Полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, фрагмент днк н 1106, кодирующий полипептид 1106, рекомбинантная плазмидная днк рн 1106, кодирующая полипептид 1106, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида 1106

Реферат

 

Использование: биотехнология, генная инженерия и иммунология. Сущность изобретения: предлагается гибридный полипептид 1106, состоящий из полипептида, способного связывать антитела к продукту гена pol ВИЧ-1, и -галактозидазы E. coli. Гибридный полипептид синтезируется бактериальным штаммом Escherichia coli ВКПМ NB-5874. Штамм получен в результате трансформации плазмидной ДНК pH 1106, несущей фрагмент гена pol ВИЧ-1. 4 с. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и представляет собой гибридный полипептид, состоящий из полипептида, продукта фрагмента гена pol-вируса иммунодефицита человека I-го типа (ВИЧ-1) и -галактозидазы E. coli, синтезируемый бактериальным штаммом E. coli, несущим рекомбинантную плазмиду, имеющую в своем составе клонированный фрагмент гена pol ВИЧ-1, ответственный за синтез интегразы (intl) слитный с геном b-галактозидазы E. coli и связывающийся с антителами к продуктам этого гена, что позволяет проводит серодиагностику синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

СПИД возникает в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ при попадании в организм поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Заболевание характеризуется длительным (от 2 до 10 лет) бессимптомным периодом, в течение которого в крови инфицированного определяются только антитела к вирусным белкам, затем следует прогрессирующая деградация иммунной и центральной нервной системы, поэтому для проведения экстренных противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного начала лечения ВИЧ-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять инфицированных ВИЧ на ранних этапах инфекции.

Многочисленные исследования позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. В настоящее время известно два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), имеющих сходную организацию генома и различающихся по антигенной структуре вирусных белков.

ВИЧ имеет наиболее сложное из всех ретровирусов строение генома. Помимо генов gag, pol u env, направляющих синтез основных вирионных белков и общих для всех ретровирусов, геном ВИЧ-1 содержит еще шесть генов: vif, tat, rev (или art, или trs), 3'-nef, vpr u vpu. Геном ВИЧ-2 в отличие от ВИЧ-1, не содержит гена vpu, но содержит ген vpx (Science, 1986, 231, p. 1549; Cell, 198, 46, p. 807 817).

Интеграза фермент, необходимый для встраивания провирусной ДНК в геном зараженных клеток, кодируется С-концевым участком гена pol ВИЧ. Этот белок ВИЧ относительно инвариантен у различных вирусных изолятов и антитела на него обнаруживаются у значительного числа пациентов, зараженных ВИЧ.

Большинство методов диагностики ВИЧ-инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в сыворотках крови и других биологических жидкостях (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлюоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации.

Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных белков ВИЧ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВИЧ, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе.

При этом существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВИЧ, и в частности гена env (патент ЕПВ N 0265 785, кл. C 12 N 15/00, 1986; ЕПВ N 0 270 114, кл. C 12 N 15/00, 1986; ЕПВ N 0276 591, кл. C 12 N 15/00, 1986 и др.).

В настоящее время ведется поиск полипептидов наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики СПИД. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов (ЕВП N 0265 785, кл. C 12 N 15/00, 1986; РСТ N 89/03878, кл. C 12 N 15/00, 1989), так и в направлении выбора наиболее антигенноактивных детерминант (ЕВП, NN 0306219 и 0311228, кл. C 12 N 15/00, 1986 и 1987 соответственно) и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВИЧ (РСТ N 91/05864, кл. C 12 N 15/48, 1989; УВП N 0361749, кл. C 12 N 15/48, 1989).

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный полипептид I106, продукт фрагмента генома ВИЧ-1, связывающий антитела к интегразе, продукту гена pol ВИЧ-1; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид I106 и входящий в состав рекомбинантной плазмиды pHI106; штамм E. coli, ВКПМ N B-5874, содержащий рекомбинантную плазмиду pHI106 и экспрессирующий белок I106.

Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37oC колонии клеток гладкие, круглые, блестящие бледножелтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30 32oC колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага l проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при 30 32 oC. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39 42oC. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага l составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1108. кл/мл. Белок стабилен при 4oC в течение 3 4 мес.

Рекомбинантный полипептид I106, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, интроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена pol ВИЧ-1 в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов N 5874.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК HI106.

У ВИЧ-инфицированного человека отбирают из вены 10 мл гепаринизированной крови, к которой добавляют 30 мл лизирующего раствора (155 mM NH4Cl; 10 mM KHCO3; 0,1 mM EDTA). Смесь инкубируют 15 мин на льду. Центрифугируют при 2000 G 10 мин при 4oC. Белые клетки ресуспендируют в 10 мл SE (75 mM NaCl, 2 mM EDTA) добавляют протеиназу K до конечной концентрации 100 мкг/мл и 1 мл 20% SDS. Смесь инкубируют 4 ч при 37oC, добавляют 1/2 объема (5 мл) водонасыщенного фенола и такое же количество хлороформа с изоамиловым спиртом (24: 1). Полученную смесь встряхивают на качалке 15 мин и центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин. К отобранной водной фазе добавляют 1/30 объема NaOAc (pH 5,5) и равный объем изопропилового спирта. ДНК осаждают центрифугированием и промывают 70-ным раствором этилового спирта. Осадок ДНК растворяют в буфере TE (10 mM Трис-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

В эппендорфовскую пробирку на 0,5 мл вносят следующие компоненты: деионизированная вода 43,5 мкл; реакционный буфер 10 мкл 10 (конечная концентрация 25 mM Трис-HCl, pH 8,3 [при 25oC] 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM b-меркаптоэтанол, желатин 200 мкг/мл); смесь dNTP 16 мкл (конечная концентрация 200 мкМ); праймер Nl 5'-CGTCTTGGGCCTTGTCGGATCC-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ); праймер N2 5'-CTGCAGCTCATCCTGTCTACTT-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ); ДНК (матрица для амплификации) 10 мкл (конечная концентрация 1 нг); Taq-полимеразу 0,5 мкл (2,5 ед. на пробу).

Содержимое пробирки перемешивают на вортексе 3 4 с и осаждают на микроцентрифуге в течение 5 10 с.

В пробирку добавляют 50 мкл минерального масла и помещают в аппарат для амплификации ДНК N 801 0177 DNA Thermal Cycler Perkin-Elmer Corporation.

Реакционную смесь инкубируют при 94oC 7 мин, а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 2 мин при 37,198>C (гибридизация праймеров); 5 мин при 72oC (достройка праймеров); 2 мин при 94oC (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72oC 10 мин.

В пробирку вносят 50 мкл хлороформа, материал с хлороформом встряхивают 5 с на вортексе, а затем центрифугируют на микроцентрифуге 10 с. После этого отбирают водную (верхнюю) фазу (около 100 мкл), которая образуется в форме сферической капли, и переносят в чистую пробирку.

10 мкл водной фазы используют для анализа продуктов амплификации в 2-ном агарозном геле с бромистым этидием (виден фрагмент 860 п.н.).

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК HI106.

Пример 2. Получение плазмиды pHI106.

Синтезированный на ДНК-матрице фрагмент ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буфере для рестрикции (10 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl и 1 mM дитиотрейтол pH 7,5) в течение 14 ч при 37oC. Ферменты инактивируют нагреванием при 70oC 15 мин. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл H2O. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК помещают в эппендорфовскую пробирку, содержащую 3 мл лигазного буфера (50 mM Трис-HCl, 10 mM MgCl2, 20 mM дитиотрейтол, 1,0 mM АТФ, 50 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 2 мкл (0,2 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pEL5C, обработанной рестриктазами BamHI и PstI и 4 мкл H2O. К смеси добавляют 1 мкл (100 ед.) Т4 ДНК лигазы и инкубируют 3 ч при 16oC.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLN90 по обычной методике (Molecular cloning. New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB-агаром, содержащие 25 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазой BamHI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 1%-ном агарозе.

Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HI106 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 860 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК. При определении нуклеотидной последовательности плазмиды pHI106 установлено, что синтезированный нами фрагмент гена pol ВИЧ-1 через BamHI сайт присоединен к 3'-концу гена -галактозидазы E.coli.

Пример 3. Штамм E.coli HI106, содержащий плазмиду pHI106, выращивают в 100 мл среды LB при 30 oC до плотности 1 10 кл/мл. После этого температуру повышают до 37oC и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Natuer, 227, 680 685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLT90, содержащий векторную плазмиду pEL5C и не содержащий полученную нами плазмиду pHI106. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli HI106, содержащий плазмиду pHI106, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 145 155 кД. Этот полипептид назван I106. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность b-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента провирусной ДНК ВИЧ-2 представлена ниже: слитный с -галактозидазой E.coli.

Пример 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны BH85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24B, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3-ной TXY в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15M NaCl, 20 mM Трис-HCl, pH 7,4) с 0,5% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37oC обрабатывают сывороткой, содержащей антитела к вирусу ВИЧ-1, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37oC в течение 1 ч. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки, реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1M Трис-HCl, pH 8,0).

Анализ показывает, что полипептид I106 связывается с антителами к вирусу иммунодефицита человека первого типа.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет определять антитела к продуктам гена pol-ВИЧ-1 с высокой эффективностью и специфичностью, а сам процесс определения не требует работы с высокоинфекционным вирусным материалом.

Формула изобретения

1. Полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, полученный в штамме бактерий Escherichia coli ВКПМ N В-5874, трансформированном рекомбинантной плазмидой ДНК рН1106, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий полипептид со следующей аминокислотной последовательностью I (см.стp ) слитый с галактозидазой E.coli, и обладающий способностью связывать антитела к продукту гена polВИЧ-1, с молекулярной массой 145 155 кДа при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле.

2. Фрагмент ДНК Н1106, кодирующий полипептид 1106, полученный с помощью цепной реакции полимеризации с нуклеотидной последовательностью II (см.стp. ) содержащий на 3'-конце стоп-кодон.

3. Рекомбинантная плазмидная ДНК рН1106, кодирующая полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека, размером 7260 п.о. содержащая; Bam HI-PstI фрагмент ДНК вектора pEL5C, включающий ген bгалактозидазы E. coli, размером 6400 п.о.

PstI-BamHI фрагмент ДНК Н1106, кодирующий полипептид 1106, размером 860 п.о.

по одному участку расщепления рестриктазами BamHI, PstI, Sma III, промотор бактериофага лямбда cro LacZ, генетические маркеры: Ampr ген устойчивости к ампициллину.

4. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5874 продуцент полипептида 1106, предназначенного для определения антител к вирусу иммунодефицита человека 1-го типа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2