Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита в, очищенная частица поверхностного антигена гепатита в человека и вакцина против гепатита в

Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита в, очищенная частица поверхностного антигена гепатита в человека и вакцина против гепатита в

Реферат

 

Изобретение относится к вирусологии. Сущность изобретения состоит в том, что получают очищенную частицу поверхностного гепатита В человека, состоящую, мас. %: S24 кД негликозилированный 6,24; S27 кД гликолизированный 15,6; pre-S2-33 кД моногликозилированный 10,8; pre-S1-39 кД негликолизированный 6,1, pre-S1-41 кД гликозилированный 1,9, рrе 2-36 кД дигликолизированный 3,2%. На основе указанной частицы и приемлемого носителя создана вакцина против гепатита. 7 з.п. ф-лы, 4 табл, 7 ил.

Заражение вирусом гепатита В (ВГВ) является проблемой здравоохранения мирового значения. ВГВ приводит к неизлечимым, а иногда и фатальным заболеваниям печени, поражающим, как установлено, только в США 20000 новых жертв ежегодно. На Дальнем Востоке, в Африке и Восточной Европе около 10% населения являются хроническими носителями ВГВ, вследствие чего хронический активный гепатит и цирроз печени являются основной причиной смертности. Кроме того, имеются серьезные свидетельства того, что носители ВГВ гораздо более подвержены раку печени, а ВГВ относится к одним из немногих вирусов, для которых известно участие в раковых заболеваниях человека.

Таким образом, существует настоятельная необходимость в создании безопасной и экономически приемлемой вакцины для защиты от инфицирования ВГВ. Предложено несколько подходов создания подобной вакцины (Tiollais и др. Nature 317, 489-495 (1985), Palzer и др. Vaccine 85, 261-264, Коулд Спринг Хорбор (1985) и Zuckerman, Infection 13, 61-71, дополнение А (1986)).

Как указано во всех вышеприведенных обзорах, базовым компонентом всех полученных вакцин является поверхностный антиген гепатита В (HBsAg). Этот антиген первоначально был выделен из плазмы крови хронических больных, инфицированных ВГВ, и был использован в качестве эффективной вакцины против инфицирования ВГВ.

В плазме крови ВГВ-инфицированных носителей HBsAg присутствует как в виде ВГВ инфицирующих 42 нм вирусных частиц (частицы Дейна), так и в виде неинфицирующих 22 нм частиц, свободных от ВГВ-ДНК и других структурных белков ВГВ. У людей хронических носителей ВГВ или в ходе виремии наблюдается перепроизводство 22 нм частиц. Такие 22 нм частицы секретируются трансформируемой ВГВ гепатомной клеточной линией.

В высшей степени иммуногенные 22 нм частицы состоят из шести родственных белков: (а) основных белков-Р-24 в негликозилированной форме с молекулярным весом 2400 дальтон (24 К) и GP-27, являющегося гликозилированной формой Р-24, с молекулярным весом 27000 дальтон (27 К). Белки кодируются S областью генома ВГВ и содержат 226 аминокислот, (в) присутствующих в меньших количествах белков GP-33 в моногликозилированной форме с молекулярным весом 33000 дальтон (33 К) и GP-36 в дигликозилированной форме с молекулярным весом 36000 дальтон (36 К), которые кодируются пред- S2 и S областью генома ВГВ и содержат 281 аминокислот (226 в S области +55 в пред- S2 области), (с) присутствующих в меньших количествах белков Р-39 в негликозилированной форме и GP-42, являющегося гликозилированной формой Р-39, с молекулярными весами соответственно в 39000 и 42000 дальтон (39 К, 42 К), которые кодируются пред- S1, пред- S2 и S областью генома ВГВ и содержат 389-400 аминокислот (226 S +55 пред- S 2+/108-119/ пред-S1). Таким образом, все белки 22 нм частиц HBsAg кодируются одной и той же непрерывающейся последовательностью ВГВ геномной ДНК, а их конечная форма зависит от места инициирования экспрессии гена (транскрипции и трансляции) и от того, происходило и, если происходило, то в какой степени гликозилирование после трансляции.

22 нм частицы HBsAg могут быть образованы из Р-24/ Gp-27(S область), независимо от пред- S2 и пред- S1 продуктов. Недавно показано, что пред- S2 специфичные белки (GP-33 и GP-36), а также пред- S1 специфичные белки (GP-39 и GP-42) обладают антигенными детерминантами, независимыми от Р-24, в результате чего их присутствие в 22 нм частицах HBsAg повышает иммуногенность.

Кроме того, присутствие пред- S2 и пред- S1 белков придает 22 нм частицам HBsAg способность связывать полимеризованный альбумин сыворотки крови человека, что напрямую связано со способностью вирусных частиц ВГВ связывать целевые клетки в ходе инфицирования ВГВ. Таким образом, частицы HBsAg, содержащие детерминанты белков как из пред- S области, так и S области, могут быть использованы в качестве вакцин, вызывающих реакцию, направленную на нейтрализацию вирусных частей и на предотвращение инфицирования этими частицами целевых клеток. В результате подобная вакцина обеспечивает эффективную долговременную защиту от инфицирования ВГВ (Persina и др. Proc.Natl. Acad. Sci. США 82, 3440-3444(1985), Neurath, и др. Nature 315, 154-156(1985), Neurath и др. Cell 46, 429-436(1986) Petit и др. Mol. Immunol. 23,511-523 (1986) и Milich и др. J.Immunol. 137,315-322(1986)).

Способы получения вакцины HBsAg и получаемые этими способами вакцины.

1. Вакцины из плазмы крови. В крови первоначальные вакцины HBsAg, одобренные к применению и используемые в программах иммунизации, получали из плазмы крови хронических носителей ВГВ. Ниже приводятся примеры способов получения вакцин из плазмы крови: (а) вакцина Гептавакс В производства Мерк, Шарп и Доом (Hilleman и др. J.Infection 7, 3-8, приложение 1(1983)); (в) вакцина Гевак производства Пастеровского института (Adamowiez и др. Vaceine 2,209-214(1984) и патент США N 4335214, выдан 15 июля 1982 г.).

Обоими вышеприведенными способами, как заявлено, получают из плазмы 22 нм частицы очень высокой чистоты, не содержащие инфекционных примесей, вследствие чего безопасные для применения в качестве вакцин для человека. Однако используемые в обоих способах ключевые стадии длительны и дорогостоящи, поскольку включают фракционирование в полиэтиленгликоле (ПЭГ) или сульфате аммония с последующим ультрацентрифугированием в градиентах сахарозы и хлорида цезия. Описаны и другие более быстрые и более дешевые способы получения из плазмы вакцины HBsAg, но обычно также включающие стадии фракционирования в полиэтиленгликоле (ПЭГ) или сульфате аммония, изопикнического разделения с применением ультрацентрифугирования и хроматографическое разделение на различных хроматографических смолах. Однако и эти все способы дороги и длительны, что приводит к высокой стоимости вакцин на основе плазмы крови человека ("Вакцина гепатита В", под ред. Maupas и Guesry (1981), Эльзевир /Норт Гoлланд Биомедикал Пресс, Амстердам, Нью-Йорк, Оксфорд). И, наконец, основным недостатком вакцин на основе плазмы, содержащих 22 нм частицы HBsAg является их потенциальная опасность для здоровья. Хотя способ получения предусматривают применение материалов, дезактивирующих возможно совместно очищаемые примеси, которые могут включать вирусы СПИД, тем не менее существует потенциальная опасность того, что такие вакцины могут вызвать нежелательные побочные эффекты (Walgate, Nature 304, 297(1983)). По этой причине для получения 22 нм частиц HBsAg для вакцин использована технология генной инженерии, обеспечивающая эффективные и безопасные способы получения частиц HBsAg, не содержащих потенциально опасных примесей, как в случае применения плазмы.

2. Получение вакцин HBsAg методами биотехнологии в прокариотных (Escherichia coli) системах. Описан способ конструирования рекомбинантных векторов и плазмид для экспрессии HBsAg и для очистки HBsAg от прокариотных систем (патент США N 4428941, выдан 31 января 1984, заявки на патенты фирмы Такеда Кем. Индастриз ЕРО 068719 А2, публикация 5 января 1983 г. и WO/86/00640, публикация 30 января 1986 г.). Способы получения HBsAg из таких трансформированных бактериальных систем основаны на тех же методиках, ранее охарактеризованных для получения HBsAg из плазмы. Однако, поскольку подобные прокариотные системы не способны секретировать образовавшийся HBsAg, в этом случае необходима дополнительная стадия лизиса трансформированных клеток. При этом возникает возможность совместной очистки потенциально опасных бактериальных эндотоксинов. Помимо этого прокариотные системы не способны гликозилировать продукты HBsAg, как не способны создавать из них 22 нм частицы. В результате вакцины, полученные этим способом, уступают вакцинам на основе плазмы крови (Charpay и др. Nature 286, 893-895 (1980)).

Таким образом, были созданы эукариотные экспрессионные системы для получения рекомбинантных HBsAg, и такие системы способны давать HBsAg, которые и гликозилированы, и сформированы в 22 нм частицы.

3. Получение вакцин HBsAg в эукариотной клеточной культуре с применением дрожжевых клеток. Примеры вакцин, полученных в эукариотной культуре с применением клеток, включают: продажную вакцину Рекомбивакс НВ производства Мерк, Шарп и Доом (МШД) (Emini и др. J. Infection 13,3-9, приложение A(1986)) и вакцину рекомбинантных HBsAg производства Смит-Клайн Корп. (патент США N 4649192, выдан 10 января 1987 г. и заявка EPO 199688А, публикация 29 октября 1986 г.) Однако полученные этими способами частицы HBsAg являются продуктами только S области, и не содержат детерминант пред- S2 и пред- S1, поскольку трансформирующая плазмида включает последовательность только S области. Вследствие этого такие частицы не столь иммуногенны, как "естественные" частицы из плазмы. Дрожжевые клетки так же не способны секретировать частицы HBsAg и, хотя они могут гликозилировать белки HBsAg, результат гликозилирования не совпадает с гликозилированием в клетках млекопитающего. Хотя в дрожжах и происходит формирование 22 нм частиц, образовавшиеся частицы нестабильны. Способ получения требует химической обработки полученных из дрожжей HBsAg с целью получения конечного продукта, аналогичного продукту из плазмы, к тому же, чтобы сделать продукт безопасным для человека, необходима, как полагают, обработка формалином. В обоих способах, так же как на стадиях очистки с применением детергентов и мочевины, может произойти структурное изменение молекулы HBsAg, что может привести к потере антигенности и повышению стоимости производства.

Позднее использованы дрожжевые системы с получением частиц HBsAg, содержащих помимо детерминант области так же и пред- S2 детерминантны (EPO 171908A3, публикация 19 февраля 1986 г. Такеда Кем. Инд. Япония и EPO 175261 A2, публикация 26 марта 1986 г. Хирон Корп.). Хотя такие предложенные вакцины и должны содержать детерминанты пред- S2 области, в них, тем не менее, отсутствуют детерминанты пред- S1 области. Кроме того, способы их получения все еще проблематичны, как вышеуказано, вследствие применения дрожжевой системы.

Таким образом, системой для получения вакцин с частицами HBsAg, которая, видимо, наиболее перспективна, оказывается способ с культивированием клеток млекопитающего.

4. Вакцины и способы их получения в системах с культивированием клеток млекопитающего. В системах с культивированием клеток млекопитающего гликозилирование частиц HBsAg такое же, что и в "естественных" частицах ВГВ людей-носителей. Получаемые частицами HBsAg формируются "естественным" путем, не требуя дополнительной химической обработки. И, наконец, 22 нм частицы HBsAg секретируются такими клетками в культурную среду, из которой они могут быть легко выделены без лизина клеток.

Однако основная проблема в синтезе вакцины рекомбинантных HBsAg в культуре тканей млекопитающего заключается в получении полного спектра белков HBsAg, сформированных в аутентичные 22 нм частицы HBsAg. Видимо, белки пред- S1 области (P-39 и GP-42) ингибируют секрецию 22 нм частиц HBsAg (Ou и Rutter, J. Virol. 61, 782-786 (1987), Persing и др. J. Virol. 61, 172-1677 (1987)).

Некоторые потенциальные вакцины HBsAg, получаемые в системе с клетками млекопитающего, используют для направления экспрессии HBsAg гетерологичные онкогенные вирусные экспрессионные векторы (например, SV 40 аденовируса). Такие способы проводят к получению частиц HBsAg, не содержащих детерминанты пред- S1 области, с экспрессией только пред- S2 и S областей. Применение для экспрессии частиц HBsAg гетерологических регулирующих элементов приводит к неэффективному формированию частиц и в результате к более низким выходам. Из-за более низких выходов и отсутствия пред- S1 области, с иммуногенной точки зрения, такая вакцина также несовершенна. И, наконец, способы очистки, описанные для подобных систем, длительны и дороги и, как правило, включают для получения очищенных HBsAq фракционирование в ПЭГ или сульфате аммония с последующим ультрацентрифугированием (EPO 0389765 A1, публикация 28 октября 1981 г. EPO 145589 A3, публикация 19 июня 1985 г. EPO 201416 A1, публикация 12 ноября 1986 г. и EPO 185573 A1, публикация 25 июня 1986 г. право на все эти патенты принадлежат Пастеровскому институту).

Описаны и другие способы получения частиц HBsAg из культур рекомбинантных клеток млекопитающего (EPO 168234 A, публикация 15 января 1986 г. правоприемник Генетик Корп.) Однако и в этой системе также используются дорогостоящие и длительные стадии фракционирования в ПЭГ или сульфате аммония с центрифугированием для получения очищенного продукта. Конечный продукт (частицы HBsAg) в такой системе содержит белки только S области.

Недавно описана система, которая, как заявлено, успешно использует культивирование клеток млекопитающего с получением частиц HBsAg, содержащих белки со всеми иммуногенными детерминантами, а именно: пред- S1, пред- S2 и S. Однако и в этой системе для экспрессии гена применяют гетерологическую регулирующую последовательность (металлотионеиновый промотор мыши), что требует культивирования клеток в присутствии ионов тяжелых металлов и/или стероидных гормонов. Если их затем не удалить из конечного продукта, тот может оказаться потенциально опасным. Кроме того, описанный способ также включает дорогостоящие и длительные стадии фракционирования в ПЭГ и последующего центрифугирования для получения очищенного продукта. Далее из-за применения в экспрессионной системе гетерологических генных регулирующих последовательностей стехиометрия пред- S1, пред- S2 и S детерминант может быть и неидеальной для получения HBsAg продукта с высокой иммуногенностью (EPO 198474 A1, публикация 22 октября 1986 г. правоприемник Эндотроникс).

5. Новый способ получения вакцины в системах с культивированием клеток млекопитающего. В свете вышеприведенных недостатков получения вакцин из рекомбинантных клеток млекопитающего создан новый недорогой способ получения больших количеств высоко очищенных частиц HBsAg, обладающих высокой иммуногенностью и большим сходством с "естественным" продуктом. Такие частицы составляют основу очень эффективной и недорогой вакцины. Кроме того, новый продукт содержит все антигенные детерминанты, а именно детерминанты пред- S1, пред- S2 и S областей, создаваемые в экспрессионной системе с применением "естественных" ВГВ генных регулирующих последовательностей, что приводит к частицам, стехиометрическим аналогичным "естественным" частицам из плазмы крови.

Цель изобретения состоит в создании нового способа получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B, заключающегося в: (a) культивировании клеток млекопитающего, продуцирующих частицы в культурной среде таким образом, что клетки секретируют частицы поверхностного антигена гепатита B в культурную среду, при этом среда содержит сыворотку, свободную от молекул с молекулярным весом выше 3 10⁵ дальтон, (b) удалении целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученной культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B, (c) обработке полученной культурной среды с концентрированием и очисткой содержащихся в ней частиц поверхностного антигена гепатита B, (d) выделении полученных концентрированных и очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B.

В особенно рекомендуемом способе изобретения очищенные и концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека могут быть получены: (a) культивированием клеток млекопитающего, продуцирующих частицы в культурной среде таким образом, что клетки секретируют частицы поверхностного антигена гепатита B человека в культурную среду, при этом среда содержит сыворотку, свободную от молекул с молекулярным весом более 310⁵ дальтон, (b) удалением целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученных культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B человека, (c) обработкой полученной культурной среды с получением раствора, содержащего концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека, (d) обработкой полученного раствора, содержащего концентрированные частицы антигена, с уменьшением в растворе содержания ДНК, (e) регулированием pH в полученном в результате растворе, содержащем очищенные и концентрированные частицы поверхностного антигена, с установлением, если необходимо, pH в интервале 3-7, (f) очисткой концентрированных частиц поверхностного антигена, присутствующих в полученном растворе, (g) выделением очищенных концентрированных частиц поверхностного антигена гепатита B человека.

Более конкретно, изобретение относится к новому способу очистки частиц поверхностного антигена гепатита B, а именно, высокоиммуногенных частиц 22 нм HBsAg. Эти частицы используют в качестве антигена, вызывающего иммунную реакцию для нейтрализации ВГВ вирусной инфекции по отношению к целевым клеткам. Еще более конкретно, способ очистки характеризуется наличием новой стадии предфракционирования, а именно, стадии ультрафильтрования, которую применяют для удаления молекул с молекулярным весом более 310⁵ из культурной среды, в которую секретируются частицы поверхностного антигена гепатита B.

Способ очистки по изобретению включает различные стадии. На первой стадии выращивают частицы HBsAg, которые секретируются в культурную среду, содержащую ростовую сыворотку. Культурную среду вначале предфракционируют с удалением клеточных примесей с высоким молекулярным весом, а именно, выше 300 К. Предфракционирование культурной среды, содержащей сыворотку, является важной стадией, позволяющей достигать высокой чистоты с наименьшим числом стадий очистки. Молекулы с молекулярным весом выше 310⁵ дальтон включают высокомолекулярные белковые комплексные примеси, первоначально присутствующие в плодной сыворотке теленка, используемой в культурной среде, и их предварительное удаление дает следующие преимущества: клетки могут быть выращены в культурной среде, содержащей большие количества ПСТ, рост клеток усиливается, поскольку высокомолекулярные комплексы, возможно, могут ингибировать рост клеток, очистка HBsAg упрощается, поскольку такие высокомолекулярные белковые комплексы обычно являются основными примесями, удаляемыми в процессах очистки.

На последующих этапах очистки в первую очередь достигается отделение высокомолекулярных частиц HBsAg от низкомолекулярных примесей, например, белковых примесей. Вначале из полученной культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B, удаляют целые клетки, клеточные осколки и агрегаты частиц. Затем полученную культурную среду обрабатывают с концентрированием и очисткой содержащихся в ней частиц поверхностного антигена гепатита B, после чего полученные концентрированные очищенные частицы поверхностного антигена гепатита B удаляют. Эти стадии более подробно описаны в последующих примерах, в частности, в примере 5.

В особенно рекомендуемом варианте изобретения получают очищенные концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека. Способ включает после первых трех стадий процесса очистки, о котором идет речь в примере 5, т.е. предфракционирование культурной среды, удаление целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из собранной культурной среды, содержащей частицы HBsAg, и обработка полученной культурной среды с получением раствора, содержащего концентрированные частицы HBsAg человека, видоизменение вышеописанного процесса очистки. Полученный раствор, содержащий концентрированные частицы антигена, обрабатывают таким образом, что при этом в растворе уменьшается количество ДНК, после чего при необходимости регулируют pH с установлением его в пределах 3-7. В одном рекомендуемом воплощении изобретения pH устанавливают добавлением кислоты до появления помутнения. Образовавшаяся муть содержит белковые примеси и может быть отделена от частиц поверхностного антигена гепатита B. После этого выделяют очищенные концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека. Такие отличия и преимущества, достигаемые за их счет, по сравнению со способом, используемым в примере 5, более подробно охарактеризованы в примере II.

С помощью способов изобретения достигают усиленного роста клеток в содержащей ПСТ среде одновременно с возможностью достигать упрощенным путем высокой чистоты секретируемых этими клетками частиц HBsAg. В способе не применяют фракционирования в полиэтиленгликоле (ПЭГ) или сульфате аммония, как не применяют разделения центрифугированием (включая ультрацентрифугирование) или аффинной хроматографией. Способ быстр и эффективен с получением с высокими выходами высокочистого продукта, а поскольку способ основан на компонентах, которые могут быть рециркулированы, то он и не дорог. Таким образом, имеется возможность получать продукт высокой чистоты при очень низкой стоимости. В свою очередь это позволяет получать эффективную вакцину ВГВ с более широким спектром потенциальных потребителей, которые раньше не могли позволить себе гораздо более дорогие продаваемые сейчас вакцины.

Наконец, изобретением даются частицы HBsAg, продуцируемые в системе клеток млекопитающего, которая содержит все встречающиеся в природе антигенные детерминанты (пред- S2, пред- S1 и S) в количествах, отражающих "естественную" стехиометрию. Этот продукт иммуногенен для всех потенциальных потребителей и позволяет преодолеть проблему отсутствия реакции на детерминанты S области или пред- S2 области при наличии также и пред- S1 детерминант (Zuckerman, J. Infection 13, 61-67 (приложение А) (1986)).

На фиг. 1 схематично представлено конструирование pSPHBV8-1. С помощью Pstl происходит гидролитическое расщепление p7.5A126 (11800 п.о.), выделяют фрагмент в 3800 п.о. содержащий ВГВ последовательности, фланкированные ДНК Александера человека, субклонируют в Pstl сайте pSP64 путем легирования T₄ДНК лигазой.

На фиг. 2 схематично представлено конструирование pSPHBVB8. С помощью EcoR1 и Xba1 проводят полное гидролитическое расщепление pSPHBV8-1 с последующим выделением фрагмента в 500 п.о. содержащего HBV-A126 промотор и кодирующую последовательность для пред- S1. Отдельной реакцией с помощью EcoR1 и Psfl проводят гидролитическое расщепление pSPHBV8-1 с выделением фрагмента в 2400 п.о. содержащего кодирующие последовательности для пред- S2 и S, а также выделяют HBV-A126 промотор и сигнал полиаденилирования. Оба фрагмента субклонируют в тандеме в psP65, разрезанной с помощью Xba1 и Pst1 в тройственной процедуре легирования.

На фиг. 3 схематично представлено конструирование pSPHBVA13 и pSPHBVB813. Из pSVE100-dhfr гидролитическим расщеплением с помощью EcoR1 выделяют dhfr ген, флакированный SV40P_E и SV40 сигналом полиаденилирования, с заполнением концов фрагментов Кленова и дальнейшим гидролитическим расщеплением с помощью Sma1. Фрагмент в 1300 п.о. с тупым концом субклонируют в Pvull сайт pSPHBV8-1 и pSPHBVB8 с получением плазмид pSPHBVA13 и pSPHBVB813, которые содержат последовательности для HBsAg, а также dhfr.

На фиг. 4 показано расслаивание частиц HBsAg очищенный HsAg в сахарозе. Частицами нагружают градиент сахарозы в интервале 50-5% ультрацентрифугируемый в роторе Бекман SW27 при 27000 об/мин, 16-21^oC, 18 ч. Фракции по 1,8 мл, отобранные из нижней части, анализируют на присутствие HBsAg и концентрацию сахароза (рефрактометр).

На фиг. 5 показан твердофазный радиоиммунноанализ на HBsAg используют набор для твердофазного радиоиммунноанализа (травенол): (a) известные стандарты (Абботт) сравнивают с калибровочной кривой для рекомбинантных HBsAg (CHO) заявителя; (b) калибровочную кривую вакцины рекомбинантных HBsAg, полученной в клетках СНО (вакцина заявителя (СНО)), сравнивают с калибровочными кривыми для вакцины (HBsAg) из плазмы ( Гептавакс В ) и для дрожжевой рекомбинантной вакцины ( Рекомбивакс НВ ).

На фиг. 6 показана активность HBsAg в испытании сероконверсией. Вакцину заявителя (СНО) сравнивают с вакциной на основе плазмы крови ( Гептавакс В ) и с дрожжевой рекомбинантной вакциной ( Рекомбивакс НВ ). Машей (Бальб/с) инфицируют внутрибрюшинно 1 мл вакцины (для каждой концентрации вакцины применяют 10 мышей). Через 30 дней после инфицирования мышей обескровливают и сыворотку испытывают на присутствие антител к HBsAg с помощью набора Аусаб EIA^TM ( Абботт ), калиброванного по ссылочной сыворотке (WHO).

На фиг. 7 показано обнаружение и количественное определение антигенов к S детерминантам у мыши с отсутствием реакции, инъектированной вакциной заявителя в сравнении с дрожжевой рекомбинантной вакциной ( Рекомбивакс НВ ).

В изобретении предлагается способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B, заключающийся в: (а) культивировании клеток млекопитающего продуцирующих частицы в культурную среду таким образом, что происходит секретирование клетками частиц поверхностного антигена гепатита B в культурную среду, при этом среда содержит сыворотку, свободную от молекул с молекулярным весом более 310⁵ дальтон, (b) удалении целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученной культурной среды, содержащей частиц поверхностного антигена гепатита B, (c) обработке полученной культурной среды с концентрированием и очисткой содержащихся в ней частиц поверхностного антигена гепатита B, (d) выделении полученных концентрированных и очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B.

Полученные вышеприведенным способом частицы могут быть частицами поверхностного антигена гепатита B человека.

Кроме того, дается способ выделения очищенных частиц HBsAq, включающий дальнейшую очистку полученных на стадии (c) частиц HBsAg с удалением низкомолекулярных примесей при пропускании содержащего частицы раствора через хроматографическую колонку и выделении этих частиц. Концентрирование на стадии (c) осуществляют в соответствующих условиях, позволяющих проводить дальнейшую очистку частиц в непрерывной системе очистки.

Важным элементом изобретения является то, что сыворотка, добавляемая в среду с клетками млекопитающего, секретирующими частицы антигена гепатита, например, плодная сыворотка теленка, не содержит примесей высокомолекулярных белков (например, белков с молекулярным весом более 300000 дальтон) перед помещением в среду клеток. Такие белки удаляют из сыворотки, например, предфракционированием, к примеру, ультрафильтрованием.

Невозможность удаления белковых примесей с молекулярным весом более 300 К из сыворотки приводит к высокому содержанию белковых примесей на последующих этапах очистки, снижению выходов и чистоты.

Хотя в изобретении предфракционирование осуществляют проведением стадии ультрафильтрования, для специалиста, очевидно, что любой метод снижения содержания высокомолекулярных белковых примесей в сыворотке, добавляемой к среде, даст аналогичный результат.

Отделение частиц поверхностного антигена гепатита B от целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц также может быть осуществлено любыми известными специалисту средствами, но рекомендуется проведение стадии ультрафильтрования. Полученный на стадии ультрафильтрования фильтрат, содержащий частицы HBsAg, затем собирают и подвергают дальнейшей очистке.

Поскольку объемы загрузок, используемых на стадии разделения (b), слишком громоздки, для их применения на рекомендуемых последующих стадиях очистки на хроматографических колонках, например, стадиях гель-хроматографии, частицы HBsAg могут быть подвергнуты дальнейшему концентрированию и дальнейшей очистке. Очистку рекомендуют осуществлять обработкой фильтрата, полученного после стадии разделения (b), на стадии ультрафильтрования с удалением загрязняющих примесей с молекулярным весом ниже 300 К. Отфильтрованный продукт, содержащий целевые частицы HBsAg, может быть затем подвергнут дальнейшей очистке. В рекомендуемом воплощении изобретения дальнейшую очистку осуществляют диализом, и после диализа для дальнейшей концентрации рекомендуют проводить еще одну стадию ультрафильтрования.

Концентрированные очищенные частицы HBsAg могут быть с помощью хроматографии, предпочтительно гель-фильтрующих колонок, подвергнуты дополнительной очистке с дальнейшим удалением загрязняющих низкомолекулярных веществ. Стадию гель-фильтрации для еще большей очистки рекомендуют проводить дважды. Хроматографию гель-фильтрацией рекомендуют проводить на колонке, заполненной аллилдекстраном, ковалентно сшитом N,N'-метиленбисакриламидом. На гель-фильтрующей колонке происходит удаление молекул с молекулярным весом выше 110 дальтон. Более подробно процесс описан в последующих примерах, в частности, в примере 5.

В особенно рекомендуемом способе изобретения очищенные концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека могут быть получены: (a) культивированием клеток млекопитающего, продуцирующих частицы в культурную среду таким образом, что происходит секретирование клетками в среду частиц поверхностного антигена гепатита B человека, при этом в состав среды вводят сыворотку, не содержащую молекул с молекулярным весом более 310⁵ дальтон, (b) удалением целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученной культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B человека, (c) обработкой полученной культурной среды с получением раствора, содержащего концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека, (d) обработкой полученного раствора, содержащего концентрированные частицы антигена, с понижением в растворе содержания ДНК, (e) регулированием pH в полученном в результате растворе, содержащем концентрированные и очищенные частицы поверхностного антигена, с установлением, если необходимо pH в пределах 3-7, (f) очисткой очищенных концентрированных частиц поверхностного антигена, содержащихся в полученном растворе, (g) выделением очищенных концентрированных частиц поверхностного антигена гепатита B человека.

Такой особенно рекомендуемый пример способ описан далее в примере II. В соответствии с таким особенно рекомендуемым способом раствор, содержащий выделенный на стадии (c) концентрированные частицы антигена, перед выделением подвергают дополнительной очистке. Стадии a, b, и c особенно рекомендуемого способа такие же, как и в способе, приведенном в примере 5, и вышеприведенное описание способа примера 5 также применимо к способу примера II. Дополнительный рекомендуемый способ описан в примере 13.

После обработки культурной среды с получением в результате раствора, содержащего концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека, полученный раствор обрабатывают с понижением в нем содержания ДНК. В одном рекомендуемом способе (пример II) обработка с уменьшением содержания ДНК заключается в добавлении к раствору ДНКазы. В другом рекомендуемом способе (пример 13) обработка с уменьшением содержания ДНК заключается в обработке раствора с помощью анионообменной хроматографии, предпочтительно на колонке, заполненной сшитой агарозой с присутствующими на ней диэтиламиноэтильными функциональными группами. Такая стадия анионообменной хроматографии может быть также проведена после обработки раствора ДНКазой.

Значение pH полученного в результате раствора, содержащего концентрированные и очищенные частицы поверхностного антигена, затем при необходимости регулируют с установлением pH в пределах 3-7. В одном из рекомендуемых воплощений изобретения pH устанавливают обработкой полученного раствора кислотой до появления помутнения. Муть содержит белковые примеси, которые могут быть удалены от частиц поверхностного антигена гепатита B, предпочтительно центрифугированием. Эта стадия представляет дополнительный этап очистки обработанных кислотой частиц антигена.

Или же ДНК и белковые примеси могут быть удалены из указанного раствора частиц антигена с помощью ионообменной хроматографии, предпочтительно анионообменной хроматографии, в которой частицы HBsAg элюируются с потоком через слой адсорбента, а ДНК и белковые примеси остаются связанными или удерживаются в колонке. В качестве анионообменной колонки рекомендуется использовать анионообменную колонку с ДЭАЭ. В особенно рекомендуемом воплощении изобретения анионообменная колонка, используемая для удаления ДНК и других примесей, заполнена агарозой с ДЭАЭ функциональными группами. Одним из примеров подобных колонок является колонка с ДЭАЭ-сефарозой. Данный способ более подробно освещен в примере 13.

Альтернатива заключается в сочетании обеих методик, т.е. уменьшения содержания ДНК в результате обработки ДНКазой и последующее подкисление, и затем удаление ДНК на ДЭАЭ-колонке.

Хотя для специалиста очевидно, что после удаления ДНК для дополнительной очистки может быть использован любой метод, например, катионо- или анионообменная хроматография, тем не менее рекомендуется сильная катионообменная хроматография, такая как хроматография на колонках с функциональными группами сульфокислоты. В особенно рекомендуемом воплощении изобретения применяемая для дальнейшей очистки катионообменная колонка заполнена сополимером N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола с функциональными группами сульфокислоты следующего строения: -CONH-C(CH₃)₂-CH₂-SO₃H.

Одним из примеров такой колонки является SP-Трисакрил 1S.

Высокочистые концентрированные частицы антигена перед дополнительным концентрированием, предпочтительно ультрафильтрованием, могут быть также обработаны формальдегидом с целью дезактивации каких-либо присутствующих живых организмов и вирусов. Полученные дополнительно концентрированные частицы затем очищают хроматографией, предпочтительно гель-фильтрующей хроматографией. Рекомендуемая колонка для гель-фильтрации заполнена аллилдекстраном, ковалентно сшитым N,N'-метиленбисакриламидом.

Как показано в примере 10, применение стадий, альтернативных рекомендуемым, создает много проблем. Так, например, при использовании для разделения вместо ультрафильтрования центрифугирования основные клеточные примеси, такие как клеточные мембраны и липидные комплексы, не удаляются, что приводит к снижению общего выхода и уменьшению чистоты частиц HBsAg. Кроме того, центрифугирование дорого и длительно. Применение системы стерилизация с мембраной в 0,22 мк приводит к другим трудностям, описанным в примерах.

Аналогично при использовании для концентрирования ПЭГ вместо ультрафильтрования, как найдено, достигают только 75%-ного выделения частиц HBsAg. Кроме того, чистота уменьшается, и процесс требует больших затрат времени.

Соответственно, хотя альтернативные методы типа описанных в примере 10 и методы, известные специалистам, и могут быть использованы, тем не менее в примере 5 обсуждаются рекомендуемые для каждого этапа стадии. Кроме того, как указано выше, особенно рекомендуемое воплощение изобретения детализировано в примере II.

Могут быть использованы любые клетки млекопитающего, способные экспрессировать к ДНК, кодирующую поверхностный антиген гепатита В. Рекомендуются клетки яичника китайского хомячка (CHO), особенно клетки CHO-HX200.

Поверхностный антиген гепатита В получают культивированием клеток млекопитающего, например, клеток CHO-HS200. Условия культивирования специалистам известны. Культивирование может быть проведено в бутылях с перемешиваемым при их вращении содержимым или в ферменторах с использованием микроносителей.

Осуществлением способа выделяют очищенные частицы поверхностного антигена гепатита В. Как показано выше, так