Лейстродуксин, способ получения лейстродуксина штамм streptomyces platensis - продуцент лейстродуксина, фармацевтическая композиция, обладающая кроветворной и противогрибковой активностью, лечебно-профилактическое средство

Лейстродуксин, способ получения лейстродуксина штамм streptomyces platensis - продуцент лейстродуксина, фармацевтическая композиция, обладающая кроветворной и противогрибковой активностью, лечебно-профилактическое средство

Реферат

 

Использование: для лечения и профилактики нежелательных реакций, возникающих в результате химиотерапии или радиотерапии рака, инфекций, рака, церебральных нарушений и грибковых инфекций. Сущность изобретения: предложены новые соединения, названные "лейстродуксинами", имеющие соответствующую структурную формулу. Лейстродуксины и их соли могут быть получены ферментацией с применением микроорганизмов рода Streptomyces, в особенности штамма Streptomyces platensis FEPM BP-3288. 5 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретением дается ряд новых соединений, названных нами "Лейстродуксином А", "Лейстродуксином B" и "Лейстродуксином C". Перечисленные соединения отвечают нижеприведенной формуле (I). Изобретением также даются способы получения этих соединений ферментацией с применением микроорганизма рода Streptomyces, в особенности штамма вида Stretomyces platensis, также являющегося новым и также составляющим часть изобретения. Соединения изобретения обладают различными лечебными свойствами, в результате чего изобретением, кроме того, даются композиции и способы лечения или профилактики с применением этих соединений.

Лейстродуксины изобретения являются новыми соединениями, стимулирующими продуцирование гемопоэтических факторов, таких как фактор стимуляции колонии гранулоцитов (далее сокращение ФСКГ), фактор стимуляции колонки гранулоцитов макрофагов (далее сокращено ФСКГМ); соединения также стимулируют продуцирование фактора роста нервной ткани (далее сокращено ФРН); кроме того, соединения проявляют противогрибковую активность, например, по отношению к Tricophytom mentegrophtes.

Цитокины различного типа обладают гемопоэтической активностью, например, в виде факторов стимуляции колоний (далее сокращено ФСК), а некоторые виды гликопротеинов (под общим названием "интерлейкинов") в настоящее время получены методами генной инженерии. Эти вещества использовались клинически различным образом для уменьшения нежелательного побочного действия, часто сопровождающего химиотерапию и лучевую терапию рака, и для блокирования инфекций. Эффективность таких веществ недавно стала очевидна (Br. J. Cancer 59, 2 5, 1989).

Найдено, что введение этих факторов человеку различными путями приводит к явным фармакологическим эффектам, что означает возможное применение их в медицине. Однако полагают, что указанные факторы по-существу продуцируются in vivo некоторыми видами клеток (например, лимфоцитами, монофитами, фибробастами, васкулярными эндотелиальными клетками и стромальными клетками) при участии сложной регулирующей системы и что эти факторы играют гомеостатическую роль в продуцировании кровяных клеток различного типа. Соответственно, при введении этих факторов без учета хрупкого равновесия такого регулирующего механизма могут наблюдаться некоторые побочные эффекты, вызванные нарушением равновесия в регулирующем механизме, примеры подобных побочных эффектов включают воспаление в месте инъекции, боли в костях, жар и озноб.

С другой стороны, вместо введения самих гемопоэтических факторов может оказаться возможным введение определенных веществ, для которых известна способность стимуляции продуцирования гемопоэтических факторов в организме. К примеру, известно, что интерлейкин 1 (далее сокращено ИЛ-1) и фактор некроза опухоли (далее ФНО) способны индуцировать продуцирование ФСК и т.д. клетками различного вида. Однако указанные факторы не всегда способны действовать в качестве специфических индукторов гемопоэтических факторов, поскольку обладают и различными другими проявлениями биологической активности.

Кроме того, известно, что низкомолекулярные иммуноактиваторы различного типа, такие как липополисахариды (далее сокращено ЛПС) и мурамилдипептиды (далее сокращено МДР) способны продуцировать ФСК различного типа путем активации моноцитов и макрофагов. Однако известно, что при этом одновременно возникают и другие физиологические эффекты, вызванные активацией макрофагов, например продуцирование монокинов, таких как ИЛ-1 и ФНО, что может привести к различным побочным эффектам, таким как появление жара (Nippon Acta Radiologica 48, (4), 514, 1988).

Известно, что эфиры форбола и ионофоры кальция синергически индуцируют продуцирование ФСК /Kohama и др. Experimental Hematology 16, 603 608 (1988)/, однако также известно, что они не только стимулируют продуцирование гемопоэтических факторов, но кроме того, стимулируют продуцирование и секрецию полного набора секретируемых белков, включая гормоны, такие как инсулин (Y. Nishizuka, Science 225, 1365, 1984).

Хотя точный механизм до сих пор не известен, тем не менее полагают, что в образовании кровяных клеток хрелые кровяные клетки различного типа могут быть образованы из обычных клеток предшественников, называемых гемопоэтическими стволовыми клетками, при воздействии разнообразных гемопоэтических факторов и путем межклеточного взаимодействия. Установлено, что место, в котором у нормального взрослого человека образуются кровяные клетки, ограничено только внутренностью костного мозга и что клетки, называемые стромальными клетками, существующие в костном мозге, играют важную роль в образовании кровяных клеток (Dexler и др. J Cell. Physiol, 91, 335, 1977) и что стромальные клетки в костном мозге продуцируют разнообразные гемопоэтические факторы (Harigaya и др. Proc. Natl. Acad. Sci. США. 82, 3477, 1985; Kohama и др. Experimental Hematology 16, 603 608, 1988).

Таким образом, если будет найдено вещество, стимулирующее продуцирование гемопоэтических факторов стромальными клетками, то такое вещество может сыграть не только очень важную роль в выявлении действия гемапоэтического механизма в физиологическом состоянии и патологии гематологических заболеваний, но сможет найти и значительно клиническое применение.

В Европейской патентной публикации N 329361 раскрыты определенные производные 2 пиранона, напоминающие соединения настоящего изобретения за исключением характера группы "R", определяемой ниже. Для соединений-прототипов указано также только то, что они являются сельскохозяйственными биоцидами, но в опубликованной ссылке не показано, что соединения обладают ценной и неожиданной лечебной и профилактической активностью соединений настоящего изобретения. Хотя соединения-прототипы, как и соединения настоящего изобретения, микроорганизмы вида Streptomyces platensis, штамм, описанный в прототипе, как полагают, явно отличен от описываемого здесь штамма.

Очень похожие соединения и микроорганизмы, для которых раскрыта та же область применения, приведены в заявке на патент Японии Kokai Hei 2-186, но они явно отличны от соединений и микроорганизмов, описываемых здесь.

В Journal of Antibiotics, т. XLII, N9, с. 1331 описано новое противоопухолевое соединение, названное авторами "Фосфолином", продуцируемое микроорганизмом рода Streptomyces, который затем был впервые выделен. Однако четко указано, что микроорганизм принадлежит к Streptomyces hydroscopicus, т.е. отличен от применяемого в изобретении Streptomyces platensis. Более того, хотя фосфолин прототипа, как и соединения настоящего изобретения, имеет как аминогруппу, так и группу фосфорной кислоты, тем не менее фосфолин имеет другую молекулярную формулу, т.е. отличен от соединений изобретения.

Цель изобретения заключается в создании ряда новых производных фосфорной кислоты, обладающих разнообразными проявлениями фармакологической активности.

В частности, полагают, что соединения изобретения характеризуются следующими проявлениями активности: соединения снижают неблагоприятные реакции, возникающие при химиотерапии или радиотерапии рака, соединения активируют макрофаги, в результате чего обладают противоопухолевым действием, соединения защищают от инфекций, соединения улучшают функционирование мозга и, кроме того, соединения являются противогрибковыми средствами.

Изобретением даются соединения формулы (I) в которой R представляет 5-метилгексаноилоксигруппу, 6-метилоктаноилоксигруппу или 7-метилоктаноилоксигруппу и их соли. Эти соединения названы нами соответственно "Лейстродуксином A", "Лейстродуксином B" и "Лейстродуксином C".

Изобретением также дается способ получения лейстродуксинов, заключающийся в культивировании продуцирующего лейстродуксин микроорганизма рода Streptomyces и выделении из культуры по меньшей мере одного из лейстродуксинов.

Изобретением, кроме того, дается фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере один из лейстродуксинов или его соль в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Изобретением также дается способ лечения или профилактики нежелательных реакций, возникающих при химиотерапии или радиотерапии рака, инфекций, рака, церебральных нарушений и грибковых инфекций, заключающийся во введении эффективного количества по меньшей мере одного лейстродуксина или его соли млекопитающему, которым может быть и человек, страдающему или склонному к указанным реакциям, инфекциям, раку или нарушениям.

Три лейстродуксина настоящего изобретения отвечают следующим формулам: Из вышеприведенных формул видно, что лейстродуксины изобретения обладают рядом асимметричных атомов углерода и несколькими двойными связями. В силу этого соединения могут образовывать различные оптические и геометрические изомеры. Хотя все они здесь представлены единственной молекулярной формулой, тем не менее настоящее изобретение включает индивидуальные, выделенные изомеры и смеси, включая их рацематы. При использовании методов стереоспецифического синтеза или при использовании в качестве исходных продуктов оптически активных соединений могут быть получены непосредственно индивидуальные изомеры, а с другой стороны, при получении смеси изомеров индивидуальные изомеры могут быть получены обычными методами разделения.

Лейстродуксины изобретения могут быть получены культивированием продуцирующего лейстродуксин микроорганизма рода Streptomyces с последующим выделением из культурной среды одного или нескольких лейстродуксинов.

В частности, мы особенно рекомендуем применять в качестве микроорганизма впервые выделенный штамм рода Streptomyces, принадлежащий, как нами установлено, к виду Streptomyces platensis, которому нами присвоено обозначение SANK 60191 (FERM BP-3288).

Микроорганизм депонирован на условиях Будапештского соглашения в Исследовательском Институте Ферментации, Агентство промышленных наук и технологий 20.02.91 под регистрационным N FERM BP-3288.

Подробности микробиологических свойств Streptomyces Platensis SANK 60191 (FERM BP-3288) приводятся ниже.

1. Морфологические характеристики.

Streptomyces platensis SANK 60191 культивируют 14 дн при 28^oC на каждой из сред агара, определяемых ISP (Международный проект по Streptomyces). Исследования под микроскопом после 14 дн культивирования показали, что субстратный мицелий хорошо удлинен и разветвлен и окрашен в желтовато-серый и или бледно-желтовато-оранжевый цвет. Однако ни фрагментации, ни зигзагообразного удлинения наблюдаемого в случае Нокардиоформ актиномицетов в данном случае на обнаруживается. Разветвления аэрального мицелия простоты. Споровые цепи свободно-спиральны по форме, и цепь образуют 10 50 или более спор. Исследования с помощью сканирующего микроскопа показали гладкое строение поверхности спор. Споры яицеобразны и овальны, размером 0,5 0,6 х 0,6 1,3 мкм. Закруглений воздушного мицелия, склероций, фрагментации гифов и специфичных органов, таких как спорангий, не удалось обнаружить.

2. Свойства культурных сред различного типа В таблице приведены свойства микроорганизма после культивирования в течение 14 дн при 28^oC в культурных средах различного типа. Цвета указаны в виде номера образца, приведенного в Руководстве к цветовым стандартам издания Nippon Shikisai Kenkyusho. Данный штамм увлажняется и его цвет изменяется в черный с течением времени.

В таблице использованы следующие аббревиатуры: P рост ВМ воздушный мицелий, О обратимость, РП растворимый пигмент, ОС особые свойства.

3. Физиологические свойства Физиологические свойства штамма SANK 60191, наблюдаемые в период с 2-го по 21-й день после начала культивации при 28^oC, приведены ниже.

Гидролиз крахмала Положительно Ожижение желатина Отрицательно Восстановление нитратов Отрицательно Коагуляция молока Отрицательно Пептонизация молока Отрицательно Образование меланоидного пигмента (Среда 1) Отрицательно (Среда 2) Отрицательно (Среда 3) Отрицательно Разложение субстрата Казеин Отрицательно Тирозин Положительно Ксантин Положительно Температурный интервал для роста (среда 4) 9-35^oC Оптимальная температура для роста (среда 4) 20-26^oC Телерантность к хлориду натрия 10% Среда 1 бульон на триптоне-дрожжевом экстракте (ISP 1).

Среда 2 агар на пептоне-дрожжевом экстракте с железом (ISP 6).

Среда 3 тирозиновый агар (ISP 7).

Среда 4 агар на дрожжевом экстракте-солодовом экстракте (ISP 2).

Штамм SANK 60191, кроме того, культивировался при 28^oC на агаре Придхэма-Готтлиба (ISP 9) в качестве культурной среды. Характер усвоения источников углерода в течение 14 дн после культивирования приведен ниже.

D Глюкоза D Фруктоза + L Арабиноза L Рамноза - D Ксилоза Сахароза + Инозит + Раффиноза + D Маннит + Контроль - где + усвоение положительное; усвоение отрицательное.

4. Клеточные компоненты Стенки клеток штамма SANK 60191 анализируют по методу B. Becke и др. (Applied Microbiology, 12, 421-423, 1984).

Поскольку обнаружена LL диаминопимелиновая кислота, подтверждена тем самым принадлежность стенок клеток к типу 1. Кроме того, по методике M.P. Lechevalier (Journai of laboratory ano Cli- nical Medicine, 71, 934 1968) осуществлен анализ полного набора сахарных компонентов клеток штамма SANK 60191.

Никаких характерных особенностей не наблюдается.

На основании приведенных микробиологических свойств подтверждена принадлежность штамма роду Streptomyces из Актиномицетов. При сравнении со штаммами, описанными в ISP E.B Shirling и D.Gottlieb (Internеtional Journal of Systematic Bacteriology, 18, 68-189 (1968); 18, 279-392 (1968); 19, 391-512 (1969), 22, 265-394 (1972)), и со штаммами, описанными в других литературных источниках, таких как Актиномицеты, т. 2, S.A. Waksman, Руководство Бергея по определенной бактериологии, 8-е издание (1974). /Под ред. R.E.Buchanan и N.E.Gibbons, Руководство Бергея по определенной бактериологии, т. 4, 1989, и других недавних литературных источниках, относящихся к Антиномицетам, был сделан вывод о большой схожести этого штамма с Streptomyces plantensis.

Кроме того, после жидкой культуры с использованием декстрозо-дрожжевой среды штамм SANK 60191 образует растворимый пигмент, имеющий свежую красновато-коричневую окраску. При добавлении 0,05 г водной соляной кислоты окраска пигмента превращается в желтую, а при добавлении 0,05 н. водной гидроокиси натрия никаких изменений не наблюдается.

Streptomyces platensis образует красноватый или желтоватый пигмент после культивирования на агаре на основе дрожжевого экстракта солодового экстракта, агара на овсяной муке, агара на неорганических солях-крахмале и глицерин-аспарагиновом агаре. С другой стороны, штамм SANK 60191 вряд ли образует какой-либо из этих пигментов, что указывает на отличие этого штамма от других известных штаммов Streptomyces platensis. Однако поскольку новый штамм и известные штаммы могут быть отличены только по образованию растворимых пигментов, штамм SANK 60191 идентифицирован как новый штамм Streptomyces platensis.

Установлено, что штамм SANK 60191 продуцирует лейстродуксины. Однако хорошо известно, что свойства грибков, в целом, и активномицетовых микроорганизмов, в частности, могут значительно отличаться и эти грибки легко претерпевают мутацию как в результате естественных причин, так и в результате воздействия искусственных средств (например, ультрафиолетовое облучение, химическое воздействие и т.д.). Соответственно, изобретение охватывает применение любого микроорганизма, который можно классифицировать в пределах рода Streptomyces и который разделяет со штаммом SANK 60191 характерную особенность образовывать лейкодукстрины. Не ожидается, что новый микроорганизм (штамм SANK 60191) будет чем-то исключительным, и термин "SANK 60191", таким образом, применяют с включением всех мутантов этого штамма, разделяющих со штаммом SANK 60191 характерную особенность в продуцировании лейкодуксинов. Кроме того, такие мутанты включают и мутанты, полученные биотехнологией, например рекомбинацией, трансдукцией, трансформацией и т.п. Можно простым экспериментированием определить на основе информации, приведенной здесь относительно свойств лейстродуксинов, будет ли данный штамм продуцировать эти соединения и будет ли их продуцировать в количествах, достаточных для того, чтобы сделать этот штамм представляющим интерес с промышленной точки зрения.

Нами также обнаружено, что помимо вышеохарактеризованного нового штамма Streptomyces platensis известный штамм, а именно Streptomyces platensis SAM-0654 (депонирован в Исследовательском институте ферментации, Япония, под регистрационным номером FERM BP-1668 22.01.88), также продуцирует лейстродуксины изобретения. Этот известный штамм в полной мере охарактеризован в Европейском патенте N 329361, описание которого приводится здесь в качестве ссылки.

Лейстродуксины изобретения могут быть получены культивированием указанных штаммов грибков в культурной среде, обычно применяемой для продуцирования других продуктов ферментации из аналогичных микроорганизмов. Такие среды обязательно содержат микробиологически усвояемые источники углерода и азота, а также неорганические соли, что хорошо известно специалистам в данной области.

Рекомендуемые примеры источников углерода включают глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, маннит, глицерин, декстрин, овсы, рожь, зерновой крахмал, картофельный крахмал, зерновую муку, соевую муку, жмых хлопковых семян, хлопковое масло, мелассу, лимонную кислоту, винную кислоту и т.п. Указанные соединения могут быть использованы по отдельности или в приемлемом сочетании. Как правило, их количество может меняться в интервале 1-10 мас. на культурную среду.

К рекомендуемым источникам азота относятся обычные белковые продукты, обычно применяемые в процессах ферментации. Примеры подобных источников азота включают соевую муку; пшеничные отруби, арахисовый шрот, жмых хлопковых семян, хлопковое масло, муку из жмыха семян хлопчатника, гидролизаты казеина, фермамин, рыбную муку, жидкость от замачивания зерна, пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и т.п. Перечисленные источники азота могут быть использованы по отдельности или в любом приемлемом сочетании. Как правило, мы предпочитаем их использовать в концентрации 0,2-6 мас. на культурную среду.

Питательные неорганические соли, которые могут быть введены в культурную среду, включают обычные соли, способные давать различные ионы, необходимые для роста микроорганизмов, такие как ионы натрия, аммония, кальция, фосфат-, сульфат-, хлорид- и карбонат-ион. Кроме того, среда должна содержать небольшие количества необходимых микроэлементов, таких как натрий, кальций, кобальт, марганец, железо и магний.

При осуществлении способа изобретения методом культивирования в жидкой среде рекомендуется использовать в культурной среде противопенное средство, такое как силиконовое масло, растительное масло или поверхностно-активное вещество.

Значение pH культурной среды для продуцирования лейстродуксинов культивированием микроорганизмов рода Streptomyces, в особенности штамма SANK 60191, предпочтительно меняется в интервале 5-8, более предпочтительно 5-7.

Культивирование может быть осуществлено при любой температуре в интервале 9-27^oC. Однако рост протекает хорошо в интервале 20-35^oC и именно эта температура рекомендуется. Для оптимизации продуцирования лейстродуксинов рекомендуется температура 22-30^oC.

Указанные соединения получают в условиях аэробного культивирования с возможным применением обычных способов аэробного культивирования, таких как культивирование в твердой среде, культивирование со встряхиванием и культивирование с аэрацией-перемешиванием (культивирование во взвешенном состоянии). В случае маломасштабного культивирования обычно применяют встряхивание культуры несколько дней при 28^oC. В таком маломасштабном способе культивирования культура может быть инициирована проведением 1 или 2 стадий пролифарации с получением затравочных культур, например, в колбах Эрленмейера, снабженных дефлекторами для регулирования потока жидкости. Рекомендуется, чтобы среда для получения затравочных культур содержала источники как углерода, так и азота. В рекомендуемой последовательности операций такого маломасштабного культивирования колбы для затравочных культур встряхивают в инкубаторе с постоянной температурой 28^oC в течение 3 дн или до момента достижения достаточного роста. Выращенную затравочную культуру затем переносят во вторую затравочную среду или в продуцирующую среду. При использовании промежуточной ростовой фазы для ее выращивания применяют по-существу тот же способ и аликвотой полученного промежуточного продукта инокулируют продуцирующую среду. Инокулированная колба может быть инкубирована несколько дней со встряхиванием и по окончании инкубирования содержимое колбы может быть центрифугировано или отфильтровано.

В случае широкомасштабного продуцирования рекомендуется применение соответствующего ферментатора с мешалкой и устройством для аэрации. В этом случае питательная среда может быть приготовлена внутри ферментатора. Среду рекомендуется стерилизовать повышением температуры до приемлемого уровня, например до 120-125^oC, и после охлаждения стерилизованная среда может быть инокулирована предварительно приготовленной затравочной культурой. После этого культуру выдерживают при перемешивании и аэрации и приемлемой температуре, например при 28^oC. Такой способ пригоден для получения в больших количествах соединений изобретения.

Изменения в количестве образованных лейстродуксинов с течением времени культивирования может контролироваться с помощью соответственных средств, широко применяемых в области ферментации, например с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В большинстве случаев количество образующихся лейстродуксинов достигает максимума после культивирования в течение 48-96 ч.

По окончании культивирования лейстродуксины, остающиеся в жидкой части среды и в бактериальных клетках, могут быть извлечены использованием физико-химических свойств лейстродуксинов. К примеру, лейстродуксины, присутствующие в фильтрате или надосадочной жидкости, могут быть экстрагированы несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, хлороформ, хлористый этилен, хлористый метилен или бутанол (или смесью любых двух или более из указанных растворителей), после чего они могут быть очищены обычными способами. Можно также удалять возможные примеси экстрагированием одним или несколькими из указанных растворителей в щелочных условиях с последующей очисткой обычными средствами. Или же примеси могут быть удалены адсорбцией при пропускании содержащей лейстродуксины жидкости через слой соответствующего адсорбента, или лейстродуксины могут быть адсорбированы на соответствующем адсорбенте и затем элюированы с помощью приемлемого элюента, такого как водный метанол, водный ацетон или водный бутанол. Примеры приемлемых адсорбентов, которые могут быть использованы в таких методиках, включают активированный уголь и адсорбирующие смолы, такие как Амберлит XAD-4 (фирменное название продукта фирмы Роом энд Хаас) или Диаион HP-10, HP-20 CHP-20 HР-50 (фирменные названия продуктов фирмы Митсубиси Кемикал Индастриз Ко). Присутствующие в клетках лейстродуксины могут быть получены экстрагированием приемлемым растворителем, таким как: 50-90%-ный по объему водный ацетон или водный метанол с последующим удалением органического растворителя, после чего полученный продукт может быть подвергнут экстрагированию и очистке по методикам, аналогичным приведенным выше для фильтрата.

Полученные в результате лейстродуксины могут быть подвергнуты дальнейшей очистке по хорошо известным методикам, например адсорбционной колоночной хроматографией с применением такого носителя, как силикагель или магний-силикагель, продаваемый, например, под фирменным названием "Флорисил" распределительной колоночной хроматографией с применением такого адсорбента, как Сефадекс IH-20 (фирменное название продукта фирмы Фармации) или высокоэффективной жидкостной хроматографией с применением колонки с обычной фазой или обращенной фазой. Как хорошо известно специалистам, методики выделения и очистки могут быть осуществлены по отдельности или в любом приемлемом сочетании, при желании неоднократно с выделением и очисткой целевых лейстродуксинов.

Лейстродуксины изобретения являются новыми соединениями, ранее неописанными в литературе. Соединения стимулируют продуцирование гемопоэтических факторов, таких как ФСКГ и ФСКГМ у животных (например, человека, собак, кошек и кроликов), вследствие чего применимы в качестве лечебных средств для снижения побочных эффектов, вызванных химиотерапией или радиотерапией рака, соединения также предотвращают инфекции и проявляют противораковое действие путем активации макрофагов. Кроме того, ожидается, что лейстродуксины найдут применение для улучшения церебрального метаболизма путем стимулирования ФНО. Кроме того, эти соединения применимы в качестве противогрибковых средств, что показано их противогрибковым действием по отношению к Tricophyton metagrophytes.

Способность лейстродуксинов в соответствии с настоящим изобретением стимулировать предуцирование гемопоэтических факторов может быть выявлено по методике Kohama и др. (Experimental Hematology 16, 603-608, 1988).

В этой методике сочетают систему продуцирования для различных гемопоэтических факторов с системой анализа различных гемопоэтических факторов. К примеру, клетки КМ-102, происходящие из стромальных клеток костного мозга человека, могут быть использованы для продуцирования различных гемопоэтических факторов. Однако вместо этих клеток могут быть использованы любые клетки, способные продуцировать различные гемопоэтические факторы, например первичные культивируемые стромальные клетки костного мозга, васкулярные эндотелиальные клетки, лимфоциты или макрофаги, существующие в костном мозге. Испытуемый образец соединения, чью активность желают испытать, разбавляют до необходимой концентрации и добавляют к культурной системе, содержащей клетки, продуцирующие различные гемопоэтические факторы ("ГФ продуцирующие клетки"). После должного периода (обычно 24 ч) часть надосадочной жидкости отбирают из культурной среды и добавляют к системе культивируемых клеток, зависимых от различных гемопоэтических факторов, например TF-1 клеток и NES-60 клеток ("ГФ-зависимые клетки") в необходимой концентрации.

После определенного периода количество гемопоэтических факторов может быть определено путем определения роста ГФ-зависимых клеток, в результате чего может быть выявлена способность соединения стимулировать продуцирование различных гемопоэтических факторов. Рост ГФ-зависимых клеток может быть определен любым удобным способом, например введением в клетки тритий-тимидина или использованием МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид) в качестве аналитического метода (Хемикон Интернэшнл Инк, США). Анализ различных гемопоэтических факторов может быть осуществлен любым удобным способом, таким как метод образования колоний или ELISA-метод.

Лейстродуксины изобретения имеют как кислотную группу (группа фосфорной кислоты), так и основную группу (аминогруппа), в силу чего могут образовывать соли. Нет каких-либо особых ограничений относительно природы таких солей при условии, что, если они предназначены для лечебных целей, эти соли должны быть фармацевтически приемлемыми.

В тех случаях, когда соли предназначены для нелечебных целей, например при их использовании в качестве промежуточных соединений для приготовления других, возможно более активных соединений, даже это ограничение роли не играет. Соединения изобретения могут образовывать соли с основаниями, которые включают соли с щелочным металлом, таким как натрий, калий или литий, соли с щелочно-земельным металлом, таким как барий или кальций, соли с иным металлом, таким как магний или алюминий, соли с органическим основанием, такие как соль с дициклогексиламином, и соли с аминокислотами основного характера, такими как лизин или аргинин. Соединения изобретения могут, кроме того, образовывать соли с добавлением кислот, которые включают соли с минеральными кислотами, особенно с гидрогалоидными кислотами (такими как фтористоводородная кислота, бромистоводородная кислота или хлористоводородная кислота), азотной кислотой, перхлористой кислотой, угольной кислотой, серной кислотой или фосфорной кислотой, соли с низшими алкилсульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, трифторметансульфоновая кислота или этансульфоновая кислота, соли с арилсульфоновыми кислотами, такими как бензолсульфокислота или n-толуолсульфокислота, соли с органическими карбоновыми кислотами, такими как уксусная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота или лимонная кислота, и соли с аминокислотами, такими как глутаминовая кислота или аспаратиновая кислота.

Если эти соединения предназначены для лечебных целей, тогда они могут быть введены в чистом виде или в виде приемлемого фармацевтического состава, содержащего помимо активного соединения один или несколько обычных разбавителей, носителей, наполнителей или адъювантов. Природа состава, разумеется, будет зависеть от намечаемого пути введения. Однако предназначенные для перрорального введения составы рекомендуют приготовлять в виде порошков, гранул, таблеток, капсул или сиропов. Для парентерального введения составы рекомендуют приготовлять в виде инъекций (которые могут быть внутривенными, внутримышечными или подкожными) или в виде капель или свеч. Такие препараты могут быть приготовлены известными способами добавлением таких добавок, как носители, связующие вещества, размельчители, смазки, стабилизаторы, корригенты, солюбилизирующие средства, суспендирующие средства или кроющие средства. Хотя дозировка может меняться в зависимости от симптомов и возраста пациента, природы и тяжести заболевания или нарушения, а также пути и характера введения, в случае перорального введения взрослому больному человеку соединения изобретения обычно могут составлять в ежедневной дозировке 1-1000 мг. Соединения могут быть введены разовой дозой или раздельными дозами, например два или три раза в день.

Пример 1. Культивирование и выделение лейстродуксинов.

1 (А) Культивирование Одной платиновой петелькой спор Streptomyces platensis SANK 60191 инокулируют 100 мл предварительно стерилизованной культурой среды (нижеприведенного состава) в колбе Эрленмейера на 500 мл, снабженной дефлекторами, и микроорганизм культивируют 3 дн при 28^oC и 200 об/мин (радиус вращения 7 см) с применением роторной качалки.

Культурная среда, г: Растворимый крахмал 30 Сырые дрожжи 10 Соевый порошок 7 Рыбная мука 5 Жидкость от вымачивания зерен 2 Мясной экстракт 1 Карбонат кальция 1 Вода до 1000 мл pH 7 (до стерилизации) В каждый из четырех ферментаторов из нержавеющей стали на 30 л загружают 15 л той же культурной среды, что была использована для затравочной культуры, и стерилизуют нагреванием 30 мин при 120^oC. Затем добавляют 150 мл жидкой затравочной культуры, приготовленной вышеприведенным способом. Смесь культивируют 3 дн при 28^oC с аэрацией при скорости потока воздуха 15 л/мин и с перемешиванием. С целью установления концентрации кислорода в жидкости в 5 ч/млн скорость перемешивания автоматически регулируют в интервале 100-300 об/мин.

1(B) Выделение К 60 л жидкой культуры, полученной на стадии 1(А), добавляют 2,4 кг Целита 545 (фирменное наименование продукта фирмы Джонс энд Манвилл Прожект Корпорейшн) и полученную смесь фильтруют. После фильтрования жидкой культуры получено 7,2 кг бактериальных клеток. Клетки экстрагируют один раз 30 л водного ацетона (50% об/об) и дважды каждый раз по 20 л водным ацетоном (80% об/об). Полученные экстракты объединяют и органический растворитель отгоняют в роторном испарителе. К остатку добавляют водную соляную кислоту в количестве, достаточном для установления значения pH 2, после чего смесь дважды экстрагируют этилацетатом каждый раз по 10 л. Экстракты объединяют и к ним добавляют 10 л водного раствора гидрокарбоната натрия (1% мас./об). Активные фракции переносятся в водный слой, а слой этилацетата удаляют. Этот слой этилацетата вновь экстрагируют 5 л водного раствора гидрокарбоната натрия (1% мас./об). Растворы гидрокарбоната натрия объединяют и добавлением водной соляной кислоты устанавливают значение pH 2. Раствор дважды экстрагирую этилацетатом каждый раз по 10 л. Органические экстракты объединяют, промывают водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. При непрерывном добавлении метанола раствор затем конденсируют испарением при пониженном давлении в роторном испарителе с получением 10 мл маслянистого вещества. Полученное вещество растворяют в 100 мл водного метанола (60% об/об) и полученный раствор адсорбируют на C₁₈ патронах в 20 см³ Сеп-Пак Вак (фирменное название продукта фирмы Уотерс Ко. США). Примеси элюируют водным метанолом (30 мл, 60% об/об). Лейстродуксины затем элюируют 100%-ным метанолом и концентрированием элюата получают 800 мг маслянистого вещества, которое растворяют в 10 мл метанола и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии. Фракции с пиками примерно 13 мин и 24 мин отбирают и обозначают как "Сырая фракция А" и "Сырая фракция B" соответственно. Условия хроматографии приведены ниже.

Препаративная жидкостная хроматография Колонка Радикал-Пак 25х10 (Уотерс, США) Элюирующий растворитель 50-ный (об) водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатного буфера, pH 3 Скорость потока 9 мл/мин Длина волны 230 нм После концентрирования всех указанных пиков полученные фракции подвергают препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сырую фракцию А подвергают препаративной хроматографии с отбором пика около 56 мин в следующих условиях; затем их обессоливают и конденсируют с применением Сеп-Пак и получением 11,66 мг дейстродуксина А.

Условия препаративной хроматографии для сырой фракции А Колонка Космосил 5С 18-AR 20 x 250 мм (Накараитеск Инк.) (Элюирующий растворитель 42%-ный (об/об) водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатного буфера, pH 3 Скорость потока 9 мл/мин Длина волны 230 нм Сырую фракцию B подвергают препаративной хроматографии с отбором пиков около 47 и 51 мин в нижеприведенных условиях, затем обессоливают и конденсируют с применением Сеп-Пак и получением 9,83 мг лейстродуксина B и 5,22 мг лейстродуксина C. Условия препаративной хроматографии для сырой фракции B.

Колонка Космосил 5C 18-AR 20 x 250 мм (Накараитеск Инк.) Элюирующий растворитель 47%-ный водный ацетонитрил, содержащий 0,5% триэтиламин-фосфатного буфера, pH 3.

Скорость потока 9 мл/мин Длина волны 230 нм Полученные в результате лейстродуксины обладают следующими свойствами: Лейстродуксин А 1) Химическое строение: формула (1а), приведенная выше.

2) Характер: кислотный и жирорастворимый.

3) Цвет: бледно-желтое масло.

4) Молекулярная формула: C₃₂H₅₂O₁₀NP 5) Молекулярная масса: 641, определена методом ББА-МС ("ББА-МС" - Бомбардировка Быстрыми Атомами Масс-Спектрометрия) 6) Ультрафиолетовый спектр поглощения: 234 нм (максимальное поглощение в метаноле) 7) Инфракрасный спектр поглощения: инфракрасный спектр показал следующие максимумы поглощения (пленка жидкости _max см^-1): 2933, 2867, 1728, 1464, 1383, 1248, 1176, 1056, 969.

8) Спектр ¹H-ядерного магнитного резонанса: спектр ядерного магнитного резонанса (270 МГц) в тяжелом метаноле с применением в качестве внутреннего стандарта триметилсилана приведен ниже: 7,08 (1H, дублет дублетом, J 9,8 и 4,9 Гц); 6,21-6,35 (2H, мультиплет); 6,06 (1H, дублет дублетов, J 15,6 и 6,1 Гц); 6,02 (1H, дублет дублетов, J 9,8 и 1,4 Гц); 5,94 (1H, дублет, J 15,6 Гц); 5,46 (1H, мультиплет); 5,31(1H, мультиплет); 5,1 (1H, дублет, дублетов, J 6,1 и 4,4 Гц); 4,94 (1H мультиплет); 4,7 (1H, мультиплет); 4,29(1H, триплет дублетов,