Питательная среда для индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза

Питательная среда для индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза

Реферат

 

Использование: ветеринария и медицинская микробиология. Сущность изобретения заключается в том, что в питательную среду в качестве белковой основы /источника аминного, общего азота/ вводится ферментативный гидролизат из отходов производства мясокомбината /плацентарно-эмбрионально-маточных тканей от коров и свиней как в отдельности, так и в виде их смеси/ при следующем соотношении ингредиентов, мас. %: гидролизат плацентарно-эмибрионально-маточных тканей 0,60 - 0,90, магний сернокислый 0,014 - 0,020, натрий лимоннокислый 0,30 - 0,036, квасцы железоаммиачные 0,0015-0,0025, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,57 - 0,77, аммоний лимоннокислый однозамещенный 0,14 - 0,20, натрия глутаминовокислый однозамещенный 0,28 - 0,38, глицерин 0,52 - 0,82, малахитовая зелень 0,015 - 0,25, агар 1,0 - 1,4, крахмал нерастворимый 0,3 - 0,5, вода дистиллированная - остальное. 5 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики туберкулеза животных.

Актуальность проблемы заключается в том, что туберкулез животных, особенно крупного рогатого скота, широко распространен как в нашей стране, так и за рубежом. Его диагностика сложна особенно в начале заболевания, когда туберкулезные очаги не обнаруживаются на секции из-за их малой величины или когда туберкулез вызван возбудителем человеческого вида. В этом отношении выделение культуры возбудителя болезни является основной для заключения о наличии туберкулезного процесса в организме животного.

В бактериологической практике для диагностики туберкулеза используют плотные яичные среды: Левенштейна-Иенсена, Гельберга, Петраньяни, Финна-2 и Мордовского. Из них среды Левенштейна-Иенсена и Финна-2 рассматриваются в качестве прототипа /Kабораторные исследования в ветеринарии, М. 1971, с. 89-91; Наставление по диагностике туберкулеза животных, М. 1981; Проект "Методических указаний по диагностике туберкулеза животных", М. ГУВ с государственной инспекцией, 09.08.91 г. N 043-11/509/.

Недостатком вышеуказанных сред является использование в них дефицитного пищевого сырья куриных яиц, следовательно, дороговизна.

Целью изобретения является разработка питательной среды для индикации и дифференциации возбудителя туберкулеза у крупного рогатого скота, удешевление питательной среды и расширение сырьевой базы для приготовления основы питательной среды.

Постановленная цель достигается путем применения в качестве основы питательной среды ферментативного гидролизата из плацентарно-эмбрионально- маточных тканей /отходов производства мясокомбинатов/ убитых коров и свиней.

В питательную среду для выращивания микобактерий гидролизат из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей /ГПЭМ/ стельных коров и свиней /в отдельности или вместе взятых/ вводится при следующем оптимальном соотношении ингредиентов, мас.

Гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточной /сухой остаток 0-10%/ 0,75 Магний сернокислый 0,017 Натрий лимоннокислый 0,0033 Квасцы железоаммиачные 0,002 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,67 Аммоний лимоннокислый однозамещенный 0,17 Натрий глутаминовокислый однозамещенный 0,33 Глицерин 0,67 Малахитовая зелень /добавляют в виде 2%-ного водного раствора/ 0,02 Агар 1,2 Крахмал нерастворимый 0,4 Вода дистиллированная Остальное Приготовление среды: заранее готовится стерильный солевой раствор по аналогии с солевым раствором в среде Финна-2 /компоненты 2 8/. К 34 мл солевого раствора добавляется 0,75 г сухого гидролизата плацентарно-эмбрионально-маточных тканей и дистиллированной воды до 100 мл. pH среды доводится до 7,1. Среду кипятят в присутствии агара /1, 2/, крахмала нерастворимого /0,4 г/, 2% -ного раствора малахитовой зелени /1,0 мл/, разливают в пробирки и скашивают. Стерилизацию проводят при 85^oC дважды по 1 ч.

Предлагаемый гилролизат, являясь продуктом глубокого расщепления белков, содержит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме микобактерий.

Заявленное техническое решение соответствует критерию "изобретательский уровень" ввиду того, что впервые для индикации микобактерий и диагностики туберкулеза используется гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточных тканей убойных коров и свиноматок в составе солевых растворов селективных питательных сред для культивирования микобактерий.

Существенным отличием предлагаемого технического решения является: возможность использования предлагаемой среды для ускоренной дифференциации возбудителя туберкулеза бычьего вида от человеческого /запаздывает рост последнего на 18-25 дней/; замена дорогостоящего пищевого продукта куриных яиц дешевым, легко доступным гидролизатом плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и свиноматок в отдельности или в виде их смеси.

В результате этого достигается: индикация и дифференциация возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого видов; удешевление питательной среды; расширение сырьевой базы для ее изготовления.

Примеры по разработке питательной среды Пример 1. Гидролизат плецентарно-эмбрионально-маточный готовят следующим образом: ткани плаценты, матки, мягких тканей эмбриона, полученные на мясокомбинате при убое животных, подвергают ферментативному гидролизу. Для этого ткани пропускают через мясорубку и заливают кипящей водой из расчета 1:1,5, перемешивают, подщелачивают 20%-ным раствором едкого натра до pH 8,0, подогревают до 70^oC и охлаждают до 40-45^oC. Смесь переливают в бутыль с притертой пробкой, добавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу из расчета 150 г на 1 кг плацентарно-эмбрионально-маточных тканей или 15 г сухого панкреатина с активностью 55 ЕД хорошо размешивают /pH 8,0/, приливают 2% по отношению к воде хлороформа, бутыль герметично закрывают и энергично встряхивают. Гидролиз ведут при периодическом перемешивании 3-4 сут. при 43^oC, поддерживая pH смеси на уровне 7,4 7,6. По окончании гидролиза гидролизат выливают в емкость из нержавеющей стали, при pH 5,0, отстаивают, фильтруют, стерилизуют, подвергают лиофильному высушиванию.

Готовый продукт должен соответствовать биохимическим показателям, отраженным в табл. 2, из которой видно, что гидролизаты из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и свиней мало отличаются друг от друга.

Пример 2. Для сравнительного изучения ростовых свойств известных и предлагаемой питательной сред были использованы среды Левенштейна-Иенсена, Финна-2 и по их аналогии среды, где яичный белок был заменен плацентарно-эмбрионально-маточным гидролизатом. Опыты проводились в трехкратной повторности.

Были испытаны культуры трех референтных штаммов возбудителей туберкулеза: M. bovis штамм N 8, M.bovis штамм N 14, M.tuberculosis штамм Dt/st и 4 культуры атипичных микобактерий по одному представителю из каждой группы по классификации Раниона: M.Kansasii N 11-pH, M.Scrofulaceum N 128, M.intracellulase N 13 N и M.fortnitum N 342, полученные из ВГНКИ ветеринарных препаратов, а также 4 полевых штамма микобактерий, выделенных из органов больных туберкулезом животных, принадлежащих совхозам "Красный Маяк", Кам. Устьинский" и колхозу "Искра" Республики Татарстан и колхозу "Новая жизнь" Пензенской области.

Для приготовления микробных взвесей 2-4-недельные культуры вирулентных и атипичных микобактерий, приобретенных во ВГНКИ, и полевых штаммов /табл. 4, 5/ смывали солевым раствором, входящим в состав питательных сред, используемых в опыте, доводили взвесь до 1 мг бактерийной массы в 1 мл по оптическому стандарту мутности БЦЖ. После этого содержимое доводили до 5 мл солевым раствором.

Суспензию каждого штамма микобактерий высевали по 0,2 мл в пробирки с предлагаемой и известными средами. Учет результатов роста колоний микобактерий проводили в течение 30 дней через каждые 72 ч инкубации посевов при 37^oC в термостате.

Результаты экспериментальных исследований при разном соотношении компонентов питательной среды на основе ГПЭМ, представленных в табл. 3 и 4, показывают наиболее оптимальный вариант ее по рецептуре III, на которой при испытании 3 вирулентных и 4 атипичных штаммов микобактерий установлен наилучший их рост. Одновременно определены граничные концентрации компонентов по составу предложенной среды. Предложенная питательная среда на основе гидролиза плацентарно-эмбрионально-маточных тканей при оптимальных концентрациях компонентов по своим ростовым свойствам не уступает составам питательных сред по прототипу.

Пример 3. Для определения диагностической эффективности оптимального состава предлагаемой среды /по прописи III/ в сравнении с прототипами по количеству выделенных культур и возможности их дифференциации исследовались культуры микобактерий бычьего и человеческого видов, патологический материал от телят, экспериментально зараженных возбудителями туберкулеза, биоматериал от коров, реагирующих на внутрикожное введение туберкулина, их неблагополучных по туберкулезу хозяйств /совхозы "Красный Маяк", "Камско-Устьинский", колхоз "Искра" Камско-Устьинского района Республики Татарстан, колхоз "Новая жизнь" Мало-Сердобинского района Пензенской области/. Эффективность питательных сред определялось по количеству выделенных культур микобактерий и определения сроков первичного обнаружения их колоний в процентах и количеству исследованных проб /лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные, портальный, предлопаточные, надвымянные, коленной складки, брыжеечные/.

Результаты исследований свидетельствуют, что предлагаемая среда позволяет проводить достоверную дифференциацию M.bovis от M.tuberculosis /табл. 4/ и она по эффективности превосходит известную среду на 3,75-6,87% /табл. 5/.

Технико-экономическая эффективность данного предложения заключается в следующем: повышается диагностическая эффективность и возможность дифференциации M. bovis от M.tuberculosis/ в сравнительно короткие сроки с минимальным экономическими затратами/ и по количеству выделенных культур возбудителей туберкулеза из биоматериала /3,75 6,87%/; расширяется сырьевая база непищевого белка для изготовления питательной основы среды с использованием отходов производства мясокомбинатов, годовой объем которых только на одном мясокомбинате /г. Казань/ составляет 40-50 т; в резком снижении стоимости /более 1000 раз/ основы питательной среды в сравнении с общепринятыми в микробиологической практике средами для выращивания микобактерий /Левенштейна-Иенсена, Финна-2, Гельберга, Петраньяни и др. / и экономии дефицитного пищевого продукта /куриных яиц/.

Все сказанное обусловливает возможность промышленного изготовления для нужд бактериологических лабораторий основы питательной среды в лиофилизированном состоянии для индикации микобактерий.

Формула изобретения

Питательная среда для индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза, содержащая питательную основу продукт белкового происхождения, агар, глицерин, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, квасцы железоаммиачные, калий фосфорнокислый однозамещенный, аммоний лимоннокислый однозамещенный, натрий глутаминовокислый однозамещенный, крахмал нерастворимый, малахитовую зелень и воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы белкового происхождения она содержит ферментативный гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и/или свиней при следующем соотношении компонентов, мас.

Ферментативный гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и/или свиней 0,6 0,9 Магний сернокислый 0,014 0,020 Натрий лимоннокислый 0,030 0,036 Квасцы железоаммиачные 0,0015 0,0025 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,57 0,77 Аммоний лимоннокислый однозамещенный 0,14 0,20 Натрий глутаминовокислый однозамещенный 0,28 0,38 Глицерин 0,52 0,82 Малахитовая зелень 0,015 0,025 Агар 1,0 1,4 Крахмал нерастворимый 0,3 0,5 Вода дистиллированная Остальное-

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4