший алкил, ди-низший алкиламино низший алкил, циклоалкил, циклоалкил низший алкил, циклоалкенил, арил, арил низший алкил, арилциклоалкил, причем группа "Alk" обозначает двухвалентную низшую алкиленовую группу, а Y обозначает водород, низший алкил, арил или арил низший алкил; R₂ представляет собой водород, низший алкил, формил, низший алкилкарбонил, бензилоксикарбонил или низший алкиламинокарбонил; или альтернативно группа в целом представляет собой R₃ представляет собой водород, низший алкил, арил низший алкил, низший алкилкарбонил или низший алкоксикарбонил; R₄ представляет собой водород, -ОН, или , где R₇ представляет собой низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, циклоалкил, циклоалкил низший алкил, арил, арил низший алкил, арилциклоалкил, а R₆ представляет собой водород, низший алкил, арил или арил низший алкил; или альтернативно группа в целом, представляет собой а R₇ представляет собой низший алкил, арил или арил низший алкил; такие соединения полезны для облегчения различных дисфункций памяти, характеризующихся холинергическим дефицитом, таких как болезнь Альцгеймера. Соединения формулы I изобретения также ингибируют моноаминоксидазу и/или действуют на центральные ₂ -адренергические рецепторы и, следовательно, могут использоваться в качестве антидепрессантов.

В сферу настоящего изобретения включены также соединения формулы II, в которой R₃, R₄, Х и n имеют указанные выше значения, которые полезны в качестве прямых предшественников целевых соединений настоящего изобретения.

В сферу изобретения включены также соединения формулы III, в которой R₈ представляет собой гидрокси, амино низшая алкокси, низший алкил, циклоалкил, циклоалкенил, арил низший алкил, арилциклоалкил, низший алкилкарбонилокси или низший аминокарбонилокси, которые полезны для облегчения различных дисфункций памяти, характеризующихся холинергическим дефицитом, таких как болезнь Альцгеймера. Соединения III настоящего изобретения также ингибируют моноамин оксидазу и/или действуют, как антагонисты пресинаптического ₂-адренергического рецептора и, следовательно, являются полезными в качестве антидепрессантов.

Если не оговорено или не указано иное, то следующие ниже определения применимы ко всему тексту описания и прилагаемой формуле изобретения.

Термин низший алкил подразумевает алкильную группу нормального или изостроения, содержащую 1-6 углеродных атомов. Примерами указанного низшего алкила могут служить метил, этил, -н-пропил, изо-пропил, н-бутил, изо-бутил, втор. -бутил, трет.-бутил, а также пентил и гексил нормального или разветвленного строения.

Термин циклоалкил подразумевает циклоалкильную группу из 3-7 углеродных атомов.

Под термином галоген подразумевается фтор, хлор, бром или иод.

Термин арил подразумевает фенильную группу, замещенную 0,1 или 2 заместителями, каждый из которых независимо друг от друга представляет собой низший алкил, низшую алкокси, галоген, трифторметил, гидрокси или нитро группу.

Везде в тексте описания и прилагаемой формулы изобретения химическая формула или название охватывает все стерео и таутомерные изомеры в том случае, когда такие изомеры существуют.

Соединения настоящего изобретения получают путем использования одной или более стадий синтеза, описанных ниже.

В тексте описания стадий синтеза символы n, X, Y и R₁ R₈ имеют соответствующие значения, приведенные выше, если не оговорено или не указано иное.

Стадия А.

Соединения формулы IV, в которой R₉ представляет собой водород или -ОСН₃, подвергают циклизации с получением соединения формулы V. Такую реакцию обычно проводят в водной серной кислоте при температуре 25-150^oC.

Стадия В.

Производят реакцию между соединением V и сульфатным соединением формулы (R₁₀О)₂SO₂, в которой R₁₀ представляет собой низший алкил или арил низший алкил, с помощью традиционного способа, известного в этой области, с получением соединения формулы VI. Согласно другой методике, проводят реакцию между соединением V и галогенидным соединением формулы R₁₀-Наl, где R₁₀ имеет указанные выше значения, с помощью традиционного способа, известного в этой области, с получением соединения формулы VI.

Стадия С.

Проводят реакцию между соединением V и ди низшим алкилпирокарбонатом формулы R₁₁-О-СО-О-СО-О-R₁₁, где R₁₁ представляет низшую алкильную группу, в присутствии подходящего катализатора, предпочтительно 4-диметиламинопиридина, с получением соединения формулы VII Стадия D.

Проводят реакцию между соединением V и ацилхлоридом формулы R₁₁-СО-Сl, с помощью общепринятого способа, известного в данной области, с получением соединения формулы VIII.

Стадия Е.

Соединение формулы IX, полученное на стадии В, подвергают реакции расщепления с получением соединения формулы Х. Обычно в конце такой реакции соединение IX реагирует с комплексом ВВr₃ (тетрагидрофуран, и полученный в результате продукт гидролизуют обычным способом, известным из литературы.

Стадия F.

В специальном случае проводят реакцию между соединением ХI и хлористым хлорацетилом в присутствии хлористого алюминия, с помощью обычного метода, известного в литературе, с получением соединения формулы XII (реакция Фриделя-Крафтса).

(XII) Cтадия G.

Обычным методом, известным из литературы, проводят реакцию между соединением XII и надкислотой, предпочтительно м-хлорнадбензойной кислотой, с получением соединения формулы XIII (реакция Байера-Виллигера).

Стадия Н.

Соединение XIII гидролизуют предпочтительно в присутствии такого основания, как гидроксид натрия с получением соединения формулы XIV.

Стадия I.

Соединение формулы XV, в которой R₁₂ представляет собой водород, метокси или гидрокси, которое получено на одной из предыдущих стадий, подвергают реакции с гидрохлоридом гидроксиламина с помощью традиционного способа, известного из литературы, с получением соединения формулы XVI. Обычно такую реакцию проводят путем суспендирования соединения XV в этаноле с последующим добавлением водного раствора ацетата натрия и водного раствора гидрохлорида гидроксиламина, после чего суспензию перемешивают при температуре 25-150^oC.

Стадия J.

Стандартным способом проводили реакцию между соединением XVI и бромистым аминонизшим алкилом формулы Вr-R₁₃-NH₂, где -R₁₃-NH₂ представляет собой аминонизшую алкильную группу, с получением соединения формулы XVII.

(XVII) Стадия К.

Общепринятым способом, известным из литературы, проводили реакцию между соединением XV и первичным амином формулы где R₁₄ представляет собой низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, арилнизший алкил, арилциклоалкил или арил, с получением имина формулы XVIII.

Такую реакцию предпочтительно проводят в присутствии изопропилата титана (IV) в среде такого подходящего растворителя, как ацетонитрил. Обычно такую реакцию проводят при температуре 0-80^oC. Такой способ более предпочтителен, чем метод с использованием TiCl₄ или метод, в котором реакцию проводят в запаянной трубке при повышенной температуре с помощью молекулярных сит, используемых в качестве водоудаляющего средства.

Стадия L.

Соединение XVI восстанавливают с помощью сплава Ренея и раствора гидроксида натрия в соответствии со способом, описанным Б.Стаскуном и Т.ван Эсом (J. Chem. Soc. C, 531, 1966) с получением соединения формулы XIX.

Стадия М.

Проводят реакцию между соединением XV и изопропилатом титана и вторичным амином формулы , где группа , представляет собой с последующим восстановлением цианоборгидридом натрия в условиях, аналогичных описаниям Р.Дж.Маттсоном с сотр. J.Org. Chem. 55- 2552-4 (1990), с получением соединения формулы ХХ.

Стадия N.

Традиционным способом, известным из литературы, соединение XVIII восстанавливали боргидридом натрия, цианоборгидридом натрия или комплексом боран/тетрагидрофуран с получением соединения формулы XXI.

Стадия О.

Соединением XIX восстанавливали с помощью комплекса боран/тетрагидрофуран и трифторуксусная кислота с получением соединения формулы XXII.

Cтадия Р.

Проводили реакцию между соединением формулы ХХIII, которое получали на стадии L или О, и галогенидным соединением формулы R₁₅-Наl, в которой R₁₅ представляет собой низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, циклоалкинилнизший алкил, арилнизший алкил, с получением соединения формулы XXIV.

Стадия Q.

Проводили реакцию между соединением формулы XXV, в которой R₁₆ представляет собой водород, низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, арилнизший алкил или арилциклоалкил, и муравьиной кислотой в присутствии 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида и 4-диметиламинопиридина, или смешанного ангидрида, полученного из муравьиной кислоты и уксусного ангидрида, с получением соединения формулы XXVI.

Стадия R.

Общепринятым методом, известным из литературы, проводили реакцию между соединением XXV и хлористым ацилом формулы R₁₇ СО-Сl, в которой R₁₇ представляет собой низшую алкильную группу, с получением соединения формулы XXVII.

Стадия S.

Общепринятым способом, известным из литературы, проводили реакцию между соединением формулы XXV, в которой R₁₂ не является гидрокси группой, и бензилхлорформиатом с получением соединения формулы XXVIII.

Стадия Т.

Проводили реакцию между соединением формулы XXV, в которой R₁₂ не является гидрокси, и изоцианатом формулы R₁₇-N=C=O, в которой R₁₇ представляет собой низший алкил, арил или арилнизшую алкильную группу, с получением соединения формулы XXIX. Обычно такую реакцию проводят в присутствии такого подходящего катализатора, как 1,8-диазобицикло[5.4.0]ундец-7-ен Стадия U.

Проводили реакцию между соединением формулы XVI, в которой R₁₂ не является гидрокси, и изоцианатом практически тем же способом, что и на стадии Т, с получением соединения формулы ХХХ.

Стадия Y.

Общепринятым методом, известным из литературы, проводили реакцию между соединением XVI и ацилхлоридом формулы R₁₇-СО-Сl или ангидридом кислоты формулы (R₁₇-СО)₂О с получением соединения формулы ХХХI.

Стадия W.

Общепринятым методом, известным из литературы, проводили реакцию между соединением формулы XXXII, в которой R₂ не является низшим алкиламинокарбонилом, полученным на одной из предыдущих стадий, с хлорформиатом формулы с получением соединения формулы XXXIII.

Стадия Х.

Проводили реакцию между соединением формулы XXXIIIa, которое получали на стадии W с изоцианатом формулы R₁₇-N=C=O, с использованием того же способа, что применяли на стадии Т, в результате чего получали соединение формулы ХХХIV. После этого соединение XXXIV подвергали гидрогенолизу обычным способом, известным в технике, с помощью подходящего катализатора, такого как палладий на угле, с получением соединения формулы XXXV.

Стадия Y: В соответствии со способом, описанным для стадии Т, проводили реакцию между соединением формулы XXVI, которое получали на предыдущих стадиях, и изоцианатом формулы R₁₇-N=C=O с получением соединения формулы XXVII.

Соединения формул I и III настоящего изобретения полезны для лечения различных расстройств памяти, характеризующихся пониженной холинергической функцией, таких как болезнь Альцгеймера. Соединения настоящего изобретения также ингибируют моноаминооксидазу и/или воздействуют на центральные ₂- адренаргические рецепторы и, следовательно, полезны как антидепрессанты.

Активность в отношении облегчения таких расстройств памяти демонстрируется способностью таких соединений ингибировать фермент ацетилхолинэстеразу и тем самым повышать уровень содержания ацетилхолина в головном мозге.

Испытание на ингибирование холинэстеразы.

Холинэстераза обнаруживается в различных участках тела, как в головном мозге, так и в сыворотке. Однако лишь распределение ацетилхолинэстеразы в головном мозге коррелирует с центральной холинергической иннервацией. Предполагается, что подобная иннервация ослабляется у пациентов с болезнью Альцгеймера. В настоящей работе определялось ингибирование ин витро ацетилхолинэстеразной активности в крысином стриатуме (Striatunu).

Ингибирование ин витро ацетилхолинэстеразной активности в крысином стриатуме.

Ацетилхолинэстераза (АСhE), которую иногда называют истинной или специфической холинэстеразной, обнаружена в нервных клетках, скелетных мышцах, гладких мышцах, различных железах и в красных кровяных клетках. АChE можно отличить от других холинэстераз по субстратной и ингибиторной специфичности и по региональному распределение. Ее распределение в головном мозге строго коррелирует с холинэргической иннервацией, и субфракционирование обнаруживает наивысший уровень содержания в нервных окончаниях.

Общепринятым является тот факт, что физиологическая роль АСhE заключается в быстром гидролизе и инактивации ацетилхолина Ингибиторы АСhE проявляют ярко выраженное холиномиметическое действие в холинергически-иннерватированных эффекторных органах, и их используют терапевтически при лечении глаукомы, миастении гравис и паралитической кишечной непроходимости. Однако результаты последних исследований позволили предположить, что АChE ингибиторы могут также с успехом применяться для лечения болезни Альцгеймера.

Описанный ниже способ использовали в изобретении для оценки холинэстеразной активности. Этот метод является модификацией метода Эллмана с сотр. Biochem Phasm. 7, 88 (1961).

Методика: А. Реагенты 1. 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,2.

(a) 6,85 г NaH₂PO₄H₂O/100 мл дистиллированной воды (b) 13,40 г Na₂HPO₄7H₂O/100 мл дистиллированной H₂ (c) добавляют (а) к (b) до рН 7,2 (d) осуществляют разбавление 1:10 2. Субстрат в буфере (a) 198 мг хлористого ацетилтиохолина (10 мМ) (b) доведение до объема 100 мл с помощью 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,2 (реагент 1) 3. ДТNB в буфере (a) 19,8 мг 5,5-дитиобиснитробензойной кислоты (ДТNB) (0,5 мМ) (b) доведение до объема 100 мл с помощью 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,2 (реагент 1) 4. Приготавливают 22 мМ исходный раствор испытуемого лекарства в подходящем растворителе и доводят до необходимого объема с помощью 0,5 мМ ДТNB (реагент 3). Лекарства серийно разбавляют (1:10) так, что конечная концентрация (в кювете) составляет 10^-4 М, и подвергают скринингу на активность. В случае наличия активности по ингибиторной активности последующих концентраций определяли значения IC₅₀.

В. Препарат ткани Самцов крыс разновидности Вистар подвергали декапитации, быстро удаляли мозги, препарировали полоски основания мозга, взвешивали и гомогенизировали их в 19 объемах (примерно 7 мг протеина/мл) 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,2 с использованием гомогенизатора Роtter Elvehjem. Аликвоту гомогената объемом 25 мкл добавляли к 1,0 мл среды для лекарства или испытуемого лекарства различных концентраций и в течение 10 мин предынкубировали при 37^oC.

O. Анализ.

Энзимную активность измеряли с использованием спектрофотометра Бекмана марки ДU-50. Этот метод может использоваться для определения IC₅₀ и измерения кинетических констант.

Набор инструментов Кинетический модуль Софт-Пак N 598273(10); Программа N 6 Киндата: Источник визуальный; Длина волны 412 нм; Дозатор отсутствует; Кюветы 2 мл кюветы, использующие автоматический пробоотборник на 6 образцов; Слепой опыт 1 для каждой концентрации субстрата; Временной интервал 15 с (15 или 30 с для кинетики); Общее время 5 мин (5 или 10 мин для кинетики); График имеется; Интервал автоматическая шкала; Наклон увеличивающийся; Результаты положительные (имеется наклон); В пустые кюветы и кюветы с образцами добавляли следующие реагенты: Пустые кюветы: 0,8 мл фосфатный буфер/ДТNB; 0,8 мл буфер/субстрат Контрольные кюветы: 0,8 мл фосфатный буфер/ДТNB/энзим (фермент); 0,8 мл фосфатный буфер/субстрат Лекарство: 0,8 мл фосфатный буфер (ДТNB) лекарство/энзим; 0,8 мл фосфатный буфер/субстрат Для каждого опыта определяли значения в пустых кюветах с целью контроля неэнзимного гидролиза субстрата и эти значения автоматически вычитались по программе Киндата, которой располагает кинетический модуль Софт-Пак. По этой программе также рассчитывается скорость изменения поглощения в каждой кювете.

Для определения IC₅₀: При определениях концентрацию субстрата равную 10 мМ разбавляли в соотношении 1:2 с получением конечной концентрации 5 мМ. Концентрация ДТNB составляла 0,5 мМ, что давало конечную концентрацию 0,25 мМ.

Значения IC₅₀ рассчитывали на с помощью log-пробит анализа Результаты испытания некоторых соединений настоящего изобретения и физостигмина (ссыльное соединение) представлены в табл. 1.

Данная полезность дополнительно демонстрируется способностью этих соединений восстанавливать недостаток памяти, связанный с холинергическим дефицитом, в испытании на избегание темноты, описанном ниже.

Испытание на избегание темноты В этом опыте мышей испытывали на их способность запоминать неприятный раздражитель в течение 24 ч. Мышей помещали в камеру с темным отделением; в результате воздействия сильного освещения от лампы накаливания мыши перебегали в темное отделение, в котором применяли электрошок через металлические пластины на полу. Животных удаляли из испытательного устройства и снова подвергали испытанию через 24 ч на их способность запоминать действие электрошока.

Если скополамин, антихолинергетик, который как известно вызывает ухудшение памяти, применяется до первоначального испытания животного в испытательной камере, то животное повторно входит в темное отделение вскоре после помещения в испытуемую камеру через 24 ч. Данный эффект скополамина блокируется активным испытуемым соединением, что приводит к большему интервалу времени перед повторным вхождением в темное отделение.

Результаты действия активного соединения выражали в процентах животных в группе с блокированным эффектом скополамина, что выражалось увеличением интервала времени между помещением в испытуемую камеру и повторным входом в темное отделение.

Результаты такого испытания для некоторых соединений изобретения и такрина, а также пилокарпина (ссылочного соединения) представлены в табл. 2.

Данная полезность дополнительно демонстрируется способностью соединений изобретения ингибировать фермент моноаминоксидазу, повышать уровни содержания в мозге биогенных аминов и действием в качестве антидепрессантов.

Ингибирование активности моноаминоксидазы типа А и типа В в синаптосомах головного мозга крыс.

Цель установление селективного ингибирования двух указанных форм формоноаминоксидазы (МАО).

Введение.

Для двух указанных выше форм моноаминоксидазы, которые называют тип А и тип В, известно метаболическое дезаминирование аминов. Существование двух таких форм базируется на различных специфичностях в отношении субстрата и ингибитора. Серотонин (5НТ) и норепинефрин (NE) являются субстратами для МАО типа А, -фенэтиламин (РЕА) и бензиламин являются субстратами для МАО типа В, тогда как допамин (ДА) и тирамин представляют собой субстраты для обоих типов. Клорилин является селективным ингибитором для энзима типа А, депренил и паргилин селективные ингибиторы для энзима типа В, а транилципромин и ипрониазид не являются селективными ингибиторами. Установлено, что ингибиторы МАО обладают антидепрессантными свойствами.

Хотя существуют разнообразные методы измерения МАО активности, описанный способ включает экстракцию радиомеченых дезаминированных метаболитов (³H)-5НТ или (¹⁴C)-b-фенэтиламина. Такой метод позволяет измерять активности МАО-А и МАО-В-одновременно или по отдельности.

Методика А. Реагенты 1. Фосфатный буфер (0,5 М), рН 7,4: 134 г NaH₂PO₄7H₂O доводят до объема 1 л с помощью дистиллированной воды (А), 17,3 г Na₂HPO₄ доводят до объема 250 мл с помощью необходимого количества дистиллированной воды (В).

рН А доводят до 7,4 путем медленного добавления В (используя необходимые объемы реагентов).

Проводят разбавление в соотношении 1:10 дистиллированной водой (0,05 М РO₄ буфер, рН 7,4).

2. 0,25 М сахароза (в буфере РO₄): 21,4 г сахарозы доводят до объема 250 мл с помощью 0,05 М буфера РO₄ 3. Субстрат для МАО-А: а. Серотонин креатин SO₄ (5НТ) получали от Сигма Кемикал Компани. Готовили 5 мМ исходный раствор в 0,01 н. НСl. Этот раствор использовали для разбавления специфической активности (³H)-5НТ.

b. [³Н] -5-гидрокситриптамин биноксалат (20-30 Сi, ммоль) получали от Нью-Инглэнд Ньюклеар.

с. 12 мкл (³H)-5НТ добавляли к 2 мл 5 мМ 5 НТ раствора (конечная концентрация амина в анализе составляла 200 мкМ, см. ниже).

4. Субстрат для МАО-В.

а. b-фенэтиламин (РЕА) получали от Сигма Кэмикал Компани. Готовили 5 мМ исходный раствор в 0,01 н. НСl. Этот раствор использовали для разбавления специфической активности (¹⁴C)-РЕА.

b. b-[этил-1-14-С] фенэтиламин гидрохлорид (40-50 Сi, ммоль) получали от Нью Инглэнд Ньюклеар.

с. 12 мкл (¹⁴C)-РЕА добавляли к 2 мл 5 мМ раствора РЕА. (Конечная концентрация амина в анализе составляла 200 мкМ; см. ниже).

5. Равные количества субстратов МАО-А (5НТ) и МАО-В(РЕА) объединяли для одновременного испытания обоих типов МАО, т.е. получали смешанный раствор 2,5 мМ 5НТ и 2,5 мМ РЕА, 40 мкл такого смешанного раствора дает конечную концентрацию каждого амина в анализе 200 мкМ. При испытании только одного типа МАО индивидуальные 5 мМ исходные растворы следует разбавлять в соотношении 1:1 дистиллированной водой перед добавлением 40 мкл в инкубационную смесь, т.е. имеет место та же конечная концентрация амина равная 200 мкМ.

В. Тканевый препарат.

Самцов крыс разновидности Вистар весом 15-250 г умертвляли и быстро извлекали мозги. Всю мозговую массу без мозжечка гомогенизировали в 30 об. охлажденной льдом 0,25 М сахарозы с фосфатным буфером с использованием гомогенизатора Роtter Elvejhem. Гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин и надосадочный слой (S₁) декантировали и проводили повторное центрифугирование при 18000 g в течение 20 мин. Полученный в результате осадок (Р₂) повторно суспендировали в 0,25 М свежей сахарозе. Полученный продукт служил тканевым источником для митохондриальной МАО.

С. Анализ 10 мкл 0,5 М РО₄ буфера, рН 7,4.

50 мкл Н₂О или соответствующая концентрация лекарства 400 мкл тканевой суспензии.

Пробирки предварительно инкубировали в течение 15 мин при 37^oC и начинали анализ путем добавления 40 мкл объединенного субстрата ([³H]-5НТ и [¹⁴C] -РЕА) через 15-секундные интервалы. Пробирки инкубировали в течение 30 мин при 37^oC, и реакцию прекращали путем добавления 0,3 мл 2 норм. НСl. Тканевые холостые значения определяли путем добавления кислоты перед радиоактивным субстратом. Окислительные продукты реакции экстрагировали смесью этилацетат/толуол (1: 1). 5 мл такой смеси добавляли в пробирки. Полученную смесь перемешивали в течение 15 мин с помощью турбинной мешалки с целью экстракции дезаминированных метаболитов с переводом их в органическую фазу, которой давали возможность отделяться от водной фазы. Пробирки помещали в ванну со смесью ацетон/сухой лед с целью вымораживания водного слоя. После вымораживания данного слоя верхний органический слой переливали в сцинтилляционную ампулу. Добавляли 10 мл ликвисцинта и проводили подсчет проб с использованием устройства с окошками для ¹⁴C в одном канале и ³H во втором канале. Значения IС₅₀ определяли с помощью log-пробит анализа.

Результаты анализа по ингибированию моноаминооксидазы для соединений настоящего изобретения представлены в табл. 3.

Авторами изобретения был также проведен анализ на связывание клонидина, описанный ниже, с целью установления взаимодействия соединений изобретения с a₂-рецепторами.

Связывание 3Н-клонидина: ₂-рецептор.

Введение.

Было показано, что ряд антидепрессантов усиливает нейрональное выделение норэпинефрина в результате предполагаемой блокады персинаптического ₂-рецептора, и такое свойство может иметь большое значение в отношении механизма действия таких соединений. Взаимодействие соединения с центральными ₂-рецепторами оценивали в анализе на связывание 3Н-клонидина.

Методика.

А. Реагенты 1. а. 57,2 г Трис НСl 16,2 г Трис основания доводят до объема 1 л (0,5 М Трис буфера, рН 7,7) b. Проводили разбавление в соотношении 1:10 дистиллированной водой (0,05 М Трис буфера, рН 7,7) 2. Трис буфер, содержащий физиологические ионы а. исходный буфер NaCl 7,014 г КСl 0,372 г СаСl₂ 0,222 г доводили до 100 мл в 0,5 М Трис буфере МgCl₂ 0,204 г b. Проводили разбавление дистиллированной Н₂О в соотношении 1:10. В результате этого получали 0,05 М трис НСl, рН 7,7; содержащий NaCl (120 мМ), КСl (5 мМ), СаСl₂ (2 мМ) и МgCl₂ (1 мМ) 3. [4-³H]-Клонидин гидрохлорид (20-30 Сi/ммоль) получали от Нью Инглэнд Ньюклвар. Определение значений IC₅₀: раствор ³H-клонидина доводили до концентрации 120 нМ, и в каждую пробирку добавляли по 50 мкл (в результате в анализиpуемом объеме 2 мл получали конечную концентрацию 3 нМ).

4. Клонидин-НСl получали от Берингер-Ингельхайм. Готовили исходный раствор 0,1 мМ клонидина с целью определения неспецифического связывания. В анализе это давало конечную концентрацию 1 мкМ (20 мкл на 20 мл).

5. Испытуемые соединения. В большинстве анализов в подходящем растворителе готовили 1 мМ исходный раствор и подвергали его серийному разбавлению так, чтобы конечная концентрация в анализе составляла от 10^-5 до -10^-8 М. В каждом анализе использовали по семь концентраций, причем в зависимости от активности лекарства могут применяться более высокие или более низкие концентрации.

В. Тканевый препарат.

Крыс разновидности Вистар умерщвляли обезглавливанием и быстро рассекали корковую ткань. Эту ткань гомогенизировали в 50 мл 0,05 М Трис буфера, рН 7,7 (буфер 1b) с помощью Политрона Бринкмана и затем центрифугировали в течение 15 мин при 40000 g. Верхний слой отбрасывали, и осадок повторно гомогенизировали в первоначальном объеме 0,05 М Трис буфера рН 7,7 и повторно центрифугировали, как описано выше. Верхний слой отбрасывали и конечный осадок повторно гомогенизировали в 50 об. буфера 2b. Такую тканевую суспензию затем хранили на льду. Конечная концентрация ткани составила 10 мг/мл. Специфическое связывание составляло 1% от общего количества добавленного лиганда и 80% от общего количества связанного лиганда.

С. Анализ.

100 мкл 0,5 М Трис-физиологических солей, рН 7,7 (буфер 2а) 830 мкл Н₂О 20 мкл среды для лекарства (для общего связывания) или 0,01 мМ клонидина (для неспецифического связывания) или соответствующая концентрация лекарства 50 мкл ³H-клонидинового сырья 1000 мкл тканевой суспензии Тканевые гомогенаты инкубировали в течение 20 мин при 25^oC с 3 нМ ³H-клонидином и различными концентрациями лекарств, после чего их немедленно фильтровали при пониженном давлении на фильтрах Ватман СF/B. Фильтры трижды промывали 5 мл охлажденного на льду 0,05 М Трис буфера, рН 7,7, после чего переносили в сцинтилляционные ампулы. К каждому образцу добавляли по 10 мл раствора Ликвисцинта, после чего осуществляли подсчет с помощью жидкостной сцинтилляционной спектроскопии. Специфическое связывание клонидина определяли как разность между общим связыванием и тем, что было установлено с помощью log-пробит анализа. Указанный процент ингибирования при каждой концентрации лекарства представляет собой среднее значение из трех определений.

Результаты анализа на связывание 3Н-клонидина соединений изобретения представлены в табл. 4.

С целью оценки степени безопасности соединений настоящего изобретения ниже приводятся данные по токсичности ряда соединений, выраженные в виде 50% -ной острой летальной дозы ALD₅₀, при испытании на мышах.

Испытываемые соединения вводились внутрибрюшинно, а в некоторых случаях подкожно.

В частности, соединения примеров 2, 8, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 19 при внутрибрюшинном введении и примеров 22, 23, 30, 38, 39 и 41 при подкожном введении показали значения ALD₅₀ >80 (мг/кг). Данный показатель для соединения примера 6 составил >40, но<80.

Кислоты, используемые для получения фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот настоящего изобретения, включают такие неорганические кислоты, как соляную, бромистоводородную, серную, азотную, фосфорную и надхлорную кислоту, а также такие органические кислоты, как винная, лимонная, уксусная, янтарная, малеиновая, фумаровая, 2-нафталинсульфокислота и щавелевая.

Активные соединения настоящего изобретения могут применяться орально, например, в присутствии инертного разбавителя или съедобного носителя либо они могут быть помещены в желатиновые капсулы или запрессованны в таблетки. В целях орального терапевтического применения активные соединения могут вводиться в присутствии эксципиентов и использоваться в виде таблеток, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток жевательной резинки и т.п. Такие препараты должны содержать по крайней мере 0,5% активного соединения, однако это количество может изменяться в зависимости от конкретной формы и может составлять 4-70% от веса дозировочной формы. Количество активного соединения в таких композициях является таким, чтобы получались подходящие дозировки. Предпочтительные композиции и препараты согласно настоящему изобретению получают таким образом, что оральная дозировочная форма содержит 1,0-300 мг активного соединения.

Таблетки, пилюли и т. п. могут также содержать следующие ингредиенты: связующие, такие как микрокристаллическая целлюлоза, аравийская камедь или желатин; эксципиенты, как крахмал или лактоза, дезинтегрирующий агент, как альгиновая кислота, Примогель, пшеничный крахмал и т.п. смазочные агенты, как стеарат магния или Стеротекс; агенты скольжения, такие как коллоидный диоксид кремния, а также подслащивающие агенты, как сахароза или сахарин, при этом могут также добавляться такие отдушки, как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновая отдушка. В том случае, когда единичная дозировочная форма представляет собой капсулу, последняя может содержать, помимо указанных выше материалов, жидкий носитель, такой как жирное масло. Другие единичные дозировочные формы могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют физическую форму единичной дозировки, например, путем образования покрытия. Так, например, таблетки или пилюли могут быть покрыты сахаром, шеллаком, или другими желудочными покрывающими агентами. Сироп может содержать, помимо активных соединений, сахарозу в качестве подслащивающего агента, а также некоторые предохраняющие агенты, красители, окрашивающие вещества и отдушки. Используемые материалы, применяемые при приготовлении таких различных композиций, должны быть фармацевтически чистыми и нетоксичными в используемых количествах.

В целях парентерального терапевтического применения активные соединения настоящего изобретения могут вводиться в раствор или суспензию. Такие препараты должны содержать по крайней мере 0,1% активного соединения, однако это количество может изменяться в интервале 0,5-30 мас. Количество активного соединения в таких композициях является таким, чтобы получалось подходящая дозировка. Предпочтительные композиции и препараты согласно настоящему изобретению готовят так, чтобы единичная парентеральная доза содержала 0,5-100 мг активного соединения.

Растворы и суспензии могут также включать следующие компоненты: стерильные разбавители, как вода, солевой раствор, фиксированные масла, полиэтиленгликоли, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, как этилендиаминтетрауксусная кислота; такие буферы, как ацетаты, цитраты или фосфаты, а также агенты для регулирования тоничности такие, как хлористый натрий или декстроза. Парентеральный препарат может быть помещен в имеющиеся в распоряжении шприцы или ампулы с многократной дозой, выполненные из стекла или пластмассы.

Примеры соединений изобретения включают следующие вещества: 1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-амин; 4-метил-1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-амин; 1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-циклопропиламин; 4-метил-1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-циклопропиламин; 1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-(2-пропинил)амин; 1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-(N-формил)амин; 1,2,3,4-тетрагидроциклопент[b]индол-3-(N-фенилметилоксикарбонил); 1,2,3,3а,4,8b-гексагидроциклопент[b]индол-3-амин; 1,2,3,3а,4,8b-гексагидро-4-метилциклопент[b]индол-3-амин; 1,2,3,3а,4,8b-гексагидро-4-метилциклопент[b]индол-3-(2-пропинил)- 4-метил-3-фенилметиламино-1,2,3,4-тетрагидроциклопент(b)- индол-7-ил метилкарбамат; 3-(N-циклопропил)-амино-4-метил-1,2,3,4-тетрагидроциклопент-[b] - индол-7-ол; 3-(N-циклопропил)амино-4-метил-1,2,3,4-тетрагидроциклопент-[b] индол-7-ил метилкарбамат; 3-циклопропиламино-1,2,3,3а, 8b-гексагидро-4-метилциклопент [b]-индол-7-ол; 3-циклопропиламино-1,2,3,3а, 4,8b-гексагидроциклопент[b] индол-7-ил фенилметилкарбонат; 3-(N-циклопропил-N-метиламинокарбонил)амино-1,2,3,3а, 4,8b- гексагидроциклопент[b] индол-7-ил фенилметилкарбонат; 3-(N-циклопропил-N-метиламинокарбонил)амино-1,2,3,3а,4,