Производные трипептидов в виде r- или rs-формы или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, фармацевтическая композиция

Производные трипептидов в виде r- или rs-формы или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Использование: в медицине и биохимии. Сущность изобретения: производные трипептидов в виде R или RS формы общей формулы: А-Pro-Arg-альдегид; A=RR, BC-, R-фенил, замещенный или незамещенный, тиенил, нафтил, замещенный или незамещенный, циклогексил, R₁-водород, низший алкил, -низший алкил, низший алкокси, или N(R₂)(R₃), в которой R₂ и R₃ независимо:водород или низший алкил: или R₂-водород, а R₃-ацетил или N-Вос (низший) алкил; А-бицеклическая группа; 1, 2, 3, 4 - тетрагидроизохинолин-1- (или 3-) - ил-карбонил, Д-пергидроизохинолин-1-ил-карбонил или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, обладающие способностью ингибировать тромбин. Реагент 1: AProOH. Реагент II:C - защищенный аргининлактам в виде трифторацетата. Процесс ведут в ДМФ при температуре - 15 град. в присутствии N - метилморфолина в течение 4 часов, затем в течение примерно суток медленно нагревают до комнатной температуры, полученный лактам восстанавливают метилалюминий гидридом. 2 с. и 12 з.п. ф-лы,., 4 табл.

Настоящее изобретение относится к ингибиторам тромбина, полезным в качестве антикоагулянтов для человека и животных. В частности, изобретение относится к производным дипептида, а именно: L-пролин-L-аргининового альдегида, обладающим высокой противотромбозной активностью.

Ингибирование тромбина в настоящее время достигается введением гепаринов и кумаринов. Механизм действия указанных средств подвергался усиленному изучению. Гепарины могут вводиться исключительно перентерально, и их дозировки должны тщательно контролироваться. Действие кумаринов основано на блокировании или ингибирования образования протромбина, при этом необходимо некоторое время для достижения максимальной эффективности.

Хотя как гепарины, так и кумарины являются эффективными антикоагулянтами, тем не менее существует необходимость в антитромбиновых средствах быстрого действия с целью предотвращения образования сгустков крови, и не препятствующих действию плазмина по растворению существующих сгустков.

Ингибирующие тромбин соединения, даваемые настоящим изобретением, представлены нижеследующей формулой 1: (1) где А представляет 1 группу формулы: в которой R-фенил формулы: где а и а' независимо представляет водород, низший алкил, низшую алкоксигруппу, галоген, трифторметил, гидроксил; или R представляет тиенил; нафтил, незамещенный или моно- или дизамещенный низшей алкоксигруппой, циклогексил; R₁ представляет водород, метил или этил; В представляет низший алкил, низшую алкоксигруппу или аминогруппу формулы: -N(R₂)(R₃), в которой R₂ и R₃ независимо представляют водород или низший алкил, или же R₂-водород, а R₃-ацетил, N-Boc (низший) алкил, при условии, что когда R₁-метил или этил, тогда В отличен от метила или этила, или А представляет бициклическую группу формулы: где Q -CH₂-CH₂-, , если Q Y представляет одноуглеродный радикал -CH₂-; R₅ представляет водород или трет-бутоксикарбонил; R₆ представляет водород; и обозначенный пунктиром круг в пределах 6-членного цикла бициклической группы указывает на пергидро-цикл; и их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли.

Пептиды формулы 1 применимы в качестве противотромбозных средств и могут быть использованы в виде вспомогательных средств при лечении тканей активатором плазминогена (АПт), стрептокиназой или урокиназой.

Эти соединения получают обычными способами. Например, Вос-D-Phg соединяют с эфиром L-пролина с образованием сложного эфира Вос-D-Phg-Pro. Сложноэфирную группу удаляют и Boc-D-Phg-Prg соединяют с лактамной формулой L-аргинина с получением лактама Boc-D-Phg-Pro-Arp в аминозащищенной форме. Лактамный цикл аргинина раскрывают восстановлением и после удаления аминозащитной группы в аргинине получают Boc-DPhg-Pro-Arg-альдегид. Полученные пептиды превращают в приемлемые солевые формы, такие как ацетаты и сульфаты.

Изобретением также дается способ предотвращения у человека и животных сгустков крови и фармацевтические составы, применимые в таком способе.

Соединения формулы 1 являются трипептидами, когда А представляют аминокислотный остаток, такой как фенилглицил (Phg), а когда А отличен от аминокислотного остатка, т. е. когда В представляет группу, отличную от аминогруппы или алкиламиногруппы, в этом случае соединения являются N-ацильными производными дипептида-пролин-аргинин-альдегида (Pro-Arg-H). Как показано формулой 1, асимметрический центр фрагмента: А(С=О) имеет R- или RS-конфигурацию, в то время как фрагментов пролина и аргинин-альдегида-L-конфигурацию.

Термины, применяемые при определении формулы 1, имеют следующие значения.

"Низший алкил" относится к С₁-C₄-алкилу нормального или изо-строения, такому как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил и т.п.

"Низшая алоксигруппа" относится к C₁-C₄-алкоксигруппе, такой как метокси-, этокси-, н-пропокси-, изопропокси-, н-бутокси-, трет-бутоксигруппе и т. п.

"Галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду.

"Моно- или ди(низший алкил) аминогруппа" относится к таким группам, как метиламино-, этиламино-, диметиламино-, метилэтиламино-, диэтиламино-, н-бутиламино-, н-пропиламино-группа и т.п.

Термин "C₁-C₆-алкил" относится к алкиду нормального или изо-строения, такому как C₁-C₄-алкил, определенный выше, и кроме того: н-пентил, изопентил, н-гексил, изомерные гексильные группы и т.п. "C₂-C₆-алкенил относится к ненасыщенным группам, таким как винил, аллил, бутенил, изомерные пентенильные и гексенильные группы, "C₃-C₇-циклоалкил" относится к циклическим углеводородам с 3-7 атомами углерода в цикле, таким как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Согласно определению формулы 1, когда А представляет группу (R)(R₁(B)C-, тогда R может быть фенилом, который может быть моно- или дизамещен. Примеры таких фенилов включают: фенил (а и а' Н), 4-метилфенил, 3-этилфенил, 4-метоксифенил, 3-метоксифенил, 3-этоксифенил, 2-метоксифенил, 3-изопропоксифенил, 4-гидроксифенил, 4-хлорфенид, 3-хлорфенил, 2-фторфенил, 3-фторфенил, 3-бромфенил, 4-фторфенил, 3-трифторметилфенил, 4-гидроксиметилфенил, 2-гидроксиметилфенил, 3-ваминофенил, 4-аминофенил, 3-амино-4-хлорфенил, 3,4-дихлоpфенил, 3-гидрокси-4-фторфенил, 3-гидрокси-4-метилфенил, 3-метокси-4-гидроксифенил, 3-хлор-4-этоксифенил и аналогичные моно- или дизамещенные фенильные группы.

Примеры R групп, когда R представляет нафтил или моно- или дизамещенный нафтил, включают: 1-нафтил, 2-нафтил, 6-метокси-2-нафтил, 8-гидрокси-1-нафтил, 8-амино-2-нафтил, 4-метил-1-нафтил, 6-хлор-2-нафтил, 4-гидрокси-6-этокси-2-нафтил, 8-метиламино-4-хлор-2-нафтил, 6,8-диметокси-2-нафтил, 6-этил-1-нафтил, 4-гидрокси-1-нафтил, 3-метокси-1-нафтил и аналогичные нафтильные группы.

Примеры группы, представленных в формуле 1, когда В аминогруппа формулы: -N(R₂)(R₃), включают: амино- (R₂ R₃ H), метиламино-, этиламино-, изопропиламино-, диметиламино-группу и аналогичные аминогруппы; и когда R₂ водород, а R₃ оксикарбонил формулы: R₄-O-C(O)-, тогда примеры таких групп включают: C₁-C₆-алкоксикарбониламиногруппы, такие как метоксикарбониламино-, этоксиикарбониламино-, трет-бутоксикарбониламино-, изоамилоксикарбониламиногруппа и т. п. C₂-C₆-алкенилоксикарбониламиногруппы, такие как винилоксикарбониламино-, аллилоксикарбониламино-, 2-бутенилоксикарбониламиногруппа и т. п. C₃-C₇-циклоалкосикарбониламиногруппы, такие как циклопропилоксикарбониламино-, циклопентилоксикарбониламино-, циклогексилоксикарбониламиногруппа и т.п. Оксикарбониламиногруппы, представленные символом В, кроме того, включают, например: бензилоксикарбониламино-, 4-нитробензилоксикарбониламино-, дифенилметоксикарбониламино-, фенилоксикарбониламиногруппу или замещенную фенилоксикарбониламиногруппу, в которой замещенный фенильный фрагмент принимает вышеприведенные значения, и т.п.

Примеры групп А(С=О) из формулы 1, когда А представляет радикал группы 1 формулы: (R)(P₁)(B)C-, включают: фенилглицил, 3-метоксифенилглицил, 4-метоксифенилглицил, 4-хлорфенилглицил, 3,4-дихлорфенилглицил, 3-трифторметилфенилглицил, N-(третбутилоксикарбонил)фенилглицил, N-(трет-бутилоксикарбонил-11-метил)фенилглицил, -метилфенилацетил, a-этилфенилацетил, a-метоксифенилацетил, a-изопропоксифенилацетил, 1-нафтилглицил, 2-нафтилглицил, N-(трет-бутоксикарбонил)-2-нафтилглицил, 2-тиенилглицил, 3-тиенилглицил, N-(циклопентилоксикарбонил)-2-тиенилглицил, 2-фурилглицил, N-этил-2-фурил-глицил, манделоил, 4-хлорманделоил, 3-метоксиманделоил, a-гидрокси-a-(2-нафтил)ацетил, a-гидрокси-a-(2-тиенил)ацетил, 1,4-циклогексадиенилглицил, 1-циклогексенилглицил, N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,4-циклогексадиенилглицил, циклогексилглицил и аналогичные А(СО) группы.

Пептидные производные, представленные формулой 1, где А-ахиральный 1-аминоциклопентил или 1-аминоциклогексил, отраженные нижеследующей структурной формулой: где р представляет углерод-углеродную связь или -СH₂-; R₂ и R₃ принимают вышеуказанные значения. Примеры подобных трипептидов включают: N-(1-аминоциклогексаноил)-Pro-Arg-H, N-(1-аминоциклопентаноил)-Pro-Arg-H; N-(1-метиламиноциклогексаноил)-Pro-Arg-H, N-(1-трет-бутилоксикарбониламиноциклогесаноил)-Pro-Arg-H и т.п.

Примеры пептидов, представленных формулой 1, где А бициклическая группа вышеприведенной формулы 2, включают D 1,2,3,4-тетраизохинолин-1-илкарбонил- и D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-илкарбонил-11-ацильные производные Pro-Arg-H, отраженные ниже: (A) (B) дигидроизоиндол-1-илкарбонильные производные, отраженные нижеприведенной формулой: (C) оксо-производные, представленные формулами: (D) (E) и их пергидрированные производные. Символы R₆ и R₅ принимают вышеуказанные значения. R₅ предпочтительно-водород и предпочтительно-водород, метоксигруппа, этоксигруппа, хлор или метил.

Фармацевтически приемлемые соли пептидов изобретения включают соли с кислотами, образованные добавлением неорганических и карбоновых кислот. Примеры образующих соли неорганических кислот включают галоидводордные кислоты, такие как хлористоводороная кислота и бромистоводородная кислота; фосфорную кислоту и серную кислоту. Соли с карбоновыми кислотами образованы с такими кислотами, как уксусная, пропионовая, малоновая, малеиновая, лимонная, янтарная, яблочная, бензойная, фумаровая и аналогичными карбоновыми кислотами. Соли с кислотами получают обычным путем, например, нейтрализации соединения I в виде свободного основания кислотой. Рекомендуемые соли с кислотами включают сульфаты и гидрохлориды.

Рекомендуемые воплощения изобретения включают соединения формулы I, где А представляют группу формулы: в которой R представляют фенил: или нафтил, или замещенный нафтил, R₁-водород и В-аминогруппа формулы: -N(R₂)(R₃). Дополнительные рекомендуемые соединения представлены вариантом, в котором R₂-водород и R₃-оксикарбонил формулы: R₄O-C(O)- Еще одно рекомендуемое воплощение изобретения включает соединения формулы I, где А бициклическая группа формулы (2). Рекомендуемые соединения такого воплощения представлены формулой I, где А(С=О) - 1,2,3,4,-тетрагидроизохинолин-1-илкарбонил (формула 2, Q -СH₂-CH₂-, Y -CH- и R₅ R₆ и 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-илкарбонил (формула 2, Соединения формулы 1 получают известными способами соединения пептидов. Согласно одному из таких способов кислоту А-СООН, где А принимает значения, указанные для формулы 1, соединяют с защищенным по карбоксилу пролином с образованием дипептида (если А аминокислота) или сложного эфира N-ацилпролина (если А отличен от аминокислоты). Карбоксилзащитную сложноэфирную группу пролинового фрагмента в полученном продукте удаляют и дипептид в виде свободной кислоты соединяют с лактамной формой аргинина. Вышеприведенная реакционная последовательность иллюстрируется нижеследующей схемой: где Р представляет аминозащитную группу.

Полученный присоединением Arg(P)-лактамный продукт (с) восстанавливают литийалюминийгидридом в инертном растворителе с раскрытием лактамного цикла и образованием трипептида в аргинин-альдегидной форме, представленного формулой: A(C=O)-PRo-Arg(P)-H, где Arg(P)-H представляет аминозащищенный аргинин-альдегид.

Лактамную форму аргинина получают внутримолекулярной реакцией аминозащищенного аргинина (Arg-OH). К примеру. Boc-Arg(CbZ)O, представленной формулой: вначале превращают в активную сложноэфирную форму, такую как активный смешанный ангидрид в реакции с хлорформатом, например, от этилхлорформата до изобутилхлорформата. Образование сложного эфира проводят в присутствии третичного амина, такого как 11-метил-формалин. Добавление более сильного третичного амина, такого как триэтиламин приводит к внутримолекулярному ацилированию с образованием лактамной формы диаминозащищенного аргинина нижеприведенной формулы: Перед использованием в реакции соединения с А(С=О)-Pro-OH согласно вышеприведенной схеме защитную Вос-группу селективно удаляют действием трифторуксусной кислоты с образованием необходимой свободной аминогруппы.

Присоединение соединения АСООН к сложному эфиру пролина, когда А - аминокислотный остаток, осуществляют первоначальной защитой аминогруппы аминокислоты. Используют обычные аминозащитные группы, часто применяемые для временной защиты или блокировки аминогруппы. Примеры подобных защитных групп включают: алкокси-, алкенилокси-, циклоалокси- и арилоксикарбонилдьные группы, такие как: этоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, трихлорэтоксикарбонил, бензилоксикарбонил, дифенилметоксикарбонил и аналогичные группы. Сложноэфирной группой, используемой для защиты карбоксила пролина в ходе реакции присоединения, может служить любая из обычно применяемых легко удаляемых сложно-эфирных групп, таких как: трет-бутил, бензил, п-нитробензил, п-метоксибензил, дифенилметил, трихлорэтил, фенацил или триалкилсилил, образующие сложный эфир. При проведении реакции присоединения для пролина используют сложноэфирную группу, которая может быть удалена в условиях, при которых аминозащитная группа остается нетронутой. Аминозащитная группа ацилирующей кислоты (АСООР) в результате остается в месте защиты аминогруппы в ходе последующего соединения с аргинин-лактамными производным и образования соединения с.

Соединения формулы 1, где А-группа (R)(R₁(B)C и В аминогруппа -N(R₂(R₃), где R₂ водород и R₃ низший алкил, получают на основе соответствующего соединения, в котором В аминогруппа, известными способами алкилирования. Например, N-метил-D-фенилглицил-L-пропил-L-аргинин-альдегид получают восстановительным алкилированием следующим образом. CbZ защищенный D-фенилглицин соединяют в ДМФА с трет-бутиловым эфиром L-пролина в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и гидроксибензотриазолла (ГОБт) с образованием дипептида: трет-бутилового эфира CbZ-D-фенилглицил-L-пролина. Полученный пептид гидрируют в этиловом спирте над палладием на угле с удалением защитной CbZ-группы, к продукту восстановления добавляют формальдегид и гидрирование продолжает с образованием трет-бутилового эфира N-метил-D-фенилглицил-L-пролина. N-метильную вторичную аминогруппу фенилглицильного фрагмента защищают CbZ-группой в реакции трет-бутилового эфира дипептида с бензилхлорформатом в ТГФ, содержащим N-метилморфолин, и образованием N-CbZ-N-метил-D-фенилглицил-L-пролин-трет-бутилового эфира. Сложноэфирную трет-бутильную группу удаляют при комнатной температуре в трифторуксусной кислоте, содержащей анизол, и получают N-CbZ-N-метил-D-фенилглицил-L-пролин. Полученный дипептид затем соединяют с CbZ-защищенный Arg-лактамом, после чего лактамный цикл раскрывают восстановлением с образованием Arg-альдегида по вышеприведенной методике. Обе CbZ-защитные группы трипептида удаляют гидрированием над Pd-C в качестве катализатора с получением N-метил-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегида.

Соединения формулы 1, где А группу (R)(R₁)(B)C-, в которой R - циклогексадиенил или циклогексенил и В алкиламиногруппа формулы: -N(R₂)(R₃), могут быть синтезированы восстановлением амина, образованного в реакции с низшим алкиловым альдегидом, цианборгидридом натрия. Аналогично подобное N-алкилирование может быть осуществлено с помощью алкилйодида и гидрида натрия.

Соединения формулы 1, где А бициклическая группа формулы 2, получают теми же самыми вышеприведенными способами присоединения. Например, пептид формулы 1, где А представляет 1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-ил, получают ацилированием сложного эфира пролина, такого как бензиловый эфир активным производным 1,2,3,4-тетрагидро-1-карбоксиизохинолина. Активные производные, которые можно при этом использовать, включают галоидангидриды кислоты, такие как хлорангидрид или бромангидрид, азид кислоты, а также активные сложные эфиры и ангидриды, типа тех, которые образуют вышеприведенным способом в реакции с хлорформатами. В ходе ацилирующего присоединения азот цикла в тетрагидроизохинолине (формула 2, R₅ H) защищают или алкилируют. Например, для ацилирования сложного эфира пролина применяют такой активный эфир, как N-Boc-1,2,3,4-тетрагидро-1-карбоксиизохинолин, образованный реакцией с изобутилхлороформатом. В полученном в качестве продукта пептиде-N-Вос-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-илкарбонил-пролин-слойный эфир удаляют эфирную группу, свободную кислоту превращают в активный эфир и последний присоединяют к лактамной форме аргинина. Полученную в качестве продукта лактам затем превращают вышеприведенным способом в альдегидную форму и получают соединение формулы 1, а именно: Вос-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-илкарбонил-Pro-Arg-H.

Пергидрированную бициклическую группу, представленную формулой 2, получают гидрированием обычным способом либо частично восстановленных, либо ненасыщенных кислот. К примеру, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-карбоновую кислоту гидрируют над оксидом платины в таком растворителе, как этанол или уксусная кислота, и получают пергидро(декагидро)изохинолин-1-карбоновую кислоту. Затем пергидрокислоту используют вышеприведенным способом для ацилирования сложного эфира пролина. Примеры подобных пергидропроизводных формулы 1 включают: N-(D-декагидроизохинолин-1-оил)-L-пропил-L-аргининальдегид и N-(D-декагидроизохинолин-3-оил)-L-пролил-L-аргинин-альдегид.

Вышеописанные реакции присоединения проводят на холоду, предпочтительно в температурном интервале от примерно -20^oC до примерно 15^oС. Реакции присоединения осуществляют в инертном органическом растворителе, таком как диметилформамид, тетрагидрофуран, хлористый метилен, хлороформ и аналогичные обычные растворители. При использовании в реакции присоединения активного эфира ацилирующей кислоты такую реакцию обычно проводят в безводных условиях.

Соединения изобретения лучше всего выделяют в виде солей с кислотами. Соли соединений формулы 1, образованные с кислотами типа, упомянутых выше, применимы в качестве фармацевтически приемлемых солей для введения противотромбоцитных средств и для приготовления составов таких средств. Для выделения и очистки пептидов могут быть использованы и другие соли с кислотами. Например, могут быть использованы соли, образованные с сульфокислотами, такими как метансульфоновая кислота, н-бутансульфоновая кислота, п-толуолсульфокислота и нафталинсульфокислота.

Рекомендуемым способом выделения и очистки соединений формулы 1 с одновременным получением целевой стабильной солевой формы является способ, согласно которому стабильные соли неорганических кислот, такие как сульфат и гидрохлорид, получают препаративной очисткой с помощью хроматографии над C₁₈ обращенной фазой. При этом водная фаза включает серную кислоту или хлористоводородную кислоту в концентрации 0,01-0,05% ацетонитрил, ТГФ, метанол или другой приемлемый растворитель служит органическим компонентом. Значение рН кислотного элюента выдерживают в интервале значений рН 4-6, при этом точное значение рН зависит от конкретного пептида и применяемой основной смолы, например, БиО-Рад-AG-1Х8 смолы в гидроксильной форме. После установления pH раствор соли трипептида, например, сульфат или гидрохлорид лиофилизуют с получением очищенной соли в виде сухого порошка. В примере такого способа сырой сульфат D-Phg-L-Pro-L-Arg-H, загрязненный примесью эпимерного сульфата D-Arg-H, растворяют в примерно 0,01%-ной серной кислоте и раствор переносят в колонку для ВЭЖХ с обращением фаз Втдак С₁₈. Для элюирования колонки в течение 10 часов используют градиент 2-10% ацетонитрила в 0,01%-ной H₂O₄. Отбирают ряд фракций и содержащие целевой продукт фракции (согласно аналитической ОФ-ВЭЖХ) объединяют. Значение рН в объединенных фракциях устанавливают в пределах 4-4,5 добавлением смолы Био-Рад AG-1Х8 в гидроксильной форме. После фильтроввания раствор лиофилизуют и получают чистый сульфат D-Phg-L-Pro-L-Arg-H.

Соединения изобретения формулы 1 ингибируют действие тромбина у человека и животных. Ингибирование тромбина показано in vitro ингибирования амидазной активности тромбина. В нижеследующей таблице 1 приведены кажущиеся константы равновесия (К_k для взаимодействия между испытуемым соединением (ингибитор) и тромбином. Приведенные в таблице данные получены в испытании, в котором тромбин гидролизует хромогенный субстрат-N-бензоил-D-фенилаланил-L-валил-L-аргинил-п-нитроанилид.

Испытание проводят в 50 мкл буфера (0,03 М трис, 0,15 М NaCl, рН 7,4) с 25 мкл раствора тромбина 0,21 мг/мл порошка тромбостата в 0,06 М Трис, 0,3 М NaCl, рН 7,4) и 150 мкл водного раствора хромогенного субстрата в концентрации 0,25 мг/мл. Добавляют растворы испытуемого соединения (25 мкл) в различных концентрациях. Степень гидролиза субстрата определяют анализом реакционной смеси при 405 нм на выделения п-нитроанилина. Строят стандартные кривые отложением концентрации свободного тромбина относительно степени гидролиза. Использованием стандартных кривых степени гидролиза, наблюдаемые в присутствии испытуемых соединений, затем переводят в значения "свободного тромбина" в соответствующих испытаниях. Связанный тромбин (связан с испытуемым соединением) подсчитывают вычитанием количества свободного тромбина, наблюдаемого в каждом испытании, из известного начального количества тромбина, применяемого в испытании. Количество свободного ингибитора подсчитывают в каждом испытании вычитанием числа молей связанного тромбина из числа молей добавляемого ингибитора (испытуемое соединение).

Значения К_k являются гипотетическими константами равновесия реакции между тромбином и испытуемым соединением (И).

Тромбин + И Тромбин-И Значение K_k рассчитывают для интервала концентраций испытуемых соединений и средние величины приводят в единицах литр на моль.

Антикоагулянтная активность соединений изобретения определена в стандартных испытаниях. В нижеследующей таблице 2 представлены данные, полученные для представительных соединений изобретения в испытаниях, использованных для определения времени протромбинового времени, тромбинового времени и времени активированного частичного тромбопластина (ВАЧТ). Цифровые значения в таблице относятся к концентрациям испытуемых соединений (нг/мл), необходимым для пролонгирования коагуляции в 2 раза в трех испытаниях. Выявление тромбинового времени осуществлено в плазме и отдельно определено в буферной системе при рН 7,5.

Представленные в таблице 2 данные получены с помощью прибора КоаСкинер фирмы Текан Инк. в испытаниях, осуществленных по нижеследующей методике.

Промтромбированное время: 50 мкл плазмы. 50 мкл солевого раствора, 7 мкл испытуемого раствора, 50 мкл тромбопластина (Дейд).

Тромбиновое время: 50 мкл плазмы, 50 мкл солевого раствора, 7 мкл испытуемого раствора, 50 мкл бычьего тромбина (2 ед. NI H/мл).

При определении тромбинового времени в буфере с рН 7,4 вместо плазмы используют фибриноген.

ВАЧТ: 50 мкл плазмы, 50 мкл Актина (Дейд), 7 мкл испытуемого раствора, 50 мкл CaCl₂ (0,01 М).

Антитромботическая активность представительных соединений изобретения определялась в испытаниях in vivo, проводимых на крысах. В испытаниях используют созданный искусственно тромбоз в сонной артерии крыс, при этом замеряют вливаемую дозу испытуемого соединения, необходимую для поддержания потока крови в течение пятидесяти минут после времени закупорки. Испытание проводят следующим образом.

У крыс искусственно создают тромбоз повреждением сонной артерии. Для повреждения сосуда используют нанесение местно раствора хлорида железа (III). Самцов крыс линии Спраг-Доли (375-450 г) анестезируют ксилазином (20 мг/кг, подкожно) и затем кетамин. HCl (100 мг/кг, п.к.). Животных помещают на водяное одеяло, в котором циркулирует вода с температурой 37^oC. Доступ к сонной артерии получают через середину цервикального разреза. Для обнаружения сосуда и отделения его от оболочки используют аккуратное отслаивание. Под артерией натягивают шелковую нить, поднимающую сосуд и создающую просвет для введения под сосудом термопары. Изменения температуры сосуда регистрируют на самописце с ленточной диаграммой, снабженным пишущими чернилами таймером. Небольшим пинцетом с раствором (35%) погружают дискит (диам. 3 мм) из ватмановской фильтровальной бумаги N 1. Диски вырезают одинаковыми по размеру с помощью заостренной трубочки (3 мм в д.) из нержавеющей стали, зажатой в патрон сверлильного пресса. Пропитанные диски накладывают на каждую сонную артерию выше термопары. Время между наложением FeCl₃ и временем резкого снижения температуры отмечают, как время закупорки сосуда (ВЗС). Среднее время, необходимое для закупорки обоих сосудов, используют для представления ВЗС для каждого зверька.

Испытуемые соединения растворяют в изотоническом солевом растворе. Для вливания растворов лекарства используют шприц-насос, и растворы начинают вливать за 15 минут до наложения FeCl₃ и продолжают вливать 60 минут после наложения HCl₃. Для определения связи между log₁₀ вливаемых дозировок и ВЗС поврежденных артерий строят кривые реакции на вводимые дозы. На основе кривых определяют сравнительный показатель антитромботической активности путем подсчета вливаемой дозы, необходимой для поддержания кровяного потока в течение 50 мин (ЭД 50 мин).

Связь между закупоркой сосуда и резким понижением температуры выявляют одновременной записью температуры и кровяного потока на одном самописце. Проксимально к термопаре вблизи к сонной артерии помещают пульсационный зонд потока Допплера. Зондом замеряют изменения в скорости потока, вследствие чего зонд устанавливают в момент отсутствия тромбоза, и когда внутренний диаметр сосуда остается постоянным в результате растяжения кровяным потоком. Нулевую линию для температуры и скорости потока (определяют пульсационным по направлению измерителем потока Допплера, модели 545-С, Университет штата Айова, Биоэнджениринг) устанавливают перед нанесением 35%-ного раствора хлорида железа (III). Результаты регистрируют в виде процента отклонения от начальной нулевой линии (6 мин до закупорки). Время, с которого температура сосуда быстро понижается, произвольно устанавливают, как нулевое, и температуру и значения скорости потока до и после закупорки сравнивают с этим моментом.

В нижеследующей таблице 3 содержатся результаты, полученные для испытуемых соединений в вышеописанном испытании с химически вызванным тромбозом у крыс.

Соединения изобретения ингибируют образование сгустков крови без заметного влияния на естественную способность организма лизировать кровяные сгустки, например, соединения оказывают низкое ингибирующее действие на фибринолизис.

Изобретением в одном из его аспектов дается способ ингибирования образования сгустков крови у человека и животных, заключающийся в ведении человеку или животному ингибирующей нетоксичной дозы соединения формулы 1. Антикоагулянтное соединение вводят перорально, парентерально, например: внутривенным вливаниеми (в.в.), внутримышечной инъекцией (в.м.) или подкожно (п.к. ). Рекомендуется введение осуществлять в.в. вливанием.

Эффективная, ингибирующая образование кровяных сгустков доза находится в интервале 5-1000 мг. Режим введения дозы может меняться, например, в профилактических целях может быть использована ежедневная разовая доза или же может оказаться приемлемым назначение в виде нескольких доз, например, 3 или 5 раз в день. В случае критических ситуаций соединение изобретение вводят в.в. вливанием со скоростью примерно между 1 мг/кг/ч и 50 мг/кг/ч, предпочтительно примерно 2,5-25 мг/кг/ч.

Способ настоящего изобретения также практикуют в сочетании с агентом лизирования кровяных сгустков, например, активатором плазминогена тканей (АПт), модифицированным АПт, стрептокиназой или урокиназой. В случаях, когда произошло образование сгустков и артерия или вена оказались блокированными частично или полностью, обычно используют агент лизирования кровяного сгустка. Соединение изобретения может быть введено одновременно с визирующим средством или после его использования для предотвращения повторного образования кровяного сгустка.

При осуществлении способа изобретения желательно использовать рекомендуемые изобретением соединения. К примеру, используют предпочтительные соединения описанного выше типа. К предпочтительным пептидам относятся: N-Boc-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинил-альдегид и N-метил-D-фенилглицил-L-пропил-L-аргинин-альдегид, которые находятся в виде соли, например, в виде сульфата или гидрохлорида. Особенно предпочтительным для использования этим способом является сульфат N-(D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-оил)-2-пролил-2-аргинин-альдегида.

Изобретение предоставляет также фармацевтические препаративные формулы для использования в описанном выше терапевтическом способе. Фармацевтические препаративные формы изобретения включают эффективное, ингибирующее образование сгустка крови количество соединения формулы 1 и фармацевтически приемлемый носитель. Для орального введения противотромбическое соединение приготавливают в виде желатиновых капсул или таблеток, которые могут содержать различные наполнители, такие как связующие средства, смазочные агенты, структурирующие агенты и т.п. Для парентерального использования противотромботическое средство вводят в фармацевтически приемлемый разбавитель, например, физиологический солевой раствор (0,9%), 5%-ную декстрозу, раствор Ринджера и т.п.

Противотромботическое соединение изобретения может преобразовываться в единичную дозирование формы, содержащие дозу примерно между 1 мг и 1000 мг предпочтительно соединение находятся в виде фармацевтически приемлемой соли, такой как, например сульфат, ацетат или фосфат. Например, единичный дозированный препарат содержит 5 мг сульфата N-Вос-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегида в 10 мл стерильной стеклянной ампуле. Другой пример единичной дозированной формы содержит 10 мг сульфата N-метил-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегида в 20 мл изотонического солевого раствора, заключенного в стерильную ампулу.

Предпочтительная препаративная форма представляет собой единичную дозировочную форму, содержащую 5-50 мг сульфата N-(D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-L-оил)-L-пролил-L-аргинин-альдегида в стерильных ампулах.

Соединения могут вводиться различными путями, включая оральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, носовой. Соединения настоящего изобретения предпочтительно перед назначением для приема преобразуются в препаративные формы, включающие эффективное количество соединения формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли, или сольвата в сочетании с фармацевтическими приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

Активный ингредиент в таких препаративных формах составляет от 0,1% до 99,9% весовых от формы. "Фармацевтически приемлемый" означает, что носитель, разбавитель или эксципиент должен быть совместимыми с другими ингредиентами препаративной формы и не причинять вреда реципиенту.

Настоящие препаративные формы получают по известным методикам с использованием известных или легко доступных ингредиентов. Композиции данного изобретения могут формулироваться так, чтобы обеспечивать быстрое, поддерживаемое на одном уровне или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения пациенту, с использованием известных методик. При получении композиции или составов настоящего изобретения активный ингредиент обычно смешивают с носителем или разбавляют носителем или заключают внутрь носителя, который может быть в форме капсул, пастилок, бумажных или других контейнеров. Когда носитель служит как разбавитель, он может быть твердым, полу-твердым или жидким материалом, который действует как связующее вещество, эксципиент или среда для активного ингредиента. Так, составы могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, пастилок, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердых веществ или в жидкой среде), мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиторий, стерильных растворов для инъекций, стерильных упакованных порошков и т.д.

Ниже приводятся примеры препаративных форм, которые иллюстрируют, но не ограничивают объем изобретения. "Активный ингредиент", конечно, означает соединение формулы 1 или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват.

Препаративная форма 1 Твердые желатиновые капсулы готовят с использованием следующих ингредиентов (количество, мг/капсула) Активный ингредиент 250 Крахмал, высушенный 200 Стеарат магния 10 Общий вес 460 мг Препаративная форма 2 Таблетки готовят с использованием следующих ингредиентов (количество, мг/таблетку): Активный ингредиент 250 Микрокристаллическая целлюлоза 400 Двуокись кремния 10 Стеариновая кислота 5 Общий вес 665 мг Компоненты смешивают и прессуют с образованием таблеток каждая весом 665 мг.

Предварительная форма 3 Аэрозольный раствор готовят с использованием следующих компонентов (вес): Активный ингредиент 0,25 Этанол 25,75 Распыляющее вещество, препеллент 22 (хлордифторметан) 70,00 Общий вес 100,00 Активное вещество смешивают с этанолом, и смесь добавляют к части пропеллента 22, охлажденного до -30^oC, и переносят в наполняющее устройство. Требуемое количество затем подают в контейнер из нержавеющей стали и разбавляют оставшимся пропеллентом. Затем устанавливают на контейнере вентиль.

Препаративная форма 4 Таблетки, каждая из которых содержит 60 мг активного ингредиента, изготавливают следующим образом: Активный ингредиент 60 мг Крахмал 45 мг Микрокристаллическая целлюлоза 35 мг Поливинилпиролидон (в виде 10% раствора в воде) 4 мг Карбоксиметилкрахмал натрия 4,5 мг Стеарат магния 0,5 мг Тальк 1,0 мг Общее количество 150,00 мг Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито с отверстиями N 45 мет США и тщательно перемешивают. Водный раствор, содержащий поливинилпирролидон, смешивают с получающимся в результате порошком и смесь пропускают через сито с отверстиями 14 мет США. Гранулы, полученные таким образом, сушат при 50^oC и пропускают через сито N 18 США. Карбоксиметилкрахмал натрия, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сито с отверстиями N 60 США, затем добавляют к гранулам, которые после перемешивания прессуют в таблетки и получают таблетки, каждая из которых весит 150 мг.

Препаративная форма 5.

Капсулы, каждая из которых содержит 80 мг активного ингредиента, приготавливают следующим образом: Активный ингредиент 80 мг Крахмал 59 мг Микрокристаллическая