Производные пептидов и способ их получения

Производные пептидов и способ их получения

Реферат

 

Использование: в медицине и биологии, в частности в способе получения производных пептидов. Сущность изобретения: продукт - производные пептидов ф-лы 1: A-Ile-Y-Phe-B, где А - Н, HVal, Hser-X-Val, Glp-Pro-Pro-Gly-Glg-Ser-X-Val: B - OH, Arg-OH: X-Lys. Arg: Y - Leu, Tle. Реагент 1: С-концевая аминокислота. Условия реакции: 1) проведение последовательного наращивания пептидной цепи с помощью активированных эфиров защищенных по альфа-аминогруппе аминокислот с получением соединений ф-лы 1, где А - Н, HVal, HSer-X-Val, которые подвергают фрагментарной конденсации в присутствии дециклогексилкарбонилимида и исключающей рацемизацию добавки с N-концевым соединением: Glp-Pro-Pro- Gly-Gly-Ser-X-Val; 2) получение производные пептидов ф-лы: A-Ile-Y-Phe-OH, где A - Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-X-Val, ведут последовательным наращиванием пептидной цепи, начиная с С-конца фрагмента, до получения N-концевого пентапептида: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly, дипептида Ser-Arg и С-концевого тетрапептида: Val-Ile-Leu-Phe, с проведением конденсации полученных фрагментов последовательным присоединением к названному N-концевому пентапептиду дипептида Ser-Arg c помощью дециклогексилкарбонилимида в присутствии исключающей рацемизацию добавки и присоединения к полученному гексапептиду Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser - Arg, С-концевого тетрапептида Val-Ile-Leu-Phe с помощью дифенилфосфорилазида. 3 с. и 4 з.п.ф-лы, 13 табл.

Изобретение касается биоорганической химии, конкретнее химии пептидов, а еще конкретнее изобретение относится к биологически активным структурным аналогам природного пептида, выделенного из Hydra attenuata и способа получения таких аналогов.

Изобретение может найти применение при создании новых высокоэффективных лекарственных препаратов.

В настоящее время установлено, что в мозговой ткани примитивных хордовых животных представлено более десятка пептидов, идентичных нейропептидам мозга человека. Активное изучение таких пептидов имеет практическое значение, так как выявление специфических функций филогенетически древних пептидов у высших животных может служить основой для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов.

Одним из известных филогенетически древних пептидов является природный пептид, выделенный из Hydra attenuata. Это вещество представляет собой ундекапептид с молекулярной массой 1124 Да и аминокислотной последовательностью Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe-OH.

В организме Hydra attenuata названный пептид является фактором роста и дифференцировки тканей и активизирует регенерацию головного конца ее тела.

Пептид идентичной аминокислотной последовательности был обнаружен в плазме крови млекопитающих, в том числе человека; полагают что названный пептид может действовать как ростовой фактор в нормальном развитии высших животных и человека, а также может регулировать функции организма при различных патологических состояниях.

Для проведения исследований по уточнению биологических функций названного ундекапетида, выделенного из Hydra attenuata, требуются значительные количества этого вещества, которые можно получить только путем химического синтеза, Природных аналогов данного пептида не выявлено, а все синтезированные аналоги не обладают биологической активностью свойственной природному пептиду.

Путем химического синтеза были получены следующие пептиды [1] (1) Сlp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe-OH (2) H-Tyr-Cln-Pro-Pro-Cly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe-OH (3) Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Pro-Val-Ile-Leu-Phe-OH.

Синтез проводили твердофазным методом, в качестве защитной группы для -аминофункции использовали a,-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонильную группу, для блокирования e-аминогруппы лизина использовали бензилоксикарбонильную защиту, для защиты гидроксильной группы арина и тирозина использовали третбутильную группу, 4,4-диметоксибензилгидрильную защитную группу использовали в случае глутамина.

После снятия со смолы с помощью НВr в трифторуксусной кислоте и последующей очистки на сефедексе LH-20 были получены пептиды: (1) с выходом 18% (2) с выходом 47% и (3) с выходом 33% Полученные соединения элюировались одним пиком в условиях высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при этом время выхода пептида (1) совпадают с временем выхода нативного пептида. Совместная хроматография этих двух пептидов, синтетического и нативного, также давала один пик.

Из трех синтезированных пептидов только пептид (1) проявляет биологическую активность, идентичную природному активатору роста.

Удаление одной аминокислоты из последовательности (1), например, глицина или пролина, замена N-концевого остатка пироглутаминовой кислоты на глутаминовую кислоту или глутамин, введение одной дополнительной аминокислоты тирозина на N-конец или пролина между лизином и валином все это приводит к потере биологической активности получаемого пептида. Побочные продукты, присутствующие в реакционной смеси, представляющие собой пептиды с аминокислотной последовательностью соединения (1), но с заменой ряда L-аминокислот на их D-изомеры, биологической активностью не обладают.

В основу заявляемого изобретения положена задача создать новые вещества структурные аналоги природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, обладающие биологической активностью, позволяющей применять их как в качестве синтетических стимуляторов процессов регенерации в органах и тканях млекопитающих, так и ингибиторов патологических ростовых процессов в тканях млекопитающих, а также способа получения таких структурных аналогов.

Эта задача решается тем, что биологически активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, согласно изобретению представляет собой пептид следующей аминокислотной последовательности: A-Ile-Y-Phe-B, где A: H-, H-Val-, H-Ser-X-; Glp-Pro- Pro-Gly-Gly-Ser-X-Val-; B: -OH, -Arg-OH; X: -Lys-, -Arg-; Y: -Leu-, -Tle-, благодаря чему проявляет свойства регулятора процессов регенерации и роста тканей, и регулятора эндокринной системы.

Вариант выполнения заявленного изобретения состоит в том, что биологически активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, представляет собой ундекапептид следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH, который проявляет свойства синтетического стимулятора процессов регенерации в органах и тканях.

Другой вариант заявляемого изобретения состоит в том, что биологически активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata представляет собой ундекапептид следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Tle-Phe-OH, который проявляет свойства ингибитора ростовых процессов в тканях млекопитающих.

Другой вариант заявляемого изобретения состоит в том, что биологически-активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata представляет собой гексапептид следующей аминокислотной последовательности: H-Ser-X-Val-Ile-Leu-Phe-OH, X: -Lys-, -Arg-, который проявляет свойства стимулятора процессов регенерации.

Вариант выполнения заявляемого изобретения состоит в том, что биологически активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata представляет собой тетрапептид следующей аминокислотной последовательности: H-Val-Ile-Y-Phe-OH, Y: -Leu-, который проявляет свойства стимулятора процессов регенерации.

Вариант выполнения заявляемого изобретения состоит в том, что биологически активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, представляет собой пептид следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Lle-Phe-Arg-OH или следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Lle-Phe-Arg-OH, которые обладают свойством стимулировать процессы регенерации в органах и тканях.

В соответствии с заявляемым изобретением целесообразно биологически активные структурные аналоги природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, получать способом, включающим последовательное наращивание пептидной цепи с С-конца аминокислотной последовательности с помощью активированного эфира аминокислоты, защищенной по альфа-аминогруппе, в котором, согласно изобретению, последовательное наращивание пептидной цепи осуществляют до получения пептида: A-Ile-Y-Phe-B где A: H-, H-Val, H-Ser-X; B: -OH, -Arg-OH; X: -Lys-, -Arg-; Y: -Leu, -Tle-, после чего осуществляют фрагментную конденсацию с помощью дициклогексилкарбодиимида в присутствии добавки, исключающей рацемизацию, до получения пептида следующей последовательности: A-Ile-Y-Phe-B, где A: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-X-Val-, В, Х и Y имеют вышеуказанные значения.

В соответствии с заявляемым изобретением, целесообразно при получении пептида следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH или Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Tle-Phe-OH или Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Lle-Phe-Arg-OH или Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Lle-Phe-Arg-OH, использовать способ, в котором последовательное наращивание пептидной цепи осуществляют до получения N-концевого пентапептида следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly- и С-концевого гексапептида со следующей аминокислотной последовательностью: Ser-X-Val-Ile-Y-Phe-В, Х: -Lys-, -Arg-; Y: -Leu-, -Tle-; B: -OH, -Arg-OH.

В соответствии с заявляемым изобретением, целесообразно при получении пептида следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH использовать способ, в котором последовательное наращивание пептидной цепи осуществляют до получения N-концевого пентапептида следующей аминокислотной последовательности Glp-Pro-Pro-Gly-Gly, дипептида Ser-Arg и С-концевого тетрапептида Val-Ile-Leu-Phe, а конденсацию полученных пептидных фрагментов осуществляют путем последовательного присоединения к названному N-концевому пентапептиду дипептида Ser-Arg с помощью дициклогексилкарбодиимида в присутствии добавки, исключающей рацимизацию, и присоединения к полученному N-концевому гептапептиду Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg C-концевого тетрапептида Val-Ile-Leu-Phe с помощью дифенилфосфорилазида.

Дальнейшие цели и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания биологически-активных структурных аналогов природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, способ их получения, примеров на конкретные заявляемые соединения и экспериментальные испытания заявляемых соединений.

В соответствии с заявляемым изобретением предлагается биологически активный структурный аналог природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, представляющий собой пептид следующей аминокислотной последовательности: A-Ile-Y-Phe-B, где A: H-, H-Val-; H-Ser-X; Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-X-Val; X: -Lys-, -Arg-; Y: -Leu-, -Tle-; B: -OH, -Arg-OH.

Структура заявляемого соединения подтверждена данными аминокислотного анализа, ¹Н -ЯМР-спектроскопии и масс-спектроскопии.

Получаемые соединения охарактеризованы величиной удельного вращения []²_D², температурой плавления, данными тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Заявляемые пептидные соединения получают классическими методами пептидной химии в растворе с использованием, в случае необходимости, фрагментной конденсации.

Так, например, при получении ундекапептида с следующей аминокислотной последовательностью: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH или ундекапептида со следующей аминокислотной последовательностью: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Tle-Phe-OH, или пептида со следующей аминокислотной последовательностью: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Lle-Phe-Arg-OH или пептида со следующей аминокислотной последовательностью Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Lle-Phe-Arg-OH, осуществляют последовательное наращивание пептидной цепи с С-конца аминокислотной последовательности фрагмента до получения N-концевого пентапептида следующей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly и С-концевого пептида со следующей аминокислотной последовательностью: Ser-X-Val-Ile-Y-Phe-B, где Х: -Lys-; -Arg-; Y: -Leu-, -Tle-; B: -OH; -Arg-OH.

Наращивание пептидной цепи осуществляют с помощью активированного эфира аминокислоты, защищенной по альфа-аминогруппе, например, n-нитрофенилового эфира, пентахлорфенилового эфира, N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира карбобензоксиаминокислоты.

Следующей стадией получения названных ундекапептидов является конденсация полученных при последовательном наращивании пептидной цепи фрагментов до образования целевого продукта, при этом конденсацию осуществляют с помощью дициклогексилкарбодимида в присутствии добавки, исключающей рацимизацию, например, в присутствии N-окси-5-норбонен-2,3- дикарбоксиимида.

При последовательном наращивании пептидной цепи в соответствии с указанной методикой избыток активированного эфира и выделившийся в результате реакции n-нитрофенол либо НОРср или НОNВ удаляют с помощью растворителя, в котором основной продукт реакции не растворим, то есть переосаждением. В ряде случаев, когда растворимость целевого продукта и п-нитрофенола была близкой, например С-концевые ди- и три-пептиды, п-нитрофенол удаляют обработкой амберитом IRA-410 в ОН-форме, контролируя процесс с помощью ТСХ.

Выбор комбинации защитных групп во многом определяет условия дальнейшего синтеза. Например, использование N-защитных групп уретанового типа независимо от метода конденсации уменьшает вероятность рацемизации. Установлено, что при ступенчатом наращивании пептидной цепи с С-конца методом активированных эфиров и использовании при этом защит уретанового типа конденсации не сопровождаются рацемизацией.

Выбор комбинации защитных групп зависит, в свою очередь, от конкретной аминокислотной последовательности и определяется возможностью селективного деблокирования временных и постоянных защитных групп. Поскольку в структурных аналогах природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, отсутствуют серосодержание аминокислоты, в качестве временной защитной группы выбрана бензилоксикарбонильная группа, отщепляемая гидрогенолизом, в качестве постоянных защитных групп при этом используют группы третбутильного типа, устойчивые к гидрогенолизу и отщепляемые ацидолизом. Эту комбинацию защитных групп используют при проведении синтеза фрагментов по вышеуказанной методике: в качестве временной защиты -аминогруппы используют бензилоксикарбонильную защитную группу (Z), для постоянного блокирования e-аминогруппы лизина используют трет-бутилоксикарбонильную защитную группу (Вос), фенилалнин вводят в реакцию в виде трет-бутилового эфира, для защиты гидроксильной функции серина используют трет-бутильную группу.

Применение метода активированных эфиров в ступенчатом синтезе позволяет обеспечивать минимальную защиту функциональных групп. Так карбоксильную группу С-концевого глицина при синтезе фрагмента Glp-Pro-Pro-Gly-Gly защищают солеобразованием, гидроксильную группу серина при синтезе пептидов Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Tle-Phe-OH и Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe-Arg-OH оставляют незащищенной, а в остальных случаях применяют трет-бутильную защиту.

При получении пептидов с Arg в 7 положении, то есть Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-Arg-OH на стадии присоединения аргинина используют п-нитрофениловый эфир трикарбо бензокси аргинина, а далее пептиды, содержащие аргинин, вводят в реакцию с незащищенной гуанидиновой группой.

Отщепление защитных Z-групп на промежуточных стадиях проводят с помощью каталитического гидрогенолиза. В качестве катализатора используют 10% палладий на активированном угле.

При синтезе пептидов с С-концевым аргинином, аргинин вводили в реакцию без защиты гуанидиновой и карбоксильной групп, что значииельно упрощало весь процесс синтеза, поскольку исключались трудоемкие стадии введения и удаления соответствующих защитных групп.

На стадии выделения N-защищенных пептидов со свободным С-концевым аргинином был использован метод очистки, позволяющий избежать многократных переосаждений, трудностей, связанных с близкой растворимостью защищенных и свободных аргининсодержащих пептидов. Этот метод очистки представляет собой хроматографию на силикагеле в системе хлороформ-метанол (этанол) и состоит в использовании специфической сорбции на силикагеле пептидов, содержащих на С-конце свободный аргинин.

Все конденсации фрагментов, содержащих С-концевой свободный аргинин, проводят с предактивацией N-концевого пентапептида, переведением его в N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксидиимидный либо в пентафторфениловый эфир, который сразу же после выделения вводят в реакцию конденсации.

Конечные продукты, получаемые после удаления защитных групп ацидолитическим расщеплением бромистым водородом в трифторуксусной кислоте, либо, в случае отсутствия карбобензокси защитной группы, трифторуксусной кислотой, подвергают очистке методов распределительной хроматографии или методом противоточного распределения с использованием планетной центрифуги. Для очистки, разделения и характеризации пептидов и их фрагментов используют также ВЭЖХ.

Основной проблемой, возникающей при синтезе аналогов названного природного пептида является плохая растворимость С-концевых фрагментов.

Поэтому для получения ундекапептида с аминокислотной последовательностью Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH предлагается альтернативная схема синтеза, при которой разбивка на фрагменты выглядит следующим образом: (Glp-Pro-Pro-Gly-Gly) + (Ser-Arg) + (Val-Ile-Leu-Phe) Преимущество этой схемы синтеза состоит в том, что фрагменты (Ser-Arg) и (Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg), содержащие С-концевой свободный аргинин, можно выделять с помощью очистки на силикагеле описанной выше.

Конденсацию фрагментов (Glp-Pro-Pro-Gly-Gly) и (Ser-Arg) проводят методом активированных эфиров (HONB/DCC) с выделением активированного эфира пентапептида, который сразу же используют для конденсации.

Конечную конденсацию фрагментов (Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg) и (Val-Ile-Leu-Phe) проводят с помощью дифенилфосфорилазида.

При конденсации фрагментов (Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg) и (Val-Ile-Leu-Phe) активируемым фрагментом является N-концевой фрагмент, имеющий свободный аргинин на С-конце. Этот остаток аргинина находится в виде внутренней соли и не нуждается в дополнительной подготовке к активизации добавлением основания в реакционную смесь. Таким образом, проведение конденсации с помощью дифенилфосфорилазида имеет еще одно преимущество: отсутствие избытка основания в реакционной смеси практически исключает возможность рацемизации. Выход на этой стадии составил 98% Идентичность данного пептида пептиду, полученному вышеописанным способом, подтверждена ТСХ, ВЭЖХ и ¹Н-ЯМР методами.

Предложенная схема синтеза может служить основой для разработки крупномасштабной схемы синтеза.

Заявляемые структурные аналоги природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, имеющие следующую аминокислотную последовательность: A-Ile-Y-Phe-B, где A: H-, H-Val-, H-Ser-X-, Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-X-Val; B: -OH; -Arg-OH; X: -Lys-, -Arg-; Y: -Leu-, -Tle-, обладают биологической активностью.

При этом заявляемый структурный аналог, в общей формуле которого У представляет собой остаток -Tie-, обладает свойствами ингибитора ростовых процессов, в том числе патологических процессов в тканях млекопитающих.

Заявляемые структурные аналоги названного природного пептида, в общей формуле которого заместители А, Х и В имеют значения, указанные выше, а У представляет собой остаток -Leu-, обладают способностью стимулировать процесс регенерации, роста и дифференцировки тканей, а также стимулировать функции эндокринной и репродуктивной систем млекопитающих.

Были проведены исследования заявляемого аналога природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, на процессы регенерации на следующих моделях: планарии, личинки мучного хрущака, лягушки, тритоны (регенерация хрусталика), крысы (регенерация печени, регенерация кожных ран).

Исследования проводились на планариях Dugesia tigrina бесполой, лабораторной расе животных. Регенерацию вызывали отсечением передней части планарий с головным ганглием. Сразу после перерезки начинается интенсивная перестройка макроморфологической структуры регенерантов. Идет уменьшение общей площади и длины тела с одновременным ростом площади и длины бластемы. За основной критерий регенерации был принят показатель восстановления исходных пропорций площади тела планарий, в частности отношение площади головной части и всего тела планарии. Это отношение нормируется по соответствующим показателям интактных планарий, и в результате получается безразмерный показатель критерий регенерации К_пл: В_o общая площадь интактной планарии, А_o площадь головной части интактной планарии, В_i общая площадь регенерата на i-й день, А_i площадь бластемы, m число животных в группе. Величина критерия регенерации линейно растет в течение первой недели, а затем темп его роста уменьшается. Анализ динамики пролиферации клеток планарий после перерезки показал ее идентичность с изменением величины критерия регенерации, то есть величина критерия регенерации адекватно отражает процессы регенерации, происходящие в организме.

Специфика планарий как экспериментальной модели состоит в том, что действие заявляемого аналога природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, на данную систему ограничено периодом в несколько часов непосредственно после перерезки (8-24 ч). При инкубировании планарий в растворе заявляемого соединения, через 24 ч после перерезки стимулирующий эффект этого соединения уже отсутствует. Это объясняется тем, что пептид действует непосредственно на клетки раневой поверхности. Вместе с тем, следует отметить, что декапитация планарий приводит к потере 1/4-1/5 части тела, то есть является повреждением на уровне всего организма. Пептид, попавший в организм через раневую поверхность, включается в эндогенную систему регуляции регенерации, что соответствует ситуации однократного введения препарата в организм высших животных.

Для проведения исследований влияния заявляемых структурных аналогов природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, на процесс регенерации необходимо было установить оптимальный интервал концентраций. Сразу после операции планарий помещали в растворы пептида разной концентрации (10^-7- 10^-13 М). Заявляемое соединение стимулировало регенерацию во всех экспериментальных группах животных, однако наибольший эффект пептид показывал при концентрациях 10^-9-10^-11М. Поэтому во всех последующих опытах все соединения использованы в этом интервале концентраций.

Для тестирования процесса регенерации использован метод прижизненной морфометрии регенерации планарий. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Для оценки значимости результатов проводили сравнение средних с помощью t-критерия Стьюдента. Вычисляли отношение арифметической суммы величин критерия регенерации в разные дни опыта под действием природного соединения к аналогичной сумме в контрольной группе, находившейся под действием дистиллированной воды. Это отношение было принято за 100% Соответствующие величины данного отношения для каждого из заявляемых соединений сравнивали с этой величиной и выражали в процентах (% от контроля).

Результаты биологической активности структурных аналогов природного пептида, вы деленного из Hydra attenuata, приведены в табл. 12.

Для излучения влияния заявленных синтезированных пептидов на процессы регенерации у млекопитающих была использована модель полнослойной кожной раны спины у крыс. Эксперимент проводили на 89 крысах-самцах линии Вистар, по 8-9 животных в одной серии. Пептиды вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг в физиологическом растворе 1 раз в день в течение 10 дней. Контрольными служили животные, которым вводили физиологический раствор. В процессе заживления ран оценивали динамику их контракции (сокращения площади ран) и средние сроки полного заживления (ССПЗ). Все результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при p < 0,05. Результаты проведенных исследований показали, что природный пептид, выделенный из Hydra attenuata оказывает существенное ускоряющее влияние на заживление кожных ран. На всех сроках измерения сокращение площади ран достоверно опережало этот процесс у контрольных животных. В этих условиях ССПЗ сократились в среднем на 6,4 дня, что составило 27,8% (p < 0,01).

Заявляемый структурный аналог природного пептида, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH практически не уступает природному пептиду как в ускорении сокращения площади ран, так и уменьшения ССПЗ (на 22,3% по сравнению с контролем).

Таким образом, природный пептид, выделенный из Hydra attenuata и структурный аналог этого природного пептида, представляющий собой соединение следуюдей аминокислотной последовательности: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH являясь высокоактивными стимуляторами регенераторных процессов, могут найти применение в хирургии для лечения вялотекущих и длительно не заживающих ран, а также трофических язв.

Исследовалось влияние заявляемых соединений на анаболические (биосинтетические) процессы, лежащие в основе процессе регенерации. В качестве экспериментальной модели была выбрана регенерирующая печень крыс. Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно, в дозе 20 мкг/кг массы тела животного.

Печень млекопитающих обладает способностью к активному пролиферативному росту в ответ на повреждение. Клетки регенерирующей печени испытывают значительные структурные изменения уже на ранних сроках после повреждения. В основе этих изменений лежат процессы биосинтеза макромолекул РНК, ДНК, белков.

На модели регенерирующей печени были исследованы природный пептид, выделенный из Нydra attenuata, синтезированные пептиды со следующей аминокислотной последовательностью: Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Arg-Val-Ile-Leu-Phe-OH ([Arg⁷]) и Glp-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Tle-Phe-OH ([Tle¹⁰]) Оценку биологической активности синтетических аналогов природного пептида проводили по оказываемому ими влиянию на процесс синтеза ДНК. Результаты исследования приведены в табл. 13.

Интенсивность включения ³Н-тимидина в ДНК в печени частично гепатэктомированных крыс достигает максимума через 22-24 ч после операции. Для биологического тестирования был выбран интервал 18-22 ч.

Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что природный пептид, выделенный из Hydra attenuata, и/или его аргининовый аналог могут найти клиническое применение в качестве препаратов, стимулирующих восстановительные процессы в поврежденных тканях печени. Способность низких доз этих пептидов в высокой степени активировать биосинтетические процессы, лежащие в основе функциональной и пластической регенерации печени, и отсутствие подобных влияний на анаболические процессы в интактной ткани печени дает возможность рассматривать названный природный пептид и его аргининовый аналог как перспективные для дальнейших медицинских исследований вещества.

С помощью радиоиммунологического анализа было определено содержание природного пептида, выделенного из Hydra attenuata, в органах и тканях млекопитающих. Высокое содержание пептида наблюдалось в поджелудочной железе и почке.

Гипоталамическая локализация названного природного пептида позволяет предположить, что он может оказывать влияние на процессы роста и репродуктивную систему. С целью проверки этих предположений было изучено влияние названного природного пептида и его аналогов на рост тела и некоторые гормональные показатели функционирования оси гипоталамус-гипофиз-половые железы. В результате исследования влияния названного природного пептида и его аналогов на эндокринную систему было установлено, что под действием названного пептида происходит ускорение полового созревания крыс. Подтверждением этому является усиление активности ключевых ферментов метаболизма половых стероидных гормонов. Введение названного природного пептида стимулирует прибавку массы тела и активизирует функцию щитовидной железы, что проявляется в изменении ряда морфофункциональных показателей (увеличения размера фоликул, количества тироцитов и др.).

При исследовании влияния аналогов названного пептида на половую и эндокринную системы установлено, что [Arg⁷] ПП обладает явно выраженным стимулирующим эффектом.

Таким образом, названный природный пептид действует как фактор, ускоряющий половое созревание и вызывающий характерные изменения в функционировании системы гипофиз половые железы.

Из полученных результатов биологического тестирования следует, что природный пептид, выделенный из Hydra attenuata, cохраняет свойства фактора регенерации в организмах высших животных и, кроме того, обладает специфическим действием оказывает стимулирующее влияние на эндокринную и репродуктивную системы.

[Arg⁷] ПП является высоко-активным аналогом названного природного пептида и может быть использован в качестве синтетического стимулятора регенераторных процессов.

[Tle¹⁰] ПП является высокоактивным аналогом названного природного пептида и может быть использован в качестве ингибитора патологических ростовых процессов в тканях млекопитающих.

Для лучшего понимания заявляемого изобретения приводятся следующие примеры осуществления способа получения заявляемого соединения.

Индивидуальность соединений, получаемых в нижеследующих примерах, проверяли методом ТСХ на хроматографических пластинках Kieselgel-60 ("Мerck", ФРГ) в системах: хлороформ метанол уксусная кислота, 9:1:0,5(А); хлороформ метанол 32%-ная уксусная кислота, 60:45:20(Б); хлористый метилен метанол 50% -ная уксусная кислота, 90:10:2(В); хлористый метилен метанол 50%-ная уксусная кислота, 14:6:1(Г); этилацетат пиридин уксусная кислота -вода, 45:20:6: 11(Д); н-бутанол уксусная кислота вода, 3:1:1(Е); этилацетат - метанол вода, 5: 2:1(Ж); хлороформ метанол уксусная кислота, 17:4,5:0,6(3); этилацетат гексан, 1: 1(И); н-бутанол уксусная кислота - пиридин вода, 10,5:6:1:7,5(К); хлористый метилен метанол уксусная кислота, 90:10:5(Л); хлороформ метанол -уксусная кислота, 32: 2: 1(М); изопропиловый спирт аммиак конц. 1:1(Н); изопропиловый спирт аммиак конц. 2:1(0); хлороформ метанол аммиак конц. 5:3: 1(П), н-бутанол пиридин аммиак конц. вода, 20:12:3:15(Р).

Растворы веществ в органических растворителях после экстракции и водных промывок сушили над безводным Na₂SO₄ и упаривали в вакууме на роторном испарителе при температуре не выше 40^oС.

Лиофилизацию пептидов проводили из замороженных водных растворов.

Конечные продукты очищали либо методом противоточно-распределительной хроматографии в системе н-бутанол уксусная кислота вода, 4:1:5, стационарная фаза органическая, либо методом обращеннофазной препаративной ВЭЖХ на хроматографе "Gilson" (Франция), с использованием колонки "Silasorb RP-18" (7,5 мкм, 16 х 250 мм) в системе А 0,1% водная трифторуксусная кислота, В ацетонитрил, при скорости потока 10 мл/мин, градиент от О до 60% В за 60 мин.

Анализ пептидов методом ВЭЖХ проводили на хроматографической системе "Gold", фирмы "Beckman", (США) с использованием колонки LC-18-DB (5 мкм, 4,6 х 250 мм), фирмы "Supelco", (США), скорость потока элюента 1 мл/мин. Анализ проводился в следующих системах элюентов: 1. элюент А 0,05% водная трифторуксусная кислота, В ацетонитрил с добавкой 0,05% трифторуксусной кислоты; 2. элюент А 0,02 М фосфатный буфер (рН 3,0), В ацетонитрил.

Были использованы два типа градиента: 1. от 5 до 25% В за 20 мин; 2. от 10 до 50% за 40 мин.

Приведенные температуры плавления (не скорректированы) определяли на нагревательном приборе "Boetius" (ГДР), а удельное оптическое вращение на автоматическом цифровом поляриметре "Perkin-Elmer 241" (США), длина кюветы 1 дм.

Гидролиз пептидов осуществляли в 6 н. НСI при 110^oС в течение 24 ч. Анализ гидролизата проводился либо методом обращеннофазной ВЭЖХ с предколоночной модификацией о-фталевым альдегидом, в этом случае содержание пролина не определялось, либо на аминокислотном анализаторе.

Индивидуальность полученных соединений подтверждена методом протонного магнитного резонанса. Спектры ¹Н-ЯМР получены на спектрометре "WM-50" фирмы "Bruker" (ФРГ) с рабочей частотой 500 мГц, при 37^oС. Oбразцы для измерений готовили растворением 1 мг соединения в 0,5 мл диметилсульфоксида-d₆. Все соединения в ацетатной форме. Химические сдвиги в спектрах ¹Н-ЯМР измерены относительно внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоната натрия. Отнесение сигналов в спектрах сделано с помощью метода двойного резонанса.

Пример 1. Z-Leu-Phe-OBu^t (1).

К раствору 1,29 г (5 ммоль) H-CI H-Phe-PBut в 10 мл DMF добавляли 0,69 мл (5 ммоль) Et₃N. Выпавший осадок отфильтровывали, фильтрат охлаждали до -10^oС и добавляли 1,93 г (5 ммоль) Z-Leu-ONp в 10 мл DMF. Реакционную смесь выдерживали 20 ч при 20^oС. DMF упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали 2% Н₂SO₄, водой. Этилацетатную фракцию упаривали, переупаривали с изопропанолом. Образовавшееся масло растворяли в метаноле и обрабатывали амберлитом IRA-410 в OH^-- форме до исчезновения п-нитрофенола по данным ТСХ. Смолу отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом, фильтрат упаривали и полученное масло сушили в вакууме до постоянного веса. Получено 2,30 г (98%) соединения (1). R_f 0,79 (A), 0,70 (В), 0,65 (М).

Пример 2. H-Leu-Phe-OH (Ia).

468,6 мг (1,00 моль) соединения (Ia), полученного в примере 1, растворяли в 20 мл трифторуксусной кислоты и пропускали ток сухого бромистого водорода в течение 45 мин. Раствор упаривали, остаток растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром. Полученное вещество подвергали ВЭЖХ-очистке. Получено 270 мг (97% ) соединения (Iа), т.пл. 130-132^oС, [a]²_D² + 37,2 (с 1, АсОН), R_f 0,60 (Б), 0,50 (Д), 0,67 (Е). ВЭЖХ: 15,94 мин (сист. 2, град. 1).

Пример 3. Z-Ile-Leu-Phe-OBu^t (II).

2,30 г (4,9 ммоль) соединения (I), аналогичного указанному в примере 1, гидрировали 1,5 ч в 70 мл метанола в присутствии 10% Pd на активированном угле ("Fluka", Швейцария). Отфильтровывали катализатор, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 25 мл DMF. Раствор охлаждали до -10^oС и добавляли 1,73 г (4,6 ммоль) Z-Ile-ONp в 10 мл DMF. Реакционную смесь выдерживали 20 ч при 20^oС. После упаривания остаток растворяли в этилацетате, промывали 2%-ной Н₂SO₄, водой, упаривали с изопропанолом. Полученное масло растворяли в метаноле и обрабатывали амберлитом IRA-410 в ОН^-- форме. Смолу отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Фильтрат упаривали, остаток растворяли в эфире и осаждали гексаном. Получено 2,33 г (87%) соединения (II) с т.пл. 149-150 С, [a]²_D²- 11,5 (с 1, DMF); R_f 0,78 (А), 0,72 (В), 0,95 (Д), 0,57 (М).

Пример 4. Н-Ile-Leu-Phe-OH (IIa).

Исходя из 116 мг (0,20 ммоль) соединения (II), полученного в примере 3, по методике, аналогичной указанной в примере 2, получали 77 мг (98%) соединения (IIa), т. пл. 170-175^oС, [a]²_D²+ 13,3 (с 1, АсОН), R_f 0,74 (Б), 0,55 (Д), 0,72 (Е). ВЭЖХ: 26,39 мин. (сист. 1, град. 1), 21,94 мин (сист. 2, град. 1).

Пример 5. Z-Val-Ile-Leu-Phe-OBu^t (III).

1,75 г (3,00 ммоль) соединения (II), полученного в примере 3, гидрировали в 50 мл метанола в присутствии 10% Pd/C. Отфильтровывали катализатор, фильтрат упаривали, масло растворяли в DMF. Раствор охлаждали до -10^oС и добавляли 1,06 г (2,85 ммоль) Z-Val-ONp в 10 мл DMF. Реакционную смесь выдерживали 20 ч при 20^oС. После упаривания остаток нагревали в этилацетате, образовавшийся аморфный осадок отфильтровывали и промывали на фильтре гексаном. Эту процедуру повторяли дважды. Получено 1,70 г (88%) соединения (III) с т.пл. 220-221^oС, [a]²_D²- 12,7 (c 1, DMF); R_f 0,76 (А), 0,72 (В). 0,45 (М).

Пример 6. H-Val-Ile-Leu-Phe-OH (IIIa).

Исходя из 102 мг (0,15 ммоль) соединения (III), полученного в примере 5, по методике, аналогичной указанной в примере 2, получали 70 мг (95%) соединения (IIIa), т. пл. 175-180^oС, [a]²_D²-11,0 (с 1, АсОН), R_f 0,80 (Б), 0,58 (Д). 0,75 (Е). ВЭЖХ: 29,33 мин (сист. 1, град. 1), 25,20 мин (сист. 2, град. 1).

Пример 7. Z-Lys(Boc)-Val-Ile-Leu-Phe-OBu^t (IV).

1,89 г (2,8 ммоль) соединения (III), полученного в примере 5, гидрировали в 50 мл DMF в присутствии 10% Pd/C. Катализатор отфильтровывали, фильтрат охлаждали до -10^oС и добавляли 1,65 г (3,3 ммоль) Z-Lys(Boc)-ONp в 15 мл DMF. Выдерживали 40 ч при 20^oС. После упаривания растворителя остаток нагревали в этилацетате, образовавшийся аморфный осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 2,40 г (94%) сое