Устройство и способ введения биологического материала

Устройство и способ введения биологического материала

Реферат

 

Назначение: изобретение относится к области биотехнологии, в частности к области введения молекул в клетки. Сущность изобретения: устройство содержит источник газа, резервуар для внедряемого материала, средство подачи внедряемого материала, камеру для внедрения материала в клетки. Внедряемый материал фиксируют на частицах носителя и в газовом потоке при повышенном давлении приводят в контакт с обрабатываемыми клетками. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл.

Изобретение касается устройства для введения биологического материала в живые клетки, содержащее резервуар для внедрения в клетку материала с входным и выходным отверстиями и источник газа под давлением с выходным отверстием для газа, сообщенным с резервуаром.

Изобретение также касается соответствующего способа введения биологического материала в растительные клетки, предусматривающего предварительное культивирование клеток и внедрение биологического материала, связанного с частицами носителя, в клетку.

Поскольку значительное количество современных исследований направлено на генетическую трансформацию клеток, биологам требуется вводить в живые клетки самые разнообразные материалы. Известные технологии введения биологических материалов в живые клетки используют электропорацию, прямое поглощение ДНК, механизмы слияния, использование инфицирующих агентов, а также микроинъекции. Все эти технологии однако очень сложны, недостаточно эффективны и их трудно контролировать. Кроме того, не все эти технологии пригодны для введения биологических материалов в растительные клетки, которые обычно имеют значительно более прочную оболочку.

Поэтому сравнительно недавно Сэнфорд и др. предложили способ доставки биологического материала в живые клетки с использованием газа под давлением [см. Klein et al. (1987), Nature, 337, а также Sanford et al. (1988), Particular Sci. and Technol, (5:27-37)] По технологии Сэнфорда, небольшие частицы высокой плотности (вольфрам) ускоряют до высокой скорости с помощью стреляющей частицами "пушки". Это позволяло обеспечить проникновение биологического материла на частицах в растительные клетки. Применялось несколько вариантов выполнения "пушки": 1) со стрельбой пластиковыми микроснарядами в мишенную пластину; 2) с использованием механического импульса; 3) с использованием центростремительного ускорения и 4) с использованием газового (воздушного) разряда. Последний вариант, в котором стрельба ведется нагруженными суспензиями биологического материала вольфрамовыми частицами посредством газового разряда, представляет наибольший интерес. При этом используют описанное во вступительном абзаце устройство, включающее резервуар для внедрения в клетку материала с входным и выходным отверстиями для газа, сообщенным с резервуаром.

Однако, несмотря на то, что эта технология представляет собой значительный шаг вперед в данной области, она также не лишена некоторых недостатков. Так, трудно регулировать количество суспензии, которой нагружаются вольфрамовые частицы, чем затрудняется воспроизведение результатов эксперимента и повторная прививка культур является весьма трудоемкой процедурой. Кроме того, скорость должна варьироваться для изменения, при необходимости, характеристик стрельбы, но при этом скорость суспензии не может быть измерена непосредственно.

Изобретение предлагает усовершенствованную технологию введения в живые клетки, а именно в первом своем аспекте предлагает устройство указанного типа, отличающееся тем, что оно содержит три контейнера, первый служащий источником газа, второй служащий средством подачи внедряемого материала и третий служащий резервуаром для внедряемого материала, трубку для макроприцеливания с входным и выходным отверстиями, первое из которых сообщено с выходным отверстием третьего контейнера, двойной трехходовой клапан с двумя вспомогательными клапанами, первый из которых служит для селективной пневматической связи между выходным отверстием первого контейнера или выходным отверстием из второго контейнера с входным отверстием третьего контейнера и для обеспечения селективного сообщения между входным отверстием трубки макроприцеливания и выходным отверстием третьего контейнера.

Во втором аспекте, изобретение предлагает способ введения биологического материала в растительные клетки, предусматривающий предварительное культивирование клеток и внедрение биологического материала, связанного с частицами носителя, в клетки, усовершенствованный тем, что связывание биологического материала осуществляют посредством фиксирования его в объеме от 0,5 до 1000 микролитров на частицах носителя диаметром от 0,1 до 100 микрон и плотностью от 1 до 25 г/кв. см, а внедрение проводят посредством подачи связанного материала к клеткам с потоком газа объемом от 1 до 100 мл и молекулярным весом от 2 до 40 атомных единиц под давлением 15 150 атм, обеспечивающим ускорение со скоростью, достаточной для проникновения внедряемого материала внутрь клетки.

Следует учитывать, что изобретение может использоваться для ускорения самых разнообразных материалов, хотя создано оно конкретно для ускорения суспензии биологического материала.

Используемый биологический материал может быть как клеточным, так и неклеточным. Частицы (клетки) этого материала могут быть сравнительно небольшого размера, предпочтительно, менее одного микрона, еще более предпочтительно менее 0,1 микрона. В общем случае количество используемого биологического материала будет составлять до 5 микрограмм, хотя конкретные количества могут варьироваться в зависимости от типа используемого клеточного материала.

Под термином "неклеточный биологический материал" подразумевается такой материал, как вирусы (вирус табачной мозаики (ТМВ), вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), вирус полосатости маиса (ВПМ) и т.д.), органеллы (например, митохондрии, ядра, хлоропласты или плазмиды), генетический материал (например, либо РНК, либо ДНК или в форме плазмид, или однонитевой, или двухнитевой), протеины (антитела или ферменты) или красители.

Когда в качестве неклеточного биологического материала используют ДНК, то ДНК может встраиваться в вектор, приспособленный для экспрессии экзогенного гена в клетках. Соответствующие векторы трансформации включают векторы экспрессии.

Векторы, пригодные для экспрессии, в общем случае должны включать, помимо кодирующей последовательности необходимого экзогенного гена, соответствующие боковые регулирующие последовательности. Такие боковые последовательности включают соответствующий промотор, способный промотировать транскрипцию и экспрессию "ин-виво" в клетках, а также терминатор трансляции, способный сообщать о конце транскрипции или обеспечивать соответствующую обработку РНК таким образом, чтобы осуществлялась соответствующая трансляция информационной РНК для синтеза протеина.

Когда ДНК- инсерт вставляют в живую клетку, в предпочтительном варианте на отдельной стадии просеивают потомство, чтобы отобрать трансформированные клетки, так как не все клетки будут иметь инсерты, и не все клетки или потомство будут принимать ДНК-инсерт в свой геном. Наличие целевого ДНК-инсерта в клетках может быть затем установлено при помощи самых разнообразных приемов, в зависимости от природы ДНК.

Вектор трансформации может содержать маркер, позволяющий проводить отбор трансформированных клеток. Селекционный маркер может содержать либо признак, который можно определить биохимически, либо фенотипный признак, который устанавливается визуально.

Альтернативой использованию таких маркеров могут быть соответствующие морфологические или биохимические испытания для выявления трансформированного потомства. Морфологическое просеивающее испытание может быть проведено для основного фенотипного признака в потомстве. Соответствующим биохимическим методом селекции является блоттинг по Саузерну с зондом, гибридизирующимся с самой трансформирующей ДНК в геноме микроорганизма, растительных или животных клетках.

Присутствие гена, который продуцирует экзогенный продукт, может также обнаруживаться путем выделения и лизиса клетки и анализа их цитоплазмы на экзогенный продукт, или анализа их ядер на экзогенный ген. Экзогенный продукт может быть обнаружен при помощи электрофореза, хроматографии, иммуноанализа, блоттингом по Саузерну и т.п.

Под термином "клеточный биологический материал" подразумеваются отдельные или многоклеточные массы клеточных микроорганизмов, растительных или животных клеток.

В настоящем описании выражение "клеточные микроорганизмы" включает бактерии и простейшие.

В настоящем описании выражение "растительные клетки" включает клетки, которые являются интактными в растении, или части растения, такие как, например, цветы, зерна, колосья, орехи, листья, шелуха, стебли, растительные клеточные или тканевые культуры, которые содержат или не содержат клеточные оболочки или другие естественные защитные покрытия, например, протопласты, растительные наплывы, растительные ткани побегов или стволов, субклеточные структуры, зерна пыльцы, растительные меристемы, яйцеклетки, зиготы, семена, способные к проращиванию.

Растительные клетки могут быть получены из любых растительных видов. Термин "растительный вид" включает однодольные растения (например, травы и злаковые сельскохозяйственные культуры, такие как маис, рожь, ячмень, пшеница, сорго, овес, просо и рис), и двудольные растения (например, широколиственные растения, такие как табак, картофель и люцерна).

Как используется здесь, термин "животные клетки" включает ткани млекопитающих, рыбы, птицы, рептилий и амфибий.

Биологический материал может быть адсорбирован на поверхности несущей частицы при помощи самых разнообразных приемов. Например, биологический материал может быть получен при помощи простой сушки на соответствующих несущих частицах, как описано ниже.

Несущие частицы должны иметь размеры, форму и плотность, достаточные для проникновения через клеточную мембрану и/или клеточную оболочку, не нанося существенного физического ущерба самой клетке. Несущие частицы, которые являются слишком малыми или недостаточно плотными, могут оказаться неспособными к проникновению в некоторые клетки, в то время как несущие частицы, которые являются слишком большими или слишком плотными, могут оказаться гибельными для других. Факторы, отличные от размера частиц, такие как присутствие клеточной оболочки или избыток внутриклеточных ядер, могут также влиять на зависимость эффективности трансформации от выбранных размеров или плотности "снарядов".

В общем случае, несущие частицы имеют диаметр в пределах от 0,1 микрона до 100 микрон, в предпочтительном варианте от 0,5 микрона до 5 микрон. В общем случае, несущие частицы имеют плотность в области от 1 грамма/сантиметр³ (г/см³) до 25 г/см³, в предпочтительном варианте от 10 г/см³ до 25 г/см³.

Несущие частицы могут быть изготовлены из биологически инертного плотного материала. Такие примеры материалов включают некоторые металлы, например вольфрам, золото, платину, палладий, серебро и никель, латекс, стекло, керамику, хирургические сплавы и кристаллы феррита.

В соответствии с другим вариантом выполнения, несущие материалы могут быть биологическими материалами, заключенными в инертные материалы. Примерами образующих капсулу агентов является полилизин (молекулярный вес 200000). Агент, образующий капсулу, наносят на частицы при помощи увлажнения частиц раствором такого агента, а затем сушки воздухом или нагревания таким образом покрытых частиц. После того как несущие частицы покрыты агентом, образующим капсулу, и соответствующим образом высушены, затем частицы носителя могу быть нагружены биологическим материалом. В качестве альтернативы, заключение в капсулу биологического материала может быть осуществлено вместе с осаждением материала на частицы.

Кроме того, клеточный биологический материал (прокариотный или эукариотный) может быть заморожен, суспендирован в несущей среде и использован в качестве снарядов для ускорения непосредственно в субстанцию-мишень.

Любая среда, которая не представляет опасности для внедряемого биологического материала, пригодна для использования в качестве носителя.

Биологический материал может быть культивирован в любой среде, пригодной поддерживать метаболизм и рост субстанций и/или клеток. Примеры культур приведены у Мурашиге и Скуга (1962), Physiol. Plantarum, т.15, стр. 473 496, и Шенка и Хилдебрандта (1972), Canadian Journal of Botany, т.50,стр. 199 - 204.

Несущую среду необходимо выбирать так, чтобы она имела достаточную текучесть для переноса несущих частиц внутри ее. Текучесть несущей среды зависит от плотности, поверхностного натяжения, эффективного объема и вязкости внедряемого материала. В предпочтительном варианте несущая среда должна быть способной суспендировать клеточный или неклеточный биологический материал и, необязательно, несущие частицы.

В общем случае, несущая среда должна иметь плотность, которая эффективна с точки зрения поддержания частиц внутри себя, когда она движется. В предпочтительном варианте, плотность несущей среды должна содержаться в области от 0,5 грамм на кубический сантиметр (г/см³) до 2,0 г/см³.

В общем случае, несущая среда должна иметь поверхностное натяжение, которое эффективно с точки зрения поддержания своего когезионного внедряемого объема. В предпочтительном варианте поверхностное натяжение несущей среды должно изменяться в области от 20 до 80 дин/см.

В общем случае, несущая среда должна иметь объем, который эффективен с точки зрения суспендирования необходимого количества несущих частиц. В предпочтительном варианте объем несущей среды должен изменяться от 0,5 микролитра до 1000 микролитров.

В общем случае, несущая среда должна иметь вязкость, которая эффективна с точки зрения поддержания когезионного внедряемого объема и суспендирования частиц. В предпочтительном варианте вязкость несущей среды должна изменяться в области от 0,1 до 10 сантипуаз, в самом предпочтительном варианте от 0,5 до 2 сантипуаз.

Примеры несущих сред включают жидкости, такие как вода, этанол; буферные растворы, включая фосфатные, цитратные и ацетатные буферы; растворы солей, включая хлориды калия, натрия и кальция; гликоли, глицерины и фторированные углеводороды; и жидкий азот, когда клеточный или неклеточный биологический материал заморожен.

Соответствующая субстанция-мишень может быть клеточным биологическим материалом; или неклеточным биологическим материалом, каждый из которых описан выше. Биологический материал может быть культивирован/внесен в любую среду, способную поддерживать биологический материал во время удара микрочастиц.

На клетки может быть нанесен слой масла, чтобы регулировать гидравлическое давление среды и улучшить живучесть клеток, способствуя закрытию повреждения, возникающего во время проникновения. Например, живые клетки могут быть промыты в изотонном растворе с тем, чтобы поддержать в момент прокалывания мембраны баланс осмотического давления внутриклеточной субстанции внеклеточного раствора в зоне "прокола" мембраны клетки. Здесь могут присутствовать ионы кальция в качестве стабилизирующего мембрану агента так, что поврежденная часть мембраны может быть быстро восстановлена. Примеры изотонных растворов включают растворы, которые в общем случае используют в различных приемах микроинъекций в растительные клетки, раствор Рингера для клеток холоднокровных животных, простейших и микроорганизмов, растворы Рингера-Лока, Рингера-Тирода и другие растворы для клеток животных.

Бомбардировки субстации-мишени может приводить к тому, что часть пробы теряется из-за рассеяния при соударении внедряемого материала и субстанции-мишени. Примеры удерживающих средств для удерживания субстанции-мишени на месте включает фильтрующую бумагу, среду агара, металлические сита и клетки из металлических сеток. Например, последующие инкубирование и окрашивание клеточного биологического материала может быть осуществлено непосредственно на фильтрующей бумаге. В соответствии с другим вариантом выполнения, как субстанция-мишень, так и внедряемый материал могут быть помещены в раствор, а затем их можно бомбардировать непокрытыми несущими частицами, которые суспендированы в несущей среде. Такие несущие частицы могут притягивать к себе заданный объем внешнего раствора, содержащего неклеточный биологический материал в клеточном биологическом материале.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения будет теперь описан со ссылкой на чертежи. Устройство, являющееся предметом настоящего изобретения, может иметь любую соответствующую конструкцию, позволяющую заранее определенному выбранному объему газа, имеющему выбранное давление газа, контактировать и ускорять заранее определенное количество внедряемого в клетку материала в направлении выбранной субстанции-мишени.

Признаки и преимущества настоящего изобретения более подробно рассматриваются ниже со ссылкой на сопровождающие чертежи, на которых изображено: фиг. 1 схема устройства по изобретению; фиг.2 схема клапана, используемого с устройством на фиг. 1; фиг.3 схема варианта выполнения источника газа под давлением для использования с устройством по изобретению; фиг.4 и 5 варианты выполнения резервуара для внедряемого материала, используемого с устройством на фиг.1 по изобретению; фиг.6 и 7 варианты выполнения средства подачи внедряемого материала с трубкой макроприцеливания; фиг.8 схематическое представление варианта выполнения средства измерения скорости для использования с устройством по изобретению; фиг.9 схема синхронизирующего средства для использования с устройство по изобретению; фиг.10 и 11 электрические схемы для средства измерения скорости на фиг. 6, и фиг.12 график необработанных данных, использованных для измерения времени полета внедряемого материала при помощи электрической схемы, описанной ниже в параграфе "Примеры".

На фиг. 1 схематически изображено устройство 1, которое содержит многоцелевой клапан 2, источник газа под давлением 3, источник 4 подлежащего внедрению в клетку материала, резервуар 5 для внедряемого материала, имеющий входное и выходное отверстие, средство подачи 6 и средство для извлечения 7.

Многоцелевой клапан 2 выбирают таким образом, чтобы он имел конструкцию, допускающую возможность селективной связи между либо источником под давлением 3, либо, необязательно, источником 4 внедряемого материала и резервуаром 5 для внедряемого материала. Многоцелевой клапан 2 также выбирают так, чтобы он имел конструкцию, способную обеспечить селективную связь между резервуаром 5 для внедряемого в клетку материала, и либо средством подачи 6, либо необязательно, средством для извлечения 7.

Как показано на фиг.2, одно из осуществлений многоцелевого клапана 2 может содержать первый подклапан 8 и второй подклапан 9. Первый подклапан 8 обеспечивает селективную связь между либо выходным отверстием источника газа под давлением 3, либо выходным отверстием источника 4 внедряемого в клетку материала, и входным отверстием резервуара 5 для внедряемого материала. Второй подклапан 9 обеспечивает селективную связь между выходным отверстием резервуара 5 для внедряемого в клетку материала и либо входным отверстием средства подачи 6, либо входным отверстием средства 7 для извлечения.

Примерами выполнения первого подклапана 8 и второго подклапана 9 могут быть отдельно один трехканальный клапан или два двухканальных клапана при условии, что двухканальные клапаны могут находиться в оперативной взаимосвязи через соответствующее средство. Примеры средств для поддержания двухканальных клапанов в оперативной связи включают общий привод 10 или раздельные приводы (не показаны).

Приводы первого 8 и второго 9 подклапанов выбирают таким образом, чтобы обеспечить переключение подач под давлением на клапан. В общем случае, любой привод, способный осуществить линейное или вращательное движение, можно использовать. Примеры приводов включают пневматическое средство двойного действия, функционирующее при помощи зубчато-шестеренной передачи. Когда используют различные приводы, эти приводы могут быть синхронизированы при помощи средства типа таймера (не показан). Примеры таймерных средств включают многополюсные переключатели в комбинации с вспомогательными соленоидами или общими, приводящими в движение, валами.

В предпочтительном варианте, приводы находятся в оперативной комбинации с ножной педалью (не показана), что упрощает функционирование и увеличивает производительность устройства.

В общем случае, резервуар 5 для внедряемого в клетку материала может быть выбран из любого количества контейнеров, таких как трубы. Резервуар 5 для внедряемого материала может в предпочтительном варианте иметь внутреннюю поверхность, выбранную с тем, чтобы установить внутреннее пространство с относительным удлинением, достаточным для того, чтобы обеспечить равномерное впрыскивание внедряемого в клетку материала и обеспечить минимальное замедление, т.е. такое, которое прилипает или смачивает внутренние стенки резервуара 5 для внедряемого в клетку материала. Примеры резервуара 5 для внедряемого материала способны удерживать от 0,005 мл до 100 мл внедряемого материала.

В общем случае, резервуар 5 для внедряемого материала изготавливают из материала, физически достаточно прочного для загрузки внедряемого материала из источника 4 внедряемого материала и/или газа из источника газа под давлением 3 без физических деформаций. В предпочтительном варианте резервуар 5 для внедряемого в клетку материала может быть изготовлен из материала, способного выдержать давление по меньшей мере 1000 фт/кв.дм (70,3 кг/см²) при физиологических температурах. Примером материала, который используют при изготовлении резервуара 5, является нержавеющая сталь.

Как можно видеть на фиг. 2, температуру внутри резервуара 5 можно регулировать при помощи средства для регулирования температуры 11. Примеры средств для регулирования температуры включают термопары, установленные в нагревательном блоке, окружающем резервуар 5 для внедряемого материала.

Хотя схемы, показанные на фиг. 1 и 2, демонстрируют использование только одного источника внедряемого материала, принципы, изложенные при описании работы устройства 1, могут быть легко применены к случаю использования двух или более типов внедряемого материала из нескольких источников внедряемого материала.

В общем случае объем внедряемого материала можно регулировать при помощи любого средства, которое обеспечивает измеримые, репродуцируемые пробы внедряемого материала. Если используют трубку или что-либо подобное, то трубка, способная удерживать один объем, может быть заменена на другую трубку, способную удерживать другой объем. Однако вышеупомянутое устройство не ограничивается таким образом. Например, датчик уровня (не показан) может быть установлен в любом месте, эффективном с точки зрения обеспечения точных репродуцируемых измерений объема внедряемого в клетки материала в резервуаре 5 для внедряемого материала.

Как можно видеть на фиг. 1, источник газа под давлением 3 может содержать средство 12 подачи газа и, необязательно, средство 13 регулирования потока газа. Источник газа под давлением 3 выбирают так, чтобы обеспечить заранее определенные объемы газа в резервуаре 5 для внедряемого в клетку материала. Давление газа зависит от типа используемого газа и объема газа. В общем случае, давление газа варьирует от 15 атмосфер (атм) до 150 атм.

Источником газа под давлением 3 можно управлять при помощи любого средства, которое способно обеспечить подачу газа под необходимым давлением в резервуар 5 для внедряемого материала. Это средство для регулирования газа может функционировать автоматически или с клавиатуры.

В предпочтительном варианте источник газа под давлением 3 должен быть способен непрерывно подавать объемы газа в резервуар 5 для внедряемого материала, чтобы позволить относительно быстро перезарядить устройство 1.

Примером источника газа под давлением 3, кроме того, является источник, приведенный на фиг. 3. Как показано на фиг. 3, источник газа под давлением 3 содержит средство 12 подачи газа, выполненное в виде емкости для подачи газа, имеющей выходное отверстие; трубопровод 14 для подачи газа, имеющий входное отверстие и выходное отверстие; и средство 13 для регулирования потока газа в форме газового клапана 15 и резервуара для газа 16, имеющего входное отверстие и выходное отверстие.

Выходное отверстие резервуара 12 для подачи газа находится в пневматической связи с входным отверстием трубопровода для подачи газа 14. Выходное отверстие трубопровода для подачи газа 14 находится в свою очередь в селективной пневматической связи через газовый клапан 15 с входным отверстием резервуара для газа 16.

Примеры средств 12 для подачи газа включают газовые цилиндры и емкости.

Резервуар для газа 16 может быть выбран из произвольного числа контейнеров, таких как трубы. Примеры резервуаров для газа должны быть способны удерживать от 1 мл до 100 мл газа.

В общем случае, резервуар для газа 16 может быть изготовлен из физически прочного материала, чтобы иметь возможность загрузить газом из источника газа под давлением 3 без его физической деформации. В предпочтительном варианте, резервуар для газа 16 должен быть способным выдерживать давление газа до 150 атм. Примеры материалов для использования при изготовлении трубопровода для подачи газа включают нержавеющую сталь.

Газ необходимо выбрать таким образом, чтобы он имел достаточно низкий молекулярный вес, чтобы допустить достаточно быстрое расширение для достижения необходимых скоростей частиц. В общем случае, молекулярный вес газа должен изменяться в области от 2 до 40 единиц атомных масс (еам). Примеры таких газов включают гелий, водород и воздух.

Как утверждалось выше со ссылкой на фиг. 1 и 2, устройство в предпочтительном варианте содержит источник внедряемого в клетку материала в селективной жидкостной связи с резервуаром для внедряемого материала 5. Если источник 4 внедряемого материала отсутствует, то резервуар 5 для внедряемого материала может быть заполнен вручную и затем установлена жидкостная связь с устройством.

Как показано на фиг. 1 и как, в частности, показано на фиг 4 и 5, источник 4 внедряемого материала выбирают таким образом, чтобы он был способен обеспечить заранее определенные объемы внедряемого материала в резервуаре 5 для внедряемого материала.

В предпочтительном варианте источник 4 внедряемого материала должен быть способным непрерывно обеспечивать выбранные объемы внедряемого материала в резервуар 5 для внедряемого материала, чтобы иметь возможность относительно быстро повторно запускать устройство 1. Источник 4 внедряемого в клетку материала содержит средство 17 для подачи внедряемого материала. Примеры средств 17 для подачи внедряемого материала включают шприцы, емкости, трубо- или другие проводы.

В общем случае, средство 17 для подачи внедряемого материала может быть изготовлено из материала, который способен к стерилизации. Примеры таких материалов включают нержавеющую сталь и политетрафторэтилен.

В зависимости от наделенной регулирующей способности средства для подачи внедряемого материала, это устройство может содержать средство, способное регулировать поток внедряемого материала, т.е. средство 18 для регулирования внедряемого материала. Средство 18 для регулирования внедряемого материала может находиться в оперативной комбинации со средством для подачи внедряемого материала 17, чтобы иметь возможность обеспечить выбранный объем внедряемого материала в резервуаре 5 для внедряемого материала. Примеры средств 18 регулирования внедряемого материала включают клапаны и насосы.

Как было указано ранее, примеры вариантов осуществления источника 4 внедряемого материала приведены на фиг. 4 и 5. Эти варианты показывают источники 4 внедряемого в клетки материала, способные выдавать заданный объем внедряемого материала.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, как это показано на фиг. 4, источник 4 внедряемого материала содержит средство 17 подачи внедряемого материала в форме шприца 17а, имеющего выходное отверстие, и трубопровод 19 для подачи внедряемого материала, имеющий входное и выходное отверстие. Выходное отверстие шприца 17а находится в селективной жидкостной связи с входным отверстием трубопровода 19 для подачи внедряемого материала. Выходное отверстие трубопровода 19 для подачи внедряемого материала находится в свою очередь в жидкостной связи с входным отверстием многоцелевого клапана 2, ведущим к резервуару 5 для внедряемого материала.

В соответствии с еще одним вариантом выполнения, как это можно видеть на фиг. 5, источник внедряемого в клетку материала содержит средство 17 для подачи внедряемого материала в форме емкости 17б для подачи внедряемого материала, имеющей выходное отверстие, средство 18 для регулирования внедряемого материала в форме клапана для внедряемого материала 18а, и трубопровод 19 для подачи внедряемого материала, имеющий входное и выходное отверстие. Выходное отверстие из емкости 17б находится в селективной жидкостной связи через клапан 18 для внедряемого материала с входным отверстие трубопровода 19 для подачи внедряемого материала. Выходное отверстие трубопровода 19 для подачи внедряемого материала, в свою очередь, находится в связи с входным отверстием клапана 2, ведущим к резервуару 5 для внедряемого материала.

В зависимости от времени, в течение которого внедряемый материал выдерживают в емкости 17б подачи внедряемого материала, емкость 17б для подачи внедряемого материала может находиться в оперативной комбинации со средством 11 для регулирования температуры, как это показано в альтернативном осуществлении на фиг.5, чтобы поддержать внедряемый материал при заданной температуре. Примеры средств регулирования температуры включают термопары 11, вставленные в блок нагревания, окружающий емкость 17б для подачи внедряемого материала.

В зависимости от относительной вязкости несущей среды, емкость 17б для подачи внедряемого материала может находиться в оперативной комбинации со средством 20 для перемешивания, чтобы поддержать частицы в суспензии в несущей среде. Примеры средств 20 для перемешивания включают насосы типа шприца с возвратно-поступательным ходом поршня, пластину для магнитного перемешивания, клапанно-насосную конструкцию, создающую изменяющиеся направления потока внутри емкости 17б для подачи внедряемой жидкости. В предпочтительном варианте, средство 20 для перемешивания выбирают таким образом, чтобы обеспечить изменяющиеся направления потока внутри резервуара 5 для внедряемого материала, например, насос типа шприца с возвратно-поступательным ходом поршня.

Как можно видеть на фиг.1 и 2, выходное отверстие резервуара 5 для внедряемого материала может находиться в селективной связи через многоцелевой клапан 2 с входным отверстие средства 7 для извлечения.

Средство 7 для извлечения дает возможность сбить избыточный внедряемый материал из резервуара 5. Средство 7 включает любое средство для отбора внедряемого материала. Предпочтительное средство 7 представляет собой закрываемую трубку, из которой можно извлечь материал. Такая конструкция позволяет, кроме того, создать открытую систему, в которой средство 7 для перемешивания, например, шприц-насос с возвратно-поступательным ходом поршня может быть селективно подключен таким образом, чтобы обеспечить изменяющиеся направления потока внутри резервуара 5 для внедряемого материала.

Средство 7 для извлечения может быть изготовлено из любого материала, который способен удерживать и не наносить какого-либо ущерба внедряемому материалу. В предпочтительном варианте, чтобы избежать значительного перелива соответствующего внедряемого материала из резервуара для внедряемого материала, средство 7 для извлечения может быть изготовлено из прозрачного материала, чтобы иметь возможность легко измерить содержание в нем материала. Примеры материалов, способных обеспечить визуальную проверку перелива, включают политетрафторэтилен (ПТФЭ).

Средства доставки Как можно видать на фиг.1, 2 и 9, выходное отверстие резервуара 5 для внедряемого материала может находиться в селективной связи через многоцелевой клапан 2 с входным отверстие средства доставки 6.

Средство для доставки 6, в частности, показанное на фиг.6 и 7, обеспечивает относительно точное "наведение на цель" внедряемого в клетку материала. Средство 6 может содержать средство 21 для макроприцеливания и/или средство 22 для микроприцеливания. Ввиду сопротивления внедряемого материала, поступающего из резервуара 5 для внедряемого материала (показано на фиг.1 и 2), в предпочтительном варианте, если средство 6 для высвобождения содержит средство микроприцеливания 22, оно также содержит средство для макроприцеливания.

Как можно видеть на фиг.6, средство для макроприцеливания 21, в свою очередь, находится в жидкостной связи со средством для микроприцеливания 22.

В общем случае, средство для макроприцеливания 21 выбирают таким образом, чтобы оно имело внутреннюю поверхность, которая определяет канал с длиной, геометрией и диаметром, достаточными для того, чтобы предотвратить существенное снижение ускорения внедряемого материала из-за газа, обходящего внедряемый материал. В предпочтительном варианте средством для макроприцеливания 21 является трубка, выбранная таким образом, чтобы она имела внутреннюю поверхность, определяющую в общем случае цилиндрический канал с внутренним диаметром в области от 500 микрон до 2 000 микрон, в предпочтительном варианте от 750 до примерно 1 250 микрон.

Средство для макроприцеливания 21 может быть изготовлено из любого материала, способного поддерживать свою форму при условиях доставки. Примеры материалов включают стекло, пластик и нержавеющую сталь.

Если средство доставки состоит только из средства для макроприцеливания 21, оно может быть использовано для ускорения внедряемого материала в так называемом режиме стрельбы из "дробовика". Если средство для доставки содержит средство для микроприцеливания 22, то оно обеспечивает относительно более точное прицеливание для внедряемого материала.

В соответствии с первым вариантом осуществления, как это можно видеть на фиг. 6, средство для микроприцеливания 22 содержит пипетку 23, которая находится в жидкостной связи со средством для макроприцеливания 21, микроинструмент 24 расположен в захвате 25, жестко соединенном с подвижным средством 26 микроманипулятора 27 с тремя степенями свободы. Микроманипулятор 27 может содержать ручку управления (не показана), которая регулирует положение пипетки 23.

Пипетку 23 необходимо выбирать таким образом, чтобы она имела внутренний диаметр с просветом достаточного размера для прохода внедряемого материала. Внутренний диаметр пипетки в общем случае изменяется от примерно 10 микрон до примерно 500 микрон, в предпочтительном варианте от примерно 100 до примерно 250 микрон. Пипетки получают известным способом из капиллярной трубки в соответствии с хорошо известными приемами (смотри, в общем случае, Graessman и др. (1980), Methods in Enzymology, 65: 816 825).

Примеры средств 22 для микроприцеливания предпочтительно сконструировать из известных устройств для микроинъекций, которые после изучения настоящего описания могут быть очень легко модифицированы, чтобы получить средство для микроприцеливания, необходимое специалисту.

Известные средства и приемы для микроинъекций изложены в следующих публикациях: Патент N 4743548; Jamamoto etal. (1982), Exp. Cell Res. 142: 79-84, Purres (1981), Methods for Intracellular Recording Jonopnoresis; Ocho et al. (1981), Acta Med, Okayama 35: 381-384, Lawrence and Davies (1985), Plant Cell Rep. 4:33-35, Steinbiss, et al. (1984), In: Proceedings of the 1984 Wye International Symposium, Experimental Manipulation of Ovule Tissue: Theur Micromanipulation, Tissue Culture and Physioljgy; Steinbiss and Stabel (1983), Protoplasma, 116: 223-227, Morikawa and Yamade (1981), Plant Cell Physiol, 26: 229-236, Grassman, et al. (1980) In: Methods in Enzymology, 65: 816-825, and Zin and Ruddle (1981), Exp. Cell Res. 134: 485-488.

Кроме того, несмотря на возможность визуальног